楊彪+肖純凌

[摘要]目的 建立一套新型易操作的大、小鼠肺泡灌洗新方法。方法 依靠小鼠灌胃針和電泳點樣吸頭為工具，建立一套新型的大、小鼠肺泡灌洗操作系統(tǒng)。分別使用10 ml或1 ml的無菌注射器配合插管工具完成肺泡灌洗操作。研究中對10只雄性Wistar大鼠（體重220～250 g）和10只雄性CB17-SCID小鼠（體重24～28 g）進行插管和肺泡灌洗液收集。結果 共完成20次大、小鼠的插管和肺泡灌洗操作，成功收集到1×107個大鼠肺泡巨噬細胞和3×106個小鼠肺泡巨噬細胞。結論 應用小鼠灌胃針和電泳點樣吸頭完成的收集大、小鼠肺泡灌洗液新方法，能夠被廣泛用于大、小鼠呼吸系統(tǒng)疾病模型的研究。

[關鍵詞]實驗技術；小鼠灌胃器；電泳點樣吸頭；大鼠；小鼠

[中圖分類號] R332 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2016）12（b）-0132-03

A new method of alveolar lavage in rat and mouse set up applying mouse stomach needle and point sample suction head

YANG Biao1 XIAO Chun-ling2

1.Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Shenyang 110032，China；2.Key Lab of Environmental Pollution and Microecology，Shenyang Medical College in Liaoning Province，Shenyang 110034，China

[Abstract]Objective To develop a new method for easy rat and mouse alveolar lavage.Methods Mouse stomach needle and electrophoresis point sample suction head applied to develop a new alveolar lavage operation system in rat and mouse.Sterile syringe of 10 ml or 1 ml was used respectively to complete the alveolar lavage with the intubation tool.Ten male Wistar rats （weight was 220-250 g） and ten male CB17-SCID mice （weight was 24-28 g） were performed for intubation and alveolar lavage fluid collection.Results 20 times of intubation and alveolar lavage operation were completed.1×107 alveolar macrophages from rat and 3×106 alveolar macrophages from mouse were successfully collected.Conclusion A new method of alveolar lavage in rat and mouse set up applying mouse stomach needle and point sample suction head can be widely used in the study of respiratory disease model in rat and mouse.

隨著呼吸系統(tǒng)相關疾病研究的深入，利用肺泡灌洗液中成分的變化及其在疾病中的意義，對研究各種因素所引發(fā)的肺相關疾病具有重要價值[1-2]。很多實驗室對大、小鼠肺泡灌洗方法不斷的進行革新[3-9]，隨之而來的許多成功有效的技術手段得到廣泛的應用。為了本課題組開展進一步科學研究的需要，本研究建立了應用常規(guī)實驗器材建立大、小鼠肺泡灌洗的新方法，這種方法的應用和推廣將從經(jīng)濟層面和技術層面幫助到更多實驗室的科研人員。本研究簡要描述具體的操作方法和要點，期待與廣大研究者進行探討和學習。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

動物：10只Wistar大鼠[體重220～250 g，許可證號：SCXK （京） 2012-0001]和10只雄性CB17-SCID小鼠[體重24～28 g，許可證號：SCXK （京） 2012-0001]購于北京維通利華動物實驗動物技術有限公司，常規(guī)飼養(yǎng)于遼寧中醫(yī)藥大學實驗動物中心SPF級動物房內，12 h/12 h晝夜光照，動物房溫度為22～24℃，濕度為70%。

材料：乙醚（國藥集團化學試劑有限公司）、小鼠灌胃針（12#，6 cm）、1～200 μl Pipette Tip （Thermo Fisher，Cat.# 010-Q）、PBS（Ca2+，Mg2+ Free，Hyclone，GE）、血細胞計數(shù)板、1#手術線、Leica AM6000顯微鏡、1640培養(yǎng)基、四季青胎牛血清及1 ml和10 ml無菌注射器（鎮(zhèn)江康利醫(yī)療器械有限公司）。

1.2 操作方法

1.2.1 大鼠肺泡灌洗操作方法 實驗準備：首先對小鼠灌胃針等器具進行滅菌。在50 ml離心管底部填充約5 ml體積的棉球，然后用吸管向棉球內部添加3 ml乙醚液體，如果需要增加大鼠麻醉數(shù)量，適時補充乙醚的使用劑量。對Wistar大鼠進行麻醉處理，觀察大鼠的呼吸頻率，待呼吸由急促轉慢時，將其固定于鼠板上，此時如果大鼠蘇醒，重復進行麻醉。將大鼠處死（大鼠腹主動脈法采血），然后噴灑適量75%乙醇，在無菌條件下進行支氣管肺泡灌洗術。

