張凱 王希卓 孫潔 楊琴 孫海亭

摘要[目的]明確內(nèi)蒙古貯期馬鈴薯主要貯藏病害種類。[方法]2015年10月至2016年4月在內(nèi)蒙古烏蘭察布市化德縣對貯期通風(fēng)庫內(nèi)腐爛的馬鈴薯進行取樣，采用組織分離法對病原菌進行分離、純化培養(yǎng)以及形態(tài)觀察與分子鑒定。[結(jié)果]造成化德縣貯期馬鈴薯腐爛的病害有干腐病（Fusarium spp.）、晚疫?。≒hytophthora infestans）、早疫?。ˋlthernaria solani）、環(huán)腐病（Clavibacter michiganense subsp. sepedonicus）、軟腐?。‥rwnia spp.），其中，干腐病為主要病害。經(jīng)鑒定，引起馬鈴薯干腐病的病原菌有4種：接骨木鐮刀菌（Fusarium sambucinum）、燕麥鐮刀菌（Fusarium Link）、銳頂鐮孢（Fusarium acuminatum）、木賊鐮刀菌（Fusarium equiseti）。致病疫霉引起的晚疫病及部分茄鏈格孢引起的早疫病易發(fā)生復(fù)合侵染，多出現(xiàn)在腐爛較嚴重的薯塊，貯藏后期病薯多存在真菌復(fù)合侵染現(xiàn)象，腐爛嚴重薯塊還存在細菌復(fù)合侵染現(xiàn)象。[結(jié)論]試驗結(jié)果為馬鈴薯貯期防病提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞馬鈴薯；貯期病害；病原鑒定；CTAB法；PCR擴增；分子鑒定

中圖分類號S509.3文獻標(biāo)識碼

A文章編號0517-6611（2017）10-0147-05

Identification of Pathogen of Potato Rot Disease Inner Ventilation Bank of Huade County， Mongolia during Storage Period

ZHANG Kai， WANG Xizhuo， SUN Jie et al（Chinese Academy of Agricultural Engineering，key Laboratory of Agricultural Products Postpartum Processing，Ministry of Agriculture，Beijing 100125）

Abstract [Objective] The aim was to clear main pathogen of potato rot disease inner ventilation bank of Huade County， Mongolia during storage period. [Method] We sampled rotten potato during the storage period from October， 2015 to April， 2016 inner ventilation bank of Huade County， Wulanchabu City， Mongolia， used organizational separation method to separate and culture pathogens， and defined through the means of morphology and molecular identification. [Result] There were several diseases to cause potato rot disease during the storage period in Huade County， such as dry rot disease（Fusarium spp.）， late blight disease（Phytophthora infestans）， early blight disease（Althernaria solani），ring rot disease（Clavibacter michiganense subsp. sepedonicus） and rot disease（Erwnia spp.）， among them the dry rot disease was the main disease. There were 4 kinds of pathogens cause dry rot disease of potato through the identification， such as Fusarium sambucinum，F(xiàn)usarium Link，F(xiàn)usarium acuminatum and Fusarium equiseti. The late blight disease caused by Phytophthora infestans and early blight disease caused by part Alternaria solani were often happened in much serious rot potatoes which occurred mixed infection， and these potatoes were always infected by variety of fungi in the late period of storage， the severe rotting potatoes were occurred complex infection by bacterium. [Conclusion] The results provide theoretical basis for disease control of potato during storage period.

Key wordsPotato；Storage diseases；Identification of the pathogen；The CTAB method；PCR amplification；Molecular identification

馬鈴薯由于具有適應(yīng)范圍廣、抗逆性強、單產(chǎn)水平高、糧菜兼用、營養(yǎng)豐富、節(jié)水節(jié)地等優(yōu)勢，近年來越來越受重視，種植面積與產(chǎn)量也連年增加。尤其在2015年余欣榮副部長發(fā)表了關(guān)于我國“馬鈴薯主糧化”戰(zhàn)略的談話之后，可預(yù)見今后幾年我國的馬鈴薯產(chǎn)量仍會保持較高的增長速度。隨著馬鈴薯產(chǎn)業(yè)的不斷發(fā)展，鮮薯的貯藏量不斷擴大，貯藏周期進一步延長，貯藏病害造成的腐爛問題也日漸突出。據(jù)統(tǒng)計，病害造成的產(chǎn)后馬鈴薯損失普遍在10%以上[1-3]，由于貯藏管理不規(guī)范等原因，部分地區(qū)馬鈴薯產(chǎn)后損失更是高達20%～30%[2]，甚至達50%造成爛窖[3]。筆者對貯期馬鈴薯病害病原進行了鑒定，明確內(nèi)蒙古地區(qū)貯期馬鈴薯主要貯藏病害種類，以期為馬鈴薯貯期防病提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料調(diào)查地點為內(nèi)蒙古烏蘭察布市化德縣。調(diào)查品種為當(dāng)?shù)胤N植面積較廣的夏波蒂。

1.2調(diào)查方法分別于馬鈴薯貯藏中期（2016年2月）與貯藏后期（2016年4月）分2批通過隨機取樣的方式對病薯進行了取樣。第1批調(diào)查病薯送樣3個（以F開頭命名，薯塊以阿拉伯?dāng)?shù)字順序編號，如F1表示第1批的第1個薯塊）；第2批病薯送樣19個（以S開頭命名，薯塊以阿拉伯?dāng)?shù)字順序編號，如S1代表第2批中的第1個薯塊）。

1.3病原菌的分離與鑒定

1.3.1分離與純化。采用組織分離法[4-5]對馬鈴薯病原菌進行分離。先將病薯用75%乙醇表面消毒，然后將薯塊切開，用解剖刀切取病健交界處2～3 mm的小塊，每個薯塊不同病斑取10塊，轉(zhuǎn)至PDA培養(yǎng)基中，在25 ℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)，然后挑取邊緣菌絲進行純化。

1.3.2形態(tài)鑒定。主要依據(jù)Booth鐮刀菌分類系統(tǒng)的標(biāo)準[6-7]，同時參考王拱辰等[8]關(guān)于鐮刀菌的鑒定方法進行補充。具體鑒定指標(biāo)：培養(yǎng)物色澤及菌落形態(tài)；PSA上培養(yǎng)7 d，孢子的類型、著生方式、形態(tài)及大?。y量30個以上孢子長寬）；產(chǎn)孢細胞的類型及形態(tài)。

1.3.3分子鑒定。選取5株分離物。采用改進的CTAB法[9]提取其基因組DNA。用1.0%瓊脂糖凝膠檢測DNA的質(zhì)量及濃度。利用ITS4和ITS5引物對進行PCR擴增[10]。反應(yīng)體系：ES PCR Master Mix 12.5 μL，ITS5 1.0 μL，ITS4 1.0 μL，模板DNA 1.0 μL，ddH2O 9.0 μL。擴增程序：95 ℃ 60 s；95 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，35個循環(huán)；72 ℃ 7 min。4 ℃保存。擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳檢測后送上海生工生物工程有限公司測序。將測定ITS序列在GenBank中進行Blast比對[11-12]，根據(jù)其相似度確定測定序列的種類。

2結(jié)果與分析

2.1送檢病薯的癥狀觀察

第1批所送的3個薯塊，2個腐爛嚴重，腐爛部分可達整薯的80%以上，薯塊表皮已長出濃密的白色或略帶紅色的菌絲（圖1-A，1和2），1塊腐爛程度較輕，表皮上有直徑1.5～2.0 cm的凹陷、深褐色、堅硬壞死斑（圖1-A，3）。嚴重腐爛的2個薯塊切開后，內(nèi)部薯肉出現(xiàn)褐色至黑色的組織壞死（圖1-B和1-C），出現(xiàn)或部分出現(xiàn)了由組織崩解造成的空腔，空腔內(nèi)產(chǎn)生了大量病菌霉層（圖1-B）。發(fā)病輕的薯塊切開后，薯肉除表皮腐爛對應(yīng)部位有很薄的黑色壞死外，其余部分仍保持健康（圖1-D），這主要是由于薯塊在初期侵染后，由于外界條件，包括貯藏條件的變化，使得病害發(fā)展停滯。

第2批樣品共計19個薯塊，其中3個運回實驗室的過程中發(fā)生腐爛，如圖2-D；其余16個薯塊大多為輕微的壞死（圖2-A）。薯塊切開后多數(shù)薯肉顏色正常，僅壞死斑下部有壞死組織（圖2-B），個別薯塊切開呈濕腐狀（圖2-C）。

2.2病原物的分離、鑒定和病害診斷

2.2.1第1批樣品病原物的分離、鑒定和病害診斷。

從第1批樣品（F1、F2和F3）中，每個薯塊分離了10個標(biāo)樣，其中F1薯塊上分離到了4個菌株，而F2和F3分別分離出3個菌株，共計分離獲得10個菌株（表1）。通過形態(tài)學(xué)觀察，該批所分離的10個菌株分別為接骨木鐮刀菌6株、銳頂鐮刀菌2株、致病疫霉和茄鏈格孢各1株。

2.2.2第2批樣品病原菌的分離、鑒定和病害診斷。從第2批樣品（S1～S19）中，每個薯塊分離了10個標(biāo)樣，共計分離獲得27株菌。其中，薯塊S6和S9上各分離到4株菌，S1、S4和S7薯塊上各分離到3株菌，S5和S10薯塊上各分離到2株菌，剩下的S2、S8、S11、S12、S14、S19上各分離到1株菌（表2）。通過形態(tài)學(xué)觀察和抽樣分子鑒定，該批所分離的27株菌中，引起干腐病的4種鐮刀菌共計21株，包括8株銳頂鐮刀菌、6株木賊鐮刀菌、5株燕麥鐮刀菌和2株接骨木鐮刀菌，而剩余6株菌中有3株為引起晚疫病的致病疫霉，其他3株分別為引起早疫病的茄鏈格孢、引起環(huán)腐病的密執(zhí)安棒形菌和引起軟腐病的胡蘿卜歐文氏菌。

根據(jù)觀察干腐病病原菌共有以下4種：

（1）接骨木鐮刀菌。PSA培養(yǎng)基上氣生菌絲稀疏，叢卷毛狀，初呈白色，后變淡黃色或玫瑰色（圖3-A）。產(chǎn)孢細胞單瓶梗，瓶狀小梗呈圓柱形、倒棍棒形，大小為11.03～25.61 μm×2.24～3.88 μm（圖3-B）。分生孢子散生其間，并在培養(yǎng)基表面形成大量粉狀孢子堆。大型分生孢子彎曲，近似紡錘形，背腹分明，頂部細胞鳥嘴形，基胞足跟明顯或不明顯，通常具3～5個分隔，孢子大小為19.29～40.21 μm×4.49～7.63 μm（圖3-C）。小型分生孢子和厚垣孢子未觀察到。

（2）銳頂鐮刀菌。在PSA上氣生菌絲棉絮狀，表面玫瑰紅色，邊緣白色，中心部分變?yōu)辄S棕色，底部為紅棕色（圖4-A）。PSA上不易產(chǎn)孢，Bilay培養(yǎng)基上氣生菌絲稀疏，白色。大型分生孢子鐮刀型，背腹面彎曲，多數(shù)3～5個分隔，大小為25.11～48.77 μm×3.02～4.08 μm（圖4-B）。小型分生孢子幾乎沒有。產(chǎn)孢細胞單瓶梗多分枝，倒棍棒狀，大小為27.69～40.36 μm×3.47～4.38 μm（圖4-C）。

（3）燕麥鐮孢。PSA上氣生菌絲絨狀至棉絮狀，白色，后夾有土黃色（圖5-A），大型分生孢子鰻魚形，細長，略彎兩端漸尖，3～8個分隔，多數(shù)5隔，大小34.00～80.00 μm×3.50～4.00 μm（圖5-C），菌絲細長，無隔，有二叉分支（圖5-B）。

（4）木賊鐮孢。PSA上氣生菌絲絨狀至棉絮狀，底部淺駝色，可長橘黃色分生孢子座，基物表面黃色至淡褐色，基物不變色（圖6-A）。大型分生孢子鐮刀形，彎曲，中部細胞膨大，頂胞延長呈錐形，基胞有足跟，3～5個分隔，大小16.50～81.00 μm×3.00～6.00 μm（圖6-C），菌絲分枝較多，不分隔（圖6-B）。

同一薯塊上可分離到多種病原菌，如第2批編號為S6的薯塊上，分離獲得3種鐮刀菌，即銳頂鐮孢（圖7，S6-1）、燕麥鐮孢（圖7，S6-3）和木賊鐮孢（圖7，S6-4），還分離出1株茄鏈隔孢（圖7，S6-2），表明該薯塊是由3種鐮刀菌引起的干腐病和早疫病的復(fù)合侵染。

為了進一步驗證形態(tài)學(xué)鑒定，從所分離的菌株中選擇了S9-1、S1-3、S14、S5-2、S8等菌株測定其ITS序列，在GenBank中進行Blast[11-12]搜索比對，其結(jié)果與形態(tài)學(xué)鑒定一致。

3結(jié)論與討論

通過對樣品馬鈴薯進行病害診斷，內(nèi)蒙古化德地區(qū)貯期的主要病害有5種，其中馬鈴薯干腐?。‵usarium spp.）為2015年當(dāng)?shù)刭A期最主要病害，病害輕微發(fā)病造成薯塊表皮褐斑，影響經(jīng)濟及種用價值，嚴重發(fā)病造成薯塊凹陷腐爛，失去應(yīng)有價值；馬鈴薯晚疫病和馬鈴薯早疫病發(fā)病比例不高，但病害多為后期侵染復(fù)合發(fā)病，呼吸增強，溫度升高加速了薯塊的腐爛過程[13]，對薯塊造成致命性破壞，復(fù)合發(fā)病的薯塊多失去商用價值，且病殘體極易成為次年貯期病害的初侵染源；馬鈴薯環(huán)腐病（Clavibacter michiganense subsp. sepedonicus）病害自塊莖內(nèi)部發(fā)病，輕微發(fā)病無明顯癥狀，待到發(fā)現(xiàn)薯塊萎蔫、芽眼黑枯之后切開一般可見維管束呈乳白色或黃褐色環(huán)狀腐爛[3]，此時馬鈴薯已失去價值，因此對環(huán)腐病更應(yīng)做好預(yù)防工作；軟腐?。‥rwnia spp.）發(fā)病率較低，其他損傷所占比例較高。

研究表明，馬鈴薯貯藏病害除了上述種類以外，還包括馬鈴薯黑脛?。‥rwinia carotovora subsp.atroseptica）、馬鈴薯莖線蟲?。―itylenchus destructor）、馬鈴薯瘡痂病（Streptomyces scabies）、馬鈴薯黑心?。ㄉ硇圆『Γ┑萚14]，該次調(diào)查未發(fā)現(xiàn)這幾種病害，關(guān)于內(nèi)蒙地區(qū)馬鈴薯儲藏期是否還有其他病害有待進一步調(diào)查鑒定。通過對采集病薯樣品進行病原菌的分離鑒定，共鑒定出8種病原菌，分別為晚疫病病原菌致病疫霉菌（Phytophthora infestans）、早疫病病原茄鏈格孢（Alternaria solani）、細菌性病害環(huán)腐病病原密執(zhí)安棒形菌環(huán)腐亞種（Clavibacter michiganense subsp. sepedonicum）、軟腐病病原菌胡蘿卜歐文氏菌胡蘿卜致病變種（Erwiniactortovora var. carotovora）。干腐病病原菌有接骨木鐮刀菌（Fusarium sambucinum）、燕麥鐮刀菌（Fusarium Link）、銳頂鐮孢（Fusarium acuminatum）、木賊鐮刀菌（Fusarium equiseti）。

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