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        油桃果實(shí)頂腐形成原因分析

        2017-05-30 09:30:13余興賈云生吳湘琴賈兵葉振風(fēng)朱立武
        安徽農(nóng)業(yè)科學(xué) 2017年10期
        關(guān)鍵詞:油桃

        余興 賈云生 吳湘琴 賈兵 葉振風(fēng) 朱立武

        摘要[目的]探討油桃果實(shí)頂腐形成的原因。[方法]以中油5號(hào)油桃果實(shí)為試材,分別測(cè)定正常油桃與頂腐油桃果實(shí)中Ca含量;從頂腐油桃上分離純化得到致病菌,采用CTAB法提取菌絲DNA,對(duì)其進(jìn)行rDNA-ITS鑒定,利用NCBI在線Blast工具進(jìn)行致病菌rDNA-ITS同源性比較。[結(jié)果]病果果實(shí)中Ca元素含量顯著低于對(duì)照;腐爛壞死部位分離出2種不同類型菌絲,分別為弱寄生菌“黑變病”與“黑酵母菌”。[結(jié)論]油桃頂腐主要是由缺鈣誘發(fā)后弱寄生菌侵染造成的。

        關(guān)鍵詞油桃;頂腐;Ca;弱寄生菌

        中圖分類號(hào)S662.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611(2017)10-0152-03

        Analysis on Top Rot of Nectarine Fruits

        YU Xing1,JIA Yunsheng2,WU Xiangqin2 et al

        (1.Anhui Institute of Geological Experiment,Hefei,Anhui 230001; 2.College of Horticulture,Anhui Agriculture University,Hefei,Anhui 230036)

        Abstract[Objective] The aim was to explore the formation causes of nectarine fruit top rot.[Method] The fruit of nectarine cultivar ‘Zhongyou5 was as testing materials,and Ca content in fruit between the normal and top rot nectarine were determined.The pathogenic bacteria was isolated and purified from the top rot nectarine,the mycelium DNA was extracted by CTAB method,and the rDNAITS sequence was analyzed and identified,and the homology was compared by the NCBI Blast online tools.[Result] Ca content in the disease fruit was significantly lower than in the control; two kinds of different types mycelium were separated from fruit decay and necrotic areas,which the weak parasitic fungus was respectively melanosis and black yeast.[Conclusion] Nectarine top rot is mainly caused by calciumdeficiency,then is infected by the weak parasite.

        Key wordsNectarine;Top rot;Ca;Weak parasite

        我國(guó)油桃栽培始于20世紀(jì)70年代,20世紀(jì)80年代先后推出了曙光、華光、艷光、瑞光系列、秦光系列、中油系列的多系列甜油桃品種。到20世紀(jì)90年代,油桃保護(hù)地栽培迅速崛起,成為栽培的主要方式之一,在生產(chǎn)中所占的比例越來(lái)越大,其中,陜西渭南油桃保護(hù)地栽培占栽培總量的90%以上[1]。安徽省碭山縣是傳統(tǒng)水果種植大縣,其中保護(hù)地油桃種植面積近萬(wàn)畝,經(jīng)濟(jì)效益較高。

        Ca是一種不易被植物吸收且吸收后又不易移動(dòng)的元素,大量的Ca存在于葉中,果實(shí)中甚少。Ca只能單向(向上)轉(zhuǎn)移,并受蒸騰作用的影響,常常會(huì)發(fā)生低蒸騰果實(shí)中的Ca向樹體倒流的現(xiàn)象,因而果實(shí)極易表現(xiàn)出缺Ca癥狀。在果樹栽培中僅由此所造成的果實(shí)腐爛等損失占產(chǎn)量的20%~30%,經(jīng)濟(jì)損失嚴(yán)重[2]。保護(hù)地栽培,油桃生長(zhǎng)速度就減緩,果實(shí)發(fā)育變慢,成熟期推遲。同時(shí)由于光照不足,枝條出現(xiàn)不同程度的徒長(zhǎng),葉片變大變薄,光合速率明顯下降,致使果實(shí)發(fā)育和營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)間出現(xiàn)不平衡[3]。碭山縣油桃頂腐現(xiàn)象較嚴(yán)重,尤其是大棚油桃發(fā)病率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于露地油桃。筆者對(duì)頂腐油桃中Ca含量進(jìn)行了測(cè)定,并對(duì)果實(shí)頂腐部位病菌進(jìn)行了分離、純化和rDNA-ITS序列分析,探討了油桃果實(shí)頂腐形成原因,以期為大棚油桃生產(chǎn)預(yù)防頂腐提供理論依據(jù)。

