張春節(jié)+姜維美+韓磊+孫詠梅

[摘要]目的 探討ERCC1、β-tubulin 3及TOPOⅡ在晚期非小細胞肺癌（NSCLC）中的表達與臨床病理特征及與鉑類化療療效的關(guān)系。方法 選取2012年1月～2013年6月在我院治療的61例晚期NSCLC住院患者作為研究對象，采用免疫組化方法檢測其組織中ERCC1、β-tubulin 3及TOPOⅡ的表達，患者均接受培美曲塞聯(lián)合奈達鉑方案化療并定期評價療效。結(jié)果 ERCC1、β-tubulin 3的表達與患者的年齡、性別、臨床分期及組織學類型均無關(guān)（P>0.05）；TOPOⅡ的表達與患者的年齡、性別、臨床分期無關(guān)（P>0.05）；TOPOⅡ在腺癌中陽性表達8例（22.86%），鱗癌陽性表達14例（53.85%），鱗癌的表達高于腺癌，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.017）。ERCC1、β-tubulin 3及TOPOⅡ的陽性表達分別為40.98%（25/61）、47.54%（29/61）及36.66%（22/61），陽性表達化療有效率分別為16.00%（4/25）、48.28%（14/29）及63.64%（14/22），陰性表達化療有效率分別為63.89%（23/36）、40.63%（13/32）及33.33%（13/39）。結(jié)論 ERCCI及TOPOⅡ陽性可預測NSCLC對鉑類化療藥物的療效，且TOPOⅡ?qū)Σ煌M織學類型的晚期非小細胞肺癌療效預測具有重要意義。

[關(guān)鍵詞]非小細胞肺癌；ERCC1；β-tubulin 3；TOPOⅡ；免疫組化

[中圖分類號] R734.2 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2016）12（b）-0007-04

Expression of ERCC1，β-tubulin 3 and TOPO Ⅱ in advanced non-small-cell lung cancer and their relationship with clinical pathological features and efficacy of platinum based chemotherapy

ZHANG Chun-jie1 JIANG Wei-mei2 HAN Lei1 SUN Yong-mei1

1.Department of Pathology，the Second People′s Hospital of Lianyungang City in Jiangsu Province，Lianyungang 222000，China；2.Department of Oncology，the Second People′s Hospital of Lianyungang City in Jiangsu Province，Lianyungang 222000，China

[Abstract]Objective To explore the expressions of ERCC1，β-tubulin 3 and TOPO Ⅱ in advanced non-small-cell lung cancer （NSCLC） and their correlations with clinical pathological features and efficacy of platinum based chemotherapy.Methods 61 patients with NSCLC in our hospital from January 2012 to June 2013 were selected as the study subjects，mmunohistochemical method was used to detect the expression of tissue ERCC1 and β-tubulin 3 and TOPO Ⅱ，All the patientswere treated with Pemetrexed combined with Nedaplatin chemotherapy，and the efficacy was evaluated on a regular.Results The express of ERCC1 and β-tubulin 3 was not related to the age，sex，clinical stage and histological type of the patient （P>0.05）.The expression of TOPO Ⅱ was not related to the age，sex，and clinical stage of the patients （P>0.05）.The positive expression of TOPO Ⅱ in adenocarcinoma was 8 cases （22.86%），14 cases （53.85%） were positive in squamous cell carcinoma，and the positive expression of ERCC1，β-tubulin 3 and TOPO Ⅱ in squamous cell carcinoma was higher than that in adenocarcinoma，with significant difference （P=0.017）.The positive expression of ERCC1，β-tubulin 3 and TOPO Ⅱ were 40.98% （25/61），47.54% （29/61） and 36.66% （22/61） respectively，the effective rate of positive expression of chemotherapy was 16.00% （4/25），48.28% （14/29） and 63.64% （14/22），the effective rate of negative expression of chemotherapy was 63.89% （23/36），40.63% （13/32） and 33.33% （13/39）.Conclusion The positive expression of ERCCI and TOPO Ⅱ can predict the efficacy of NSCLC in the treatment of platinum based chemotherapy drugs，and TOPO Ⅱ has important significance for the prognosis of advanced NSCLC with different histological types.

[Key words]Non-small-cell lung cancer；ERCC1；β-tubulin 3；TOPO Ⅱ；Immunohistochemistry

