陳震堯+劉燕

[摘要]目的 篩選山芪補(bǔ)腎消渴丸的最佳提取工藝條件。方法 采用正交試驗(yàn)法，以續(xù)斷皂苷Ⅵ的提取率和總固體物收率作為考察指標(biāo)，針對(duì)對(duì)提取影響較大的加水量、提取次數(shù)、提取時(shí)間三因素進(jìn)行考察，從而確定一個(gè)較為合理的提取工藝，根據(jù)研究結(jié)果進(jìn)行三批中試，驗(yàn)證提取工藝的可行性及產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定性。結(jié)果 實(shí)驗(yàn)證明，正交試驗(yàn)優(yōu)選出的最佳提取工藝條件是藥材飲片加水煎煮提取2次，每次加8倍水，第1次提取2 h，第2次提取1.5 h。結(jié)論 山芪補(bǔ)腎消渴丸優(yōu)選出的提取條件經(jīng)穩(wěn)定性驗(yàn)證是可行的，適合大批量生產(chǎn)。

[關(guān)鍵詞]山芪補(bǔ)腎消渴丸；提取工藝；正交試驗(yàn)；川續(xù)斷皂苷Ⅵ；總固體物收率

[中圖分類號(hào)] R927 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2016）12（b）-0015-04

Research on optimizing the extraction technique of Shanqibushenxiaoke Pills using orthogonal experiments

CHEN Zhen-yao1 LIU Yan2

1.Drug Manufacturing Room，Hospital of Traditional Chinese Medicine of Zhaoqing City in Guangdong Province，Zhaoqing 526020，China；2.Department of Pharmacy，Zhaoqing Medical College，Guangdong，Zhaoqing 526020，China

[Abstract]Objective To optimize the extraction technique of Shanqibushenxiaoke Pills.Methods Orthogonal experimental design was used to optimize the extraction technique.The extraction rate of the Dipsacus saponin Ⅵ and the recovery rate of total solids were used as observation indexes.To determine a more reasonable extraction technique，three factors which had greater influence on the extraction，including the amount of water used，the number of repetitions of extraction，and the extraction time were studied.According to the results of the orthogonal experiments，three pilot scale trials were performed to verify the feasibility of the extraction technique and the consistency of the product quality.Results The experimental result proved that the optimized extraction technique determined by using the orthogonal experiments was as follows：the Chinese herbal pieces was decocted with water and extracted for 2 times，each time with 8 times of water，extracted 2 hours in the first times，extracted 1.5 hours in the second times.Conclusion The optimized extraction technique for the Shanqibushenxiaoke Pills was feasible and which was suitable for the large scale production.

[Key words]Shanqibushenxiaoke Pills；Extraction technique；Orthogonal experiment；Dipsacus saponin Ⅵ；The recovery rate of total solid

山芪補(bǔ)腎消渴丸由山藥、黃芪、山茱萸、芡實(shí)、蓮子、太子參、續(xù)斷、五味子、白術(shù)、訶子、肉豆蔻、荷葉組成，具有健脾益氣、補(bǔ)腎澀精止漏功效，主治脾腎兩虛、腎陰虧虛、陰陽(yáng)兩虛型的糖尿病。本制劑為濃縮丸，根據(jù)處方藥物性質(zhì)及資料研究，本研究擬對(duì)處方中的黃芪[1]、荷葉[2]、訶子[3]、續(xù)斷[4]、太子參[5]、五味子[6]、肉豆蔻[7]等七味藥物加水煎煮提取，采用正交試驗(yàn)法，優(yōu)選最佳提取工藝并進(jìn)行中試試驗(yàn)驗(yàn)證其可行性。

1儀器與試藥

1.1儀器

WATERS-515型高效液相色譜儀（美國(guó)沃特世公司），F(xiàn)A1004N電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司），KQ5200DE型臺(tái)式數(shù)控超聲波清洗器（東莞科橋超聲波設(shè)備有限公司），JC101型電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海成順儀器光有限公司），立式萬(wàn)用電爐（上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司）。

1.2試藥

川續(xù)斷皂苷Ⅵ（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：111685-201304）；藥材購(gòu)自肇慶得隆中藥飲片廠，經(jīng)鑒定均符合《中國(guó)藥典》2015年版一部各項(xiàng)下有關(guān)規(guī)定；甲醇、乙腈為色譜純，其他試劑為分析純，水為純化水。

2方法與結(jié)果

2.1提取工藝的確定

主要根據(jù)處方各藥有效成分的理化性質(zhì)及其藥理作用，同時(shí)考慮臨床需要、生產(chǎn)可行性以及生產(chǎn)設(shè) 備等方面的因素設(shè)計(jì)工藝流程，擬采用加水煎煮提取工藝。