        1材料與方法

        1.1材料植物材料為安徽省碭山縣園藝場(chǎng)大棚栽培的中油5號(hào)頂腐果實(shí)和正常果實(shí)。ITS1和ITS4引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

        1.2方法

        1.2.1果實(shí)Ca含量測(cè)定。取中油5號(hào)頂腐果實(shí)和正常果實(shí),用去離子水清洗油桃果面3次,削去表皮,切取果肉,后混樣,設(shè)3次重復(fù),Ca元素含量采用電感耦合等離子體質(zhì)譜法(ICP-MS)測(cè)定[4]。

        1.2.2病原菌的分離與純化。在無(wú)菌條件下,取新鮮病果(分發(fā)病輕、發(fā)病重2組),用70%乙醇擦拭病組織表面,分別切取發(fā)病輕、發(fā)病重的病果病部表皮以及重病果削去表皮后染病果肉,依次接種至代號(hào)為“1-1”“1-2”“1-3”的PDA培養(yǎng)皿(圖1),放入25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待菌落直徑長(zhǎng)至1 cm時(shí),挑取菌落邊緣菌絲于PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行純化培養(yǎng)[5]。重復(fù)操作3次可得到純化菌株。

        1.2.3形態(tài)學(xué)鑒定。將純化的病原菌接種于PDA平板培養(yǎng)基上,25 ℃培養(yǎng)5~6 d,期間觀察記錄菌落在培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況;在Olympus BX51顯微鏡下觀察菌絲形態(tài)。

        1.2.4分子生物學(xué)鑒定。采用CTAB法提取“1-1”“1-2”“1-3”PDA培養(yǎng)基上的菌株T1、T2、T3的DNA。應(yīng)用rDNA-ITS通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAAC CTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′),進(jìn)行PCR擴(kuò)增[6]。采用20 μL反應(yīng)體系:10×Buffer 2 μL,MgCl2 2 μL,0.25 mmol/L dNTP,Taq酶1 U,1 μL DNA模板,ITS1和ITS4引物各0.2 μmol/L。反應(yīng)程序:94 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃變性1 min,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,30個(gè)循環(huán);72 ℃終延伸10 min。擴(kuò)增完成后,取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠上電泳檢測(cè),用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收純化目的片段,回收純化產(chǎn)物送上海英駿生物公司測(cè)序。

        1.2.5rDNA-ITS序列與系統(tǒng)發(fā)育分析。在GenBank網(wǎng)站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)的數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行測(cè)序結(jié)果的比對(duì),利用NCBI提供的Blast工具,在線搜索同源性較高的已知序列,將目標(biāo)序列和搜索到的同源序列以FASTA格式編輯成為一個(gè)文本文件,用軟件ClustalX 1.83對(duì)序列進(jìn)行多重比較;去掉兩端的引物序列后,利用BioEdit程序和MEGA 3.1軟件以非加權(quán)配對(duì)算術(shù)平均法構(gòu)建系統(tǒng)聚類樹,分析其親緣關(guān)系[7]。

        2結(jié)果與分析

        2.1Ca含量測(cè)定結(jié)果表明,正常果實(shí)和頂腐果實(shí)中的Ca平均含量分別為88.9和60.2 mg/kg,病果果實(shí)中Ca含量比正常果實(shí)降低了32.3%,且二者之間Ca含量的差異達(dá)到了顯著性水平。

        2.2病原菌的分離與形態(tài)學(xué)觀察

        病果病部表皮病原菌的分離與形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果(圖2、3)顯示,從病部切取獲得的組織經(jīng)分離純化培養(yǎng)5 d后,表皮病原菌菌落均呈深灰綠色,周邊乳白色,短絨毛狀,有少量環(huán)形溝紋,菌落背面黑色;生長(zhǎng)較快。初步判斷,發(fā)病輕與發(fā)病重的病果病部表皮分離的病原菌是同一種病原菌。