目前，肺癌是導致全球腫瘤患者死亡的最主要原因，其中80%～85%為非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC），手術(shù)是Ⅰ～Ⅱ期及部分ⅢA期NSCLC患者的主要治療方法之一，雖術(shù)后給予輔助化療，但生存率改善不佳，有研究顯示，其5年生存率較前僅改善5%左右[1-2]。臨床中，約3/4的患者確診時已是晚期，失去了手術(shù)機會，主要的治療手段為化療[3]。近年來，以鉑類為基礎(chǔ)的第三代聯(lián)合化療方案是NSCLC一線治療的金標準，但腫瘤細胞對其的耐藥性仍很高，往往導致治療失敗。隨著對功能性基因組研究的深入，近年來，切除修復交叉互補基因1（excision repair cross-completion 1，ERCC1）在鉑類耐藥中的作用日益受到重視，β-微管蛋白3（β-tubulin 3）的表達與紫杉類耐藥密切相關(guān)[4]，而國外有學者報道其表達與鉑類耐藥也存在相關(guān)性。近十年來，拓撲異構(gòu)酶Ⅱ（toposiomerase-Ⅱ，TOPOⅡ）也被視為一種新的耐藥相關(guān)基因，被認為是化療失敗的原因之一。本研究采用免疫組化方法檢測分析NSCLC患者組織ERCC1、β-tubulin 3及TOPOⅡ的表達情況，探討ERCC1、β-tubulin 3及TOPOⅡ的表達與鉑類療效的關(guān)系，為基因檢測在腫瘤個體化治療中的應用提供一定的理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1一般資料

選取2012年1月～2013年6月在我院治療的61例住院患者作為研究對象，所有患者均通過病理確診為NSCLC，均為初診治療。其中男性45例，女性16例；年齡46～75歲，中位年齡60歲；鱗癌26例，腺癌35例；ⅢB期29例，Ⅳ期32例；體力狀況（PS）評分≤2分；治療前肝腎功能、血常規(guī)及心電圖均正常；預計生存時間≥3個月；有可測量的臨床指標（CT、MIR等）?；颊呔邮芘嗝狼?lián)合奈達鉑方案化療4～6個周期，每2個周期評價療效。

1.2化療方案及所用試劑

培美曲塞：第1天給藥，500 mg/m2，溶于100 ml生理鹽水稀釋后，靜脈滴注10 min；奈達鉑第2天給藥，60 mg/m2，溶于500 ml生理鹽水稀釋后，靜脈滴注，滴注時間>1 h，滴完后繼續(xù)輸液1000 ml；給化療藥之前常規(guī)給予5-HT3受體阻斷劑阿扎司瓊10 mg靜脈滴注以鎮(zhèn)吐，21 d為1個周期。治療2個周期。主要試劑：鼠抗人ERCC1單克隆抗體，鼠抗人β-tubulin 3單克隆抗體，鼠抗人TOPOⅡ單克隆抗體，即用型免疫組織化學超敏SP試劑盒（KIT-9701）及DAB染色液（KIT-0017），均購自福建邁新生物技術(shù)有限公司。

1.3觀察指標及評價標準

觀察2周后參照實體瘤療效評判標準進行療效評價，具體如下。完全緩解（CR）：部病灶消失維持4周，無新病灶出現(xiàn)；部分緩解（PR）：縮小≥30%維持4周，無新病灶出現(xiàn)；疾病穩(wěn)定（SD）：病灶既未縮小≥30%并維持4周也未增加≥20%或出現(xiàn)新病灶。

免疫組化染色：組織蠟塊3 μm切片行免疫組化，ERCC1和TOPOⅡ均陽性表達于細胞核，β-tubulin 3陽性表達于細胞質(zhì)，以出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性標志。結(jié)果判定：采用隨機雙盲法閱片，高倍視野下隨機選取計數(shù)200個腫瘤細胞，觀察陽性細胞百分比及陽性染色強度，然后進行評分。細胞計數(shù)評分標準：陽性細胞數(shù)<10%為0分，10%～25%為1分，>25%～75%為2分，>75%為3分。染色強度評分標準：著色部位不著色為0分，著色部位著色不全為1分，著色部位完全著色且淡染為2分，著色部位完全著色且深染為3分。兩方面評分相加0～3分為低表達（-），4～6分為陽性表達（+）。

1.4統(tǒng)計學方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行處理，各組間計數(shù)資料的比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結(jié)果

2.1 ERCC1、β-tubulin 3及TOPOⅡ在晚期NSCLC組織中的表達

在61例NSCLC中，ERCC1陽性表達25例（40.98%），β-tubulin 3陽性表達29例（47.54%），TOPOⅡ陽性表達22例（36.66%）。

2.2 ERCC1、β-tubulin 3及TOPOⅡ的表達與臨床病理特征的關(guān)系

ERCC1、β-tubulin 3的表達與患者的年齡、性別、臨床分期及組織學類型均無關(guān)（P>0.05），TOPOⅡ的表達與患者的年齡、性別、臨床分期無關(guān)（P>0.05）。TOPOⅡ在腺癌中陽性表達8例（22.86%），在鱗癌中陽性表達14例（53.85%），在鱗癌中的表達高于腺癌，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.017）（表1）。

2.3 ERCC1、β-tubulin 3及TOPOⅡ的表達與鉑類化療療效的關(guān)系

ERCC1陽性表達患者化療有效率為16.00%（4/25），非陽性表達患者化療有效率為63.89%（23/36），差異有顯著性（P=0.000）；β-tubulin 3陽性表達患者的化療有效率為48.28%（14/29），非陽性表達患者的化療有效率為40.63%（13/32），差異無統(tǒng)計學意義（P=0.611）；TOPOⅡ陽性表達患者的化療有效率為63.64%（14/22），非陽性表達患者的化療有效率為33.33%（13/39），差異有統(tǒng)計學意義（P=0.032）（表2）。

