王圣元 張慜 李柱一 趙思佳 楊永祥

重癥肌無力患者外周血AIRE、Tfh細(xì)胞和Tfr細(xì)胞與病情嚴(yán)重性相關(guān)分析

王圣元*張慜*李柱一 趙思佳 楊永祥

目的 探討自身免疫性調(diào)節(jié)因子(AIRE)、濾泡輔助性T(Tfh)細(xì)胞和濾泡調(diào)節(jié)性T(Tfr)細(xì)胞與重癥肌無力(MG)患者病情嚴(yán)重程度的相關(guān)性。方法 收集2015-12—2016-4第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院收治的MG患者22例，根據(jù)臨床表現(xiàn)分為全身型MG(GMG)和眼肌型MG(OMG)；同期選取健康體檢中心查體者10名作為健康對照。收集MG患者詳細(xì)臨床資料，包括美國MG協(xié)會(MGFA)分型及定量MG(QMG)評分。通過流式細(xì)胞術(shù)分析AIRE陽性細(xì)胞比例及Tfh/Tfr比值。結(jié)果 (1)AIRE表達(dá)在各組間比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。GMG組和OMG組AIRE表達(dá)均較對照組降低(P<0.01，P<0.05)，而GMG組與OMG組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。(2)Tfh/Tfr比值在各組間比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。GMG組和OMG組Tfh /Tfr比值均高于對照組(P<0.01，P<0.05)，且GMG組高于OMG組(P<0.05)。(3)MG患者AIRE表達(dá)與MGFA分型及QMG評分呈負(fù)相關(guān)(r=-0.517,P<0.05;r=-0.616，P<0.01)，Tfh/Tfr比值與MGFA分型和QMG評分呈正相關(guān)(r=0.761,r=0.581,均P<0.01)。結(jié)論 AIRE、Tfh/Tfr比值與MG的病情嚴(yán)重程度有一定的相關(guān)性，并可能參與了MG的發(fā)病。

重癥肌無力；自身免疫性調(diào)節(jié)因子；濾泡輔助性T細(xì)胞；濾泡調(diào)節(jié)性T細(xì)胞；Tfh/Tfr比值

重癥肌無力(myasthenia gravis，MG)是常見的自身免疫疾病，其發(fā)病機(jī)制與異常的免疫應(yīng)答相關(guān)，且體液免疫在MG發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用，但抗體激活B細(xì)胞的調(diào)控機(jī)制尚不清楚[1-2]。自身免疫性調(diào)節(jié)因子(autoimmune regulator，AIRE)是一種轉(zhuǎn)錄因子，外周表達(dá)AIRE的細(xì)胞可與CD4+T細(xì)胞相互作用，間接誘導(dǎo)免疫耐受[3]。濾泡輔助性T(T follicular helper，Tfh)細(xì)胞可促使B細(xì)胞形成漿細(xì)胞，產(chǎn)生大量高親和性抗體[4]。濾泡調(diào)節(jié)性T(T follicular regulatory，Tfr)細(xì)胞通過抑制Tfh細(xì)胞功能而發(fā)揮作用，具有Tfh和調(diào)節(jié)性T(Treg)細(xì)胞的雙重特點[5]。近期研究表明，Tfh/Tfr細(xì)胞平衡紊亂可能與MG病情相關(guān)。這種相關(guān)性是否與AIRE的異常有關(guān)尚未見報道。本研究通過檢測MG患者外周血AIRE、Tfh/Tfr細(xì)胞的表達(dá)變化，旨在探討其與MG疾病嚴(yán)重程度的相關(guān)性，為進(jìn)一步研究MG發(fā)病機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。