肺泡灌洗操作：①沿正中線剪開腹部和頸部皮膚，分離大鼠肺和氣管組織。將氣管和肺組織置于直徑100 mm培養(yǎng)皿中，先將1#手術線打結放在距離氣管切口端5 mm左右位置，然后將經(jīng)過滅菌處理的小鼠灌胃針插入到大鼠氣管中，同時用力系緊之前在近氣管切口端的打結（圖1）。取注射器抽取預冷的不含鈣鎂離子的PBS緩沖液5 ml注入肺腔，輕輕按摩肺臟，停留20 s后再緩慢回抽支氣管肺泡灌洗液。以上操作重復10次，25～40 ml液體。② 置于4℃離心機以1000 r/min，離心10 min，后棄上清液。③ 10%小牛血清的RPMI1640細胞培養(yǎng)液懸浮細胞，經(jīng)過培養(yǎng)后，貼壁生長的大鼠肺泡巨噬細胞可以進行下一步的實驗研究。

1.2.2 小鼠肺泡灌洗操作方法 實驗準備：首先進行插管器具處理，即用剪刀減掉吸頭末端約5 mm，在實驗操作之前完成Thermo吸頭與1 ml注射器的吻合要求，注意一定要吻合良好（如果剪刀剪去的長度不合適，會使吸頭與注射器的吻合性差，灌洗時發(fā)生漏液）。處理好吸頭后，與其他實驗器具一并滅菌。CB17-SCID鼠處死（小鼠摘眼球法采集外周血），固定鼠板后噴灑適量75%乙醇，在無菌條件下進行支氣管肺泡灌洗術。

肺泡灌洗操作：①沿正中線剪開腹部和頸部皮膚，分離小鼠肺和氣管組織。將氣管和肺組織置于直徑60 mm培養(yǎng)皿中，先將1#手術線打結放在在氣管切口端5 mm左右位置，然后將經(jīng)過剪切及滅菌處理的吸頭插入到小鼠氣管中，同時用力系緊之前在近氣管切口端的打結（圖2）。取注射器抽取預冷的不含鈣鎂離子的PBS緩沖液1 ml注入肺腔，輕輕按摩肺臟，停留20 s后再緩慢回抽支氣管肺泡灌洗液。以上操作重復10次，5～8 ml液體。②置于4℃離心機以1000 r/min，離心10 min，后棄上清液。③10%小牛血清的RPMI1640細胞培養(yǎng)液懸浮細胞，經(jīng)過培養(yǎng)后，貼壁生長的小鼠肺泡巨噬細胞可以進行下一步的實驗研究。

2結果

依靠小鼠灌胃針和電泳點樣吸頭建立的大、小鼠肺泡灌洗新方法共完成20次插管和肺泡灌洗操作，收集的肺泡巨噬細胞，用10%小牛血清的RPMI1640細胞培養(yǎng)，經(jīng)過細胞計數(shù)可以得到約1×107個大鼠肺泡巨噬細胞，細胞形態(tài)特征如圖3所示； 經(jīng)過計數(shù)可以得到約3×106個小鼠肺泡巨噬細胞，形態(tài)特征如圖4所示。經(jīng)過貼壁選擇及圖像采集證明獲得的細胞為高質量的肺泡巨噬細胞，提示實驗技術方法有效，創(chuàng)新收集肺泡灌洗液的方法成功。

3討論

近年呼吸系統(tǒng)疾病的研究呈上升趨勢，支氣管肺泡灌洗技術已越來越多地應用于外源性化合物對肺臟毒性作用的研究，通過對支氣管肺泡灌洗液（ bronchalveolar lavage fluid， BALF）中細胞、生化、肺表面活性物質等多種成分的分析，可以探討化合物對肺臟的作用機制[10-12]。BALF中一些酶類的變化可以直接反映肺組織細胞的氧化損傷情況。獲取的肺泡巨噬細胞直接暴露于引發(fā)呼吸系統(tǒng)炎性疾病的各種因子中，而這些成分激活的肺泡巨噬細胞能夠分泌多種細胞因子和趨化因子并激活其他效應細胞，甚至破壞肺部組織結構[13-14，2]。應用常規(guī)實驗室耗材建立的大、小鼠肺泡灌洗新方法已經(jīng)成為呼吸系統(tǒng)損傷機制研究的必要技術。

應用常規(guī)實驗室耗材建立的大、小鼠肺泡灌洗新方法具有以下優(yōu)點：①將氣管和肺組織剪切下來，可視性更好，可以更加直觀地完成灌洗操作；②應用小鼠灌胃針完成大鼠肺泡灌洗操作，首先，可以更好地避免實驗器具給組織帶來的損傷，另外，還可以防止結扎后組織和灌胃針脫離的發(fā)生；③應用處理后于1 ml注射器相吻合的點樣吸頭，由于吸頭一端到另一端逐漸變細，所以可以與小鼠氣管接觸得更緊密，防止漏液的發(fā)生，同時也可以避免使用金屬銳器完成灌洗造成的組織破壞。