3討論

隨著全球經(jīng)濟的高速發(fā)展以及環(huán)境污染的日益加劇，再加上吸煙人群的不斷增多，使得肺癌高居全球新增癌癥之首，年死亡人數(shù)達100多萬，且每年的增長率>25%。但目前肺癌的治療和預后仍不能令人滿意，這與其易發(fā)生、復發(fā)、轉(zhuǎn)移以及化療藥物耐藥有很大關(guān)系。隨著對功能性基因組研究的深入，合理的個體化治療成為一種新的趨勢，2009年美國臨床腫瘤學會年會中提出NSCLC治療更應強調(diào)這一原則。鉑類通過與腫瘤細胞形成鉑-DNA聚合物，導致DNA復制障礙，從而抑制腫瘤細胞的分裂增殖，造成殺傷。鉑類耐藥的重要機制為核苷酸切除修復（nucleotide excision repair，NER）能力增強，通過NER清除鉑-DNA聚合物，導致鉑類失效。

ERCC1位于染色體19q13-2，全長15 kb，含10個外顯子，編碼含297個氨基酸的蛋白質(zhì)。ERCC1與DNA修復酶缺乏互補基因，形成異源二聚體，具有5′端DNA核酸內(nèi)切酶活性，可識別并切除受損DNA5′端，使鉑類損傷的DNA得到迅速修復，從而導致耐藥的發(fā)生。ERCC1活性的高低可反映整個NER修復活性的水平[5]，低表達會促使肺癌的發(fā)生和復發(fā)，但對鉑類藥物敏感；陽性表達可減少腫瘤的復發(fā)，但易引起耐藥的發(fā)生[6]。近年來ERCC1表達與鉑類耐藥之間的關(guān)系得到廣泛驗證，Reynolds等[7]對晚期NSCLC的三期實驗進行回顧性研究，應用熒光定量免疫組化方法檢測ERCC1蛋白的表達，發(fā)現(xiàn)其與鉑類方案療效呈負相關(guān)；Olaussen等[8]研究761例NSCLC患者ERCC1的表達水平，證實陰性表達患者的總生存期明顯高于陽性表達患者，且前者應用含鉑輔助化療能夠明顯延長生存期。本研究結(jié)果顯示，ERCC1表達陰性組的化療效果明顯高于表達陽性組，差異有統(tǒng)計學意義，與目前多數(shù)文獻的研究結(jié)果一致。Rybárová等[9]對107例NSCLC中的ERCC1蛋白表達進行相關(guān)性分析，認為ERCC1在NSCLC不同組織學類型表達差異無顯著性，與本研究結(jié)果一致，因此檢測ERCC1的表達有助于預測患者的預后及對鉑類藥物的化療敏感性，對指導晚期NSCLC的個體化治療方案能夠提供一定的依據(jù)。

TOPOⅡ是機體內(nèi)必不可少的核酶，直接參與DNA的轉(zhuǎn)錄、翻譯、復制及染色體分離等過程，主要存在于SG2/M期[10-11]。TOPOⅡ的表達主要有兩種作用：①可體現(xiàn)腫瘤細胞的增殖指數(shù)；②可作為腫瘤化療藥物作用的靶點，化療藥物通過與TOPOⅡ結(jié)合而使DNA復制和轉(zhuǎn)錄異常，阻礙腫瘤細胞的增殖。NSCLC腫瘤組織的TOPOⅡ表達水平可直接影響化療藥物的活性，TOPOⅡ表達水平越高，對化療藥物的敏感性就越高；反之，則導致腫瘤細胞的耐藥[12-14]。本研究結(jié)果顯示，TOPOⅡ蛋白表達與鉑類化療效果呈顯著相關(guān)，且其表達程度與鉑類化療藥物的療效呈正相關(guān)，即陽性表達患者鉑類化療療效好，陰性表達患者對鉑類更易發(fā)生耐藥，這與上述研究結(jié)果相吻合。

β-tubulin是微管結(jié)構(gòu)的主要組成部分，而微管蛋白是細胞骨架的重要組成部分，在細胞有絲分裂中起重要作用，是紫杉醇類藥物作用的靶點。其可分為7種亞型，其中β-tubulin 3的作用最為重要。文獻報道，β-tubulin 3表達與紫杉醇類的化療療效具有相關(guān)性，而與鉑類藥物的耐藥性是否相關(guān)尚不明確[15-19]。Huang等[20]的研究結(jié)果顯示，NSCLC鱗癌患者的β-tubulin 3陽性率與腺癌患者比較，差異無統(tǒng)計學意義。本研究結(jié)果顯示，β-tubulin3的表達與鉑類藥物療效無相關(guān)性。

綜上所述，ERCCI及TOPOⅡ可作為預測NSCLC對鉑類化療藥物療效的生物學標志物，對臨床用藥及預后有一定的指導意義；但β-tubulin 3與鉑類療效無明確相關(guān)性，需繼續(xù)擴大樣本量以進行更深入的研究。

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