1 對象和方法

1.1 對象 收集2015-12—2016-04第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院收治的新發(fā)MG患者22例，其中男14例，女8例，年齡20～66歲，平均(45.4±14.8)歲。入組標(biāo)準(zhǔn)包括：(1)符合MG診斷標(biāo)準(zhǔn)：骨骼肌易疲勞(包括咽喉肌和/或延髓肌)；(2)癥狀有波動性，伴明顯晨輕暮重特點；(3)重復(fù)神經(jīng)電刺激(RNES)檢查顯示低頻(3～5 Hz)刺激時衰減達(dá)到或超過10%，單纖維肌電圖檢查結(jié)果顯示間隔時間延長；(4)乙酰膽堿酯酶抑制劑(AChEI)治療有效；(5)首次發(fā)病或病情穩(wěn)定后復(fù)發(fā)的患者；(6)收集血標(biāo)本前半年內(nèi)未予以激素治療、血漿置換或基礎(chǔ)免疫治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)曾使用免疫抑制(如糖皮質(zhì)激素或硫唑嘌呤)、血漿置換或靜脈用免疫球蛋白治療；(2)懷孕或哺乳期；(3)合并其他自身免疫性疾病或炎性疾病。根據(jù)患者不同臨床表現(xiàn)分為全身型MG(GMG)組和眼肌型MG(OMG)組：(1)GMG組：共12例，男女各6例，年齡28～66歲，平均(47.8±12.0)歲；美國重癥肌無力協(xié)會(MGFA)分型：Ⅱb型4例、Ⅲa型2例、Ⅲb型3例、Ⅳ型3例；定量MG(QMG)評分為5～27分，平均(15.33±6.34)分。(2)OMG組：共10例，男8例，女2例，年齡20～61歲，平均(42.5±17.9)歲；MGFA分型：Ⅰ型8例、Ⅱa型1例、Ⅱb型1例；QMG評分為3～12分，平均(6.90±3.41)分。選取作者醫(yī)院健康體檢中心同期查體者10名作為健康對照，其中男6名，女4名，年齡22～64歲，平均(40.7±15.44)歲，對照者各項體檢結(jié)果均正常，無任何免疫疾病病史，6個月內(nèi)未使用過激素或免疫制劑。

1.2 方法

1.2.1 資料收集：使用統(tǒng)一設(shè)計的調(diào)查表收集MG患者及健康對照者的臨床資料。MG患者的臨床資料主要包括姓名、性別、年齡、MGFA分型及QMG評分等。MGFA分型可以客觀評價MG患者所受累的肌群，而QMG評分可量化MG患者在復(fù)視、眼瞼下垂、唇肌、咽喉肌及四肢肌肉受累的嚴(yán)重程度，得分越高病情越重。評估由唐都醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科一名富有臨床經(jīng)驗的主治醫(yī)師進(jìn)行。

1.2.2 AIRE和Tfh/Tfr細(xì)胞比值測定：MG患者于入院時(未接受治療)、對照組于體檢時采集空腹肘靜脈血6 mL分裝兩管，充分搖勻，放置4℃環(huán)境中保存。采用常規(guī)技術(shù)Ficoll-Paque密度離心法分離人外周血單個核細(xì)胞(PBMCs)，將外周血與等量的RPMI-1640混勻，然后緩慢滴入15 mL離心管，4℃下以300g離心20 min，提取PBMCs。隨后使用RMPI-1640洗滌細(xì)胞兩次。重懸細(xì)胞后加入FITC抗人CD4抗體(美國Biolegend)和PE抗人CD185(CXCR5)抗體(美國Biolegend)進(jìn)行表面染色。表面染色后洗滌細(xì)胞，在核內(nèi)染色前加入固定/破膜液(德國MACS)破膜。破膜后洗滌破膜液并進(jìn)行細(xì)胞重懸。分別加入APC抗人AIRE抗體(德國MACS)和AlexaFlour647 抗鼠/人Foxp3抗體(美國Biolegend)充分混勻進(jìn)行核內(nèi)染色。染色后再次洗滌細(xì)胞并加入2%(質(zhì)量濃度)多聚甲醛固定，隨后在流式細(xì)胞儀(BD FACSCalibur系統(tǒng))上進(jìn)行流式細(xì)胞分析。計算Tfh/Tfr細(xì)胞比值和AIRE表達(dá)情況。AIRE以陽性細(xì)胞數(shù)比例表示。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，符合正態(tài)分布的計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組均數(shù)比較(經(jīng)檢驗方差不齊)采用Kruskal-Wallis檢驗，兩兩均數(shù)比較采用Dunn-Bonferroni檢驗。MGFA分型和QMG評分與AIRE表達(dá)及Tfh/Tfr比值間的相關(guān)性采用Spearman相關(guān)檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組AIRE及Tfh/Tfr比值比較 各組間AIRE陽性細(xì)胞比例比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，兩兩比較，GMG組和OMG患者AIRE表達(dá)均較對照組降低(P<0.01，P<0.05)，而GMG組與OMG組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，圖1)。各組間Tfh /Tfr比值比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，兩兩比較，GMG組和OMG組Tfh /Tfr比值均高于對照組(P<0.05，P<0.01)，且GMG組Tfh/Tfr比值高于OMG組(P<0.05，圖2)。