2.2正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2.2.1因素水平選擇

影響提取結(jié)果的因素很多，主要有加水倍量、提取次數(shù)、提取時(shí)間等，本研究采用正交試驗(yàn)法，選取加水量（A）、提取次數(shù)（B）、提取時(shí)間（C）作為考察因素[8]，每個(gè)因素設(shè)計(jì)3個(gè)水平，進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)，篩選出最佳的工藝條件。因素水平見表1。

2.2.2考察指標(biāo)的確定

續(xù)斷為方中主要藥味，主要成分為三萜皂苷類[9]，具有抗炎鎮(zhèn)痛作用[10]。設(shè)計(jì)本實(shí)驗(yàn)方案時(shí)，選取HPLC法測(cè)定水提取液中川續(xù)斷皂苷Ⅵ的含量，其為重要的考察指標(biāo)，權(quán)重系數(shù)定為0.6；水提取液中總固體物（即干膏得率）作為浸膏總有效成分考察的另一個(gè)指標(biāo)，權(quán)重系數(shù)定為0.4，以兩者的結(jié)果進(jìn)行綜合評(píng)分，考察加水倍量、提取次數(shù)、提取時(shí)間三因素對(duì)提取工藝的影響，優(yōu)選出最佳的工藝參數(shù)。

2.3正交試驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)方法

2.3.1樣品的制備

按處方比例稱取訶子、肉豆蔻、續(xù)斷、黃芪、荷葉、五味子、太子參等藥材，按實(shí)驗(yàn)方案設(shè)定的方法提取，過(guò)濾，濾液靜置過(guò)夜，取上清濃縮至適量，定容至1000 ml，備用。

2.3.2續(xù)斷皂苷Ⅵ含量測(cè)定

2.3.2.1色譜條件 色譜柱：Agilent Extend C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-水（30∶70）；檢測(cè)波長(zhǎng)：212 nm；流速：0.8 ml/min；柱溫：25℃[11]。

2.3.2.2對(duì)照品溶液的制備 精密稱取川續(xù)斷皂苷Ⅵ對(duì)照品15 mg，置于10 ml量瓶中，加甲醇搖勻使全部溶解，稀釋至刻度，搖勻，精密吸取1.0 ml，置10 ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得對(duì)照品溶液，濃度為0.15 mg/ml。

2.3.2.3供試品溶液的制備 將提取液濃縮并定容至1000 ml的樣品，精密量取0.7 ml置于10 ml量瓶中，加甲醇至刻度，稱定重量，超聲處理30 min，放冷，用甲醇補(bǔ)足損失的重量，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得。

2.3.2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密吸取川續(xù)斷皂苷Ⅵ對(duì)照品溶液3、5、10、15、20 μl進(jìn)樣，按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，以峰面積積分值為縱坐標(biāo)（Y），對(duì)照品溶液進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（X），按最小二乘法進(jìn)行回歸，得回歸方程為Y=274X-4910，r=0.9999，顯示川續(xù)斷皂苷Ⅵ在0.45～3.00 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（圖1）。

2.3.2.5樣品含量的測(cè)定 精密吸取各正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的供試品溶液各10 μl，按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，根據(jù)供試品吸收度積分值與對(duì)照品積分值，采用外標(biāo)兩點(diǎn)法計(jì)算，即得。

2.3.3干膏得率的測(cè)定

精密吸取實(shí)驗(yàn)方案中各樣品濃縮液10 ml，置于已恒重的蒸發(fā)皿里，水浴蒸干，按照干燥失重測(cè)定法[12]103測(cè)定，計(jì)算干膏得率，公式如下：

干膏得率（%）=×100%

W為各樣品10 ml濃縮液中干浸膏重量，V為定容體積，Wt為飲片重量。

2.3.4評(píng)價(jià)指標(biāo)綜合評(píng)分

根據(jù)“2.2.2”項(xiàng)下考察指標(biāo)的確定，以水提液中續(xù)斷皂苷Ⅵ的含量和總固體物的收率為指標(biāo)，采用公式[Y=（60/續(xù)斷皂苷Ⅵ含量max）×續(xù)斷皂苷Ⅵ含量+（40/得膏率max）×得膏率][13]計(jì)算綜合評(píng)分，采用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。

2.4正交試驗(yàn)結(jié)果及分析

2.4.1實(shí)驗(yàn)結(jié)果

取“2.3.1”項(xiàng)下制備好的樣本，按正交表設(shè)定條件及上述實(shí)驗(yàn)方法試驗(yàn)，正交試驗(yàn)安排及結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。