        病果病部果肉病原菌的分離與形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果(圖4)顯示,其菌落和周邊均呈現(xiàn)乳白色,短絨毛狀,反面也是乳白色;生長(zhǎng)較表皮病原菌菌落生長(zhǎng)慢。初步判斷,表皮病原菌與果肉病原菌是2種不同的病原菌。

        2.3病原菌rDNA-ITS序列分析

        對(duì)“1-1”和“1-2”PDA培養(yǎng)基上的菌絲進(jìn)行轉(zhuǎn)接提純,培養(yǎng)5 d后提取菌絲基因組DNA,以得到的DNA為模版,應(yīng)用特異引物經(jīng)PCR擴(kuò)增,產(chǎn)物經(jīng)電泳均獲得1條分子量為446 bp的條帶,轉(zhuǎn)化測(cè)序后,經(jīng)rDNA-ITS序列分析比對(duì)(圖5),為麥類黑變病菌屬(Cladosporium cladosporioides),即油桃“黑變病”。

        對(duì)“1-3”PDA培養(yǎng)基上的的菌絲進(jìn)行轉(zhuǎn)接提純,培養(yǎng)5 d后提取菌絲基因組DNA,測(cè)序得分子量為476 bp,轉(zhuǎn)化測(cè)序后,經(jīng)rDNA-ITS序列分析比對(duì)(圖6),為出芽短梗霉菌(Aureobasidium pullulans),即油桃“黑酵母菌”。

        該2種真菌均為弱寄生菌,當(dāng)油桃果實(shí)表皮受到機(jī)械損傷或組織疏松腐爛時(shí),會(huì)侵染果肉,導(dǎo)致果實(shí)發(fā)病。

        3結(jié)論與討論

        在碭山地區(qū),大棚內(nèi)油桃果實(shí)頂腐現(xiàn)象明顯多于露地栽培,可能與Ca的吸收特點(diǎn)有關(guān),因?yàn)镃a的運(yùn)送速率在很大程度上受蒸騰速率的支配,土壤干旱時(shí)或者設(shè)施內(nèi)高濕條件下,易引起缺Ca,如果實(shí)套袋后,幼果蒸騰被抑制,吸收Ca的能力均會(huì)減弱[2]。通風(fēng)透光條件差的果園,其容易缺Ca[8]。同時(shí),對(duì)Ca吸收的減少易造成油桃果實(shí)膜透性增加,果實(shí)抗腐能力下降,感病的概率也隨之增加,更容易被弱寄生病菌所侵染。因此,中油5號(hào)油桃頂腐主要由缺Ca誘發(fā)弱寄生菌“黑變病”和“黑酵母菌”侵染造成的。

        廖亞運(yùn)等[9]研究表明,在桃生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中葉片和果實(shí)表面噴施不同濃度的Ca溶液,能增加果實(shí)Ca含量,使細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能得到有效保護(hù),其中以0.015 mol/L螯合鈣處理效果較明顯,整個(gè)發(fā)育期以幼果期噴鈣效果最顯著。潘家荃等[10]研究了75%拿敵穩(wěn)WG 5 000倍和Wuxal Calcium 2 000倍組合、75%拿敵穩(wěn)WG 5 000倍、Wuxal Calcium 2 000倍、鈣爾美2 000倍、好力克5 000倍和鈣爾美2 000倍組合5個(gè)處理對(duì)蘋果苦痘病的防治效果,以Wuxal Calcium單劑2000倍稀釋液處理效果最好。李中勇等[11]研究表明,采前土壤施Ca可顯著提高貯藏期設(shè)施油桃的超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化物酶(POD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)活性,并顯著降低設(shè)施油桃果實(shí)的質(zhì)膜透性及過(guò)氧化產(chǎn)物丙二醛的積累,改善設(shè)施油桃果實(shí)貯藏品質(zhì),延長(zhǎng)設(shè)施油桃果品貨架期。因此,設(shè)施油桃生產(chǎn)中,幼果期噴Ca是必要的,對(duì)預(yù)防頂腐病,提高果實(shí)貯藏性有很好的效果。

        安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)2017年

        參考文獻(xiàn)

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        [11] 李中勇,高東升.土壤施鈣對(duì)設(shè)施油桃貯藏期間果實(shí)抗氧化系統(tǒng)的影響[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué),2014,43(6):116-119.

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