注：GMG：全身型重癥肌無力，OMG：眼肌型重癥肌無力，AIRE：自身免疫性調(diào)節(jié)因子，Tfh/Tfr：濾泡輔助性T細(xì)胞/濾泡調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，PBMCs：外周血單個核細(xì)胞；圖2、表1同。a P<0.01，bP<0.05 圖1 各組PBMCs AIRE表達(dá)比較 圖2 各組PBMCs Tfh/Tfr比值比較

2.2 AIRE和Tfh/Tfr比值與病情嚴(yán)重程度相關(guān)性 22例MG患者AIRE表達(dá)與MGFA分型及QMG評分均呈明顯負(fù)相關(guān)，而Tfh/Tfr比值與MGFA分型和QMG評分呈明顯正相關(guān)(表1)。為排除干擾因素，進(jìn)行AIRE與年齡、Tfh/Tfr比值與年齡、MGFA分型及QMG評分與年齡進(jìn)行相關(guān)性分析，均未發(fā)現(xiàn)具有明顯相關(guān)性(r=0.197，P=0.379；r=-0.154，P=0.495；r=0.048，P=0.832；r=-0.079，P=0.728)。

表1 MG患者AIRE陽性細(xì)胞及Tfh/Tfr比值與病情嚴(yán)重程度的相關(guān)性分析

3 討論

MG曾被認(rèn)為是細(xì)胞免疫依賴、補(bǔ)體參與的神經(jīng)系統(tǒng)自身免疫性疾病。但乙酰膽堿受體抗體的檢出，使體液免疫在MG發(fā)病中的作用得到關(guān)注[6]。此時，抗體的產(chǎn)生途徑成為進(jìn)一步研究的熱點。胸腺生發(fā)中心(GC)的發(fā)現(xiàn)對MG的研究意義重大，源于GC的Tfh細(xì)胞是輔助B細(xì)胞遷移、增殖、分化為漿細(xì)胞并產(chǎn)生高親和力抗體的主要效應(yīng)T細(xì)胞，在免疫調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮“核心”作用[7-8]。而Tfr細(xì)胞作為Treg細(xì)胞的特殊亞群，同時擁有Tfh細(xì)胞和Treg細(xì)胞的表型特征，并且Tfr細(xì)胞可以遷移到GC并抑制Tfh細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞活化和抗體的產(chǎn)生[9-10]。本研究結(jié)果顯示，MG病情與AIRE表達(dá)、Tfh/Tfr比值有一定的相關(guān)性，一定程度上提示AIRE、Tfh、Tfr細(xì)胞的異常與MG抗體的產(chǎn)生有一定的聯(lián)系。

在中樞免疫系統(tǒng)，AIRE主要存在于胸腺并參與對自反應(yīng)T細(xì)胞的清除過程；而在外周免疫系統(tǒng)，AIRE主要參與抗原的識別或通過對抗原的修飾及抗原遞呈，維持免疫系統(tǒng)的穩(wěn)定[11-12]。研究結(jié)果表明，AIRE表達(dá)在GMG組及OMG組均明顯低于對照組，且AIRE的表達(dá)與MG癥狀嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)，可推測AIRE的低表達(dá)有可能與MG臨床癥狀嚴(yán)重程度相關(guān)。