2.4.2結(jié)果分析

對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果作直觀分析，結(jié)合方差分析，判斷各因素對(duì)提取效果的影響程度，篩選出最佳的提取條件。由表2的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，對(duì)提取效果有影響的因素順序?yàn)樘崛〈螖?shù)（B）>提取時(shí)間（C）>加水倍量（A），由此得到的最佳工藝條件為A2B3C3。由表3的方差分析可知，提取次數(shù)（B）對(duì)提取結(jié)果有顯著性影響，提取時(shí)間（C）對(duì)提取結(jié)果有一定影響，而加水倍量（A）對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果無(wú)顯著性影響。提取次數(shù)之間的主要差異體現(xiàn)在提取1次和提取2次之間，通過(guò)綜合分析，認(rèn)為以縮短生產(chǎn)周期，降低生產(chǎn)成本等綜合因素為宜，選擇A1B2C3作為本實(shí)驗(yàn)的最佳提取工藝條件，即藥材飲片加水回流提取2次，每次加8倍水量，第1次提取2 h，第2次提取1.5 h。

2.5穩(wěn)定性試驗(yàn)

為確定本工藝的優(yōu)劣與穩(wěn)定性，依據(jù)上述分析優(yōu)選出的最佳工藝條件（即A1B2C3）進(jìn)行三批驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表4。由表4可知，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的結(jié)果與正交試驗(yàn)優(yōu)選的結(jié)果相符，提示正交試驗(yàn)優(yōu)選出的工藝條件合理，方法穩(wěn)定可行。

3討論

續(xù)斷性苦味辛，微溫，有補(bǔ)肝腎作用[12]329，續(xù)斷皂苷是其有效成分之一，含量指標(biāo)川續(xù)斷皂苷Ⅵ有成熟的高效液相色譜測(cè)定方法，《中國(guó)藥典》2015年版及相關(guān)文獻(xiàn)都有收載[14-15]，所以本試驗(yàn)以川續(xù)斷皂苷Ⅵ的提取率和總固體物收率作為考察指標(biāo)，在操作應(yīng)用上是切實(shí)可行的。

本提取工藝條件在實(shí)際工作中經(jīng)中試放大驗(yàn)證，結(jié)果與小試基本一致，所以該提取工藝條件優(yōu)選出的條件是合理可行的，可在大生產(chǎn)中應(yīng)用。

[參考文獻(xiàn)]

[1]王書梅，程曉衛(wèi)，吳立明.正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)選黃芪中黃芪甲苷的水提取工藝[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2006，17（12）：2519-2520.

[2]胡榴燕.荷葉的功能成分提取測(cè)定及藥用研究進(jìn)展[J].浙江中醫(yī)雜志，2006，41（11）：678-679.

[3]郭軍，楊恒林.訶子提取物藥用作用研究與展望[J].中國(guó)病原生物學(xué)雜志，2013，8（1）：89-90.

[4]唐安玲，宋英，李圓圓，等.續(xù)斷煮散顆粒煎煮工藝正交試驗(yàn)與溶出曲線的研究[J].中成藥，2015，37（2）：430-433.

[5]祁曉淼，張麗艷，彭邦梅，等.正交試驗(yàn)優(yōu)選復(fù)方太子參顆粒處方藥材的提取工藝研究[J].現(xiàn)代藥物與臨床，2013， 28（5）：708-711.

[6]張守勤，劉長(zhǎng)姣，王長(zhǎng)征，等.五味子有效成分提取分離方法的研究進(jìn)展[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2007，18（10）：2581-2583.

[7]徐雙枝，張婷，高家榮，等.多指標(biāo)綜合加權(quán)評(píng)分法優(yōu)選補(bǔ)骨脂-肉豆蔻藥對(duì)水提工藝研究[J].中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，2016，36（18）：1558-1563.

[8]王文驪，劉軍鋒，高錦成.骨刺消膠囊中水提工藝的正交試驗(yàn)研究[J].陜西中醫(yī)，2013，34（4）：471-473.

[9]王強(qiáng)，劉二偉，韓立峰，等.中藥川續(xù)斷化學(xué)成分的研究[J].藥學(xué)學(xué)報(bào)，2013，48（7）：1124-1127.

[10]張琪，汪仙陽(yáng)，馬博，等.復(fù)方續(xù)斷總皂苷鎮(zhèn)痛抗炎及預(yù)防骨質(zhì)疏松癥的實(shí)驗(yàn)研究[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2010，21（7）：1683.

[11]周平蘭，余輝，蔣孟良，等.HPLC法測(cè)定跌打促愈片中川續(xù)斷皂苷Ⅵ的含量[J].中國(guó)藥師，2014，17（10）：1770-1772.

[12]國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典[M].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015：103.

[13]張建軍，李智勇，莊玉堅(jiān)，馬玲.正交設(shè)計(jì)優(yōu)選芪歸通絡(luò)口服液提取工藝[J].安徽醫(yī)藥，2009，13（5）：492-493.

[14]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典（一部）[M].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015：329.

[15]孫艷，卞俊，陳海飛，等.愈骨療傷膠囊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J].解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào)，2012，28（1）：65-68.

[16]吳春園，王俊，高錦飚.高效液相色譜法測(cè)定仙靈骨葆膠囊中川續(xù)斷皂苷Ⅵ的含量[J].中國(guó)現(xiàn)代藥物應(yīng)用，2014， 8（17）：238-239.