操作的注意事項：①灌洗前采集血樣時，大鼠腹主動脈采血量應>6 ml；小鼠摘眼球采血量應>0.5 ml；如果采集的血量太少，則需要加入適量的紅細胞裂解液，消除紅細胞對研究帶來的影響；按照上述要求完成的肺泡灌洗液收集的細胞經(jīng)過培養(yǎng)后，經(jīng)過更換培養(yǎng)基，即可以除去未貼壁生長的紅細胞。②分離大、小鼠氣管和肺組織時，切勿剪破肺組織，造成灌洗操作無法完成，而且小鼠氣管的剪切要盡量靠近其口咽部，保證氣管長度足夠通過吸頭完成肺泡灌洗液的收集。③進行灌洗時，注意灌胃針和吸頭的推進角度及注射器推入液體的速度，推進角度太大容易造成氣管組織破損，液體推入的速度太快容易漏液。④抽取灌洗液時，要由氣管一端到另一端變換位置完成，一般來說，可以由近支氣管端向遠端進行，因為氣管有1/3左右的纖維結締組織的特殊組織結構，所以抽取液體時結締組織會阻塞吸頭，需要變更位置完成。⑤進行肺泡灌洗操作時，要逐一完成，如同時收集多組氣管和肺組織，可由多人完成肺泡灌洗液操作，否則會影響獲得肺泡巨噬細胞的質量。

綜上所述，通過小鼠灌胃針和電泳點樣吸頭建立的大、小鼠肺泡灌洗新方法，大膽地改進和創(chuàng)新了肺泡灌洗方法的實驗操作，應用常規(guī)實驗室耗材建立的大、小鼠肺泡灌洗新方法操作簡潔，可重復性好，能夠廣泛用于大、小鼠肺泡灌洗液的收集。熟練此種技術可以更好地為科學研究服務。

[參考文獻]

[1]Hodge S，Hodge G，Scicchitano R，et al.Alveolar macrophages from subjects with chronic obstructive pulmonary disease are deficient in their ability to phagocytose apoptotic airway epithelial cell[J].Immunol Cell Biol，2003，81（4）：289-296.

[2]Reddy AT，Lakshmi SP，Muchumarri RR，et al.Nitrated fatty acids reverse cigarette smoke-induced alveolar macrophage activation and inhibit protease activity via electrophilic s-alkylation[J].PLoS One，2016，11（4）：e0153336.

[3]劉文彬，劉貴穎.大鼠支氣管肺泡灌洗方法的研究進展[J].臨床肺科雜志，2012，17（4）：704-706.

[4]史菲，邱晨.大鼠支氣管肺泡灌洗術標準化操作的探討[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學雜志，2002，12（24）：67-69.

[5]侯長春，趙海金，蔡紹曦，等.支氣管哮喘小鼠模型肺組織和肺泡灌洗液高遷移率族蛋白B1的表達及地塞米松的干預作用[J].南方醫(yī)科大學學報，2010，30（9）：2051-2054.

[6]酆孟潔，邱晨，劉雯雯.支氣管肺泡灌洗術在哮喘小鼠模型中的應用[J].國際檢驗醫(yī)學雜志，2012，33（19）：2305-2306.

[7]李佳曦，汪受傳，徐建亞，等.白藜蘆醇對RSV感染BALB/c小鼠肺泡灌洗液TNF-α，IL-1β，IL-6表達的調控趨勢[J].中國中藥雜志，2012，37（10）：1451-1454.

[8]董江濤，徐芳，田璽擇，等.不同毒力結核分枝桿菌感染小鼠對肺泡巨噬細胞的凋亡率及其時相性變化的影響[J].中國免疫學雜志，2012，28（5）：389-392.

[9]武婧，王素華，王春蝦，等.兩種大鼠肺灌洗方法的對比研究[J].包頭醫(yī)學院學報，2013，29（6）：26-28.

[10]曹君，陳平，楊悅，等.煙霧暴露所致肺氣腫小鼠模型的建立與評價[J].中國實驗動物學報，2010，18（4）：278-282.

[11]黃翠萍，張珍祥，徐永健.p38蛋白激酶對大鼠肺泡巨噬細胞活化機制的調控[J].中國病理生理雜志，2003，19（5）：661-663.

[12]劉芬，李勇，趙寧，等.MicroRNA-132通過調控膽堿能通路減輕肺泡巨噬細胞炎癥反應[J].中國病理生理雜志，2016，32（2）：261-266.

[13]譚海濤，胡業(yè)煥，黃淑萍，等.纖維支氣管鏡應用于重癥腦卒中伴肺部感染的臨床觀察[J].中國當代醫(yī)藥，2014， 21（3）：31-33.

[14]王曉艷，宋瑞瑞，張曉雪，等.PI3K/Akt信號通路在染塵大鼠肺泡巨噬細胞自噬中作用[J].中國職業(yè)醫(yī)學，2016， 43（3）：247-255.