研究發(fā)現(xiàn)，Tfh/Tfr比值在GMG組最高，其次是OMG組，最低的是對照組。此外，MG患者的Tfh/Tfr比值均與MGFA分型和QMG評分呈正相關(guān)。MG患者GC的形成，致使Tfh細(xì)胞有了生存的場所；而Tfr細(xì)胞有與Tfh細(xì)胞相同的部分，如均產(chǎn)生于GC，高表達(dá)CD4+、CXCR5+，但其具有自身的特殊性：表達(dá)Foxp3，與傳統(tǒng)Treg細(xì)胞一樣產(chǎn)生抑制能力的細(xì)胞因子，且其轉(zhuǎn)錄信號特點較接近于Treg細(xì)胞，功能是限制Tfh細(xì)胞提供的“幫助”，從而保持一種細(xì)胞免疫內(nèi)部的相對平衡[13]。任何破壞這種平衡而產(chǎn)生的異常或無序Tfh /Tfr比值，都會導(dǎo)致免疫內(nèi)部的紊亂，其結(jié)果是抗體過度生成，從而導(dǎo)致MG的發(fā)展。本研究結(jié)果提示，Tfh細(xì)胞自身可能存在生成增多，同時其調(diào)節(jié)細(xì)胞——Tfr細(xì)胞減少，致使Tfh/Tfr比值過度增加，免疫紊亂呈現(xiàn)一種惡性循環(huán)狀態(tài)，間接導(dǎo)致MG的發(fā)展。同時，AIRE的實驗結(jié)果與病情嚴(yán)重程度呈明顯負(fù)相關(guān)，考慮到AIRE在外周血的作用可能在抗原的識別或通過對抗原的修飾及抗原遞呈，即免疫啟動階段；而Tfh或Tfr細(xì)胞與抗體產(chǎn)生的機(jī)制有關(guān)，即主要免疫過程；因而AIRE與Tfh及Tfr細(xì)胞失衡可能存在一定的因果聯(lián)系。

雖然AIRE、Tfh和Tfr細(xì)胞很多特性仍不清楚，但本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其可能參與外周血MG的發(fā)病，并可能對自身抗體的調(diào)控起到關(guān)鍵作用。AIRE與MG病情嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)，而Tfh/Tfr比值與之呈正相關(guān)，提示可能在外周的免疫系統(tǒng)中存在AIRE和Tfh、Tfr細(xì)胞之間相互作用的機(jī)制，而這些機(jī)制可能與Tfh及Tfr細(xì)胞成熟過程的細(xì)胞因子的調(diào)控相關(guān)，所有這些，尚需進(jìn)一步的實驗研究來證實。

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(本文編輯：時秋寬)

The correlation between the expression of AIRE, Tfh and Tfr cells and clinical severity in myasthenia gravis patients

WANGShengyuan*，ZHANGMin*，LIZhuyi#，ZHAOSijia，YANGYongxiang.

#DepartmentofNeurology，TangduHospital，F(xiàn)ourthMilitaryMedicalUniversity，Xi’anShaanxi710038，China*These authors contribute equally to this work

Corresponding author：LI Zhuyi，Email：lizhuyi@fmmu.edu.cn

Objective To explore the correlation between the expression of autoimmune regulator (AIRE), T follicular helper (Tfh), T follicular regulatory (Tfr) cells and clinical severity in myasthenia gravis (MG) patients. Methods Clinical data of 22 MG patients were collected at the Department of Neurology, Tangdu Hospital of Fourth Military Medical University from December 2015 to April 2016. The patients were divided into a generalised MG (GMG) group and an ocular MG (OMG) group; at the same time 10 volunteers were chosen as healthy controls from physical examination center. Detailed clinical information of MG patients was collected by questionnaires, including Myasthenia Gravis Foundation of America (MGFA) clinical classification and quantitative Myasthenia Gravis (QMG) score. The ratios of AIRE, Tfh and Tfr cells were measured by flow cytometry. Results (1)The difference of AIRE expression among all the three groups was significant (P<0.01). The expression of AIRE was lower in the GMG group and the OMG group, compared with the control group (P<0.01,P<0.05); but between the GMG group and the OMG group, there was no significant difference (P>0.05). (2)The difference among all the three groups in ratios of Tfh/Tfr was significant (P<0.01). The ratios of Tfh/Tfr were higher in the GMG group and the OMG groups than the control group (P<0.01，P<0.05),and higher in the GMG group than the OMG group (P<0.05). (3)The expression of AIRE showed a significantly negative correlation with MGFA classification and QMG score in all the 22 MG patients (P<0.05,P<0.01). Meanwhile, the ratio of Tfh/Tfr had a positive correlation with MGFA classification and QMG score in all the MG patients (bothP<0.01). Conclusions AIRE and Tfh/Tfr might have a relationship with the severity of MG and might participate in the pathogenesis of MG.

myasthenia gravis；AIRE；follicular helper T cell；follicular regulatory T cell；Tfh/Tfr

10.3969/j.issn.1006-2963.2017.03.005

國家自然科學(xué)基金資助項目 (81301069)

710038 第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科

*這些作者對本文具有同等貢獻(xiàn)

李柱一，Email:lizhuyi@fmmu.edu.cn

R746.1

A

1006-2963(2017)03-0170-04

2017-2-27)