劉曉婧 凌紅麗 蔣貽海 張園園 趙明 楊光烈 于春梅 薄宗義

摘要[目的]制備H9N2亞型禽流感病毒單克隆抗體和鑒定表位。[方法]選取H9N2亞型禽流感病毒（AIV）WD-1株的純化抗原免疫BALB/c小鼠，對(duì)獲得2株抗H9N2亞型禽流感病毒的特異性單抗4C10和6E3表位進(jìn)行鑒定。[結(jié)果]單抗4C10和6E3分別屬于IgG1和IgG2b亞型，ELISA檢測(cè)效價(jià)分別為1∶103和1∶105；HI效價(jià)分別為215和214；2株單抗均具有雞胚中和活性。利用噬菌體展示表位技術(shù)對(duì)2株單抗的抗原表位進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示均為針對(duì)HA 蛋白的1個(gè)線性表位。[結(jié)論]該研究為禽流感病毒快速診斷方法的建立提供了依據(jù)。

關(guān)鍵詞禽流感病毒；H9N2亞型；單抗；抗原表位

中圖分類(lèi)號(hào)S852.4文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2017）10-0129-03

Preparation of H9N2 Subtype Avian Influenza Virus Antibodies and Epitope Identification

LIU Xiaojing， LING Hongli*， JIANG Yihai et al

（Qingdao Vland Biological Products Co. Ltd，Qingdao，Shandong 266114）

Abstract[Objective] To prepare H9N2 subtype avian influenza virus antibodies and identify epitope.[Method] The epitopes of two monoclonal antibodies （McAbs） specific to H9 subtype avian influenza virus （AIV） were identified by cell fusion with the BALB/c mice immunized with purified H9N2 AIV WD1. [Result]The 4C10 and 6E3 were belonged to IgG 1 and IgG 2b，repectively. The ELISA titers were 1∶103 and 1∶105. The HI titers in their ascites were 215 and 214. Two monoclonal antibodies had chicken embryo neutralizing activity. The antigen epitopes of two monoclonal antibodies were all linera epitopes targeting HA protein. [Conclusion] The study laid the foundation for the establishment of rapid diagnostic method of avian influenza virus.

Key wordsAvian influenza virus；H9N2 subtype；Monoclonal antibody；Antigen epitopes

禽流感（Avian Influenza，AI）是由A型流感病毒引起的一種禽類(lèi)傳染病，感染動(dòng)物表現(xiàn)出從呼吸系統(tǒng)到全身敗血癥等多種癥狀[1-2]。流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，目前對(duì)養(yǎng)殖業(yè)危害比較大的是H5和H9亞型禽流感。H9亞型禽流感病毒本身引起的死亡率較低，但能與其他病原混合感染易感動(dòng)物，引起較高的死亡率，此外也有H9亞型禽流感病毒感染人的報(bào)道[3]。目前主要采取疫苗免疫和嚴(yán)格的生物安全措施來(lái)控制該病。鑒于H9亞型禽流感病毒對(duì)養(yǎng)禽業(yè)的危害及其在公共衛(wèi)生學(xué)上的意義，加強(qiáng)對(duì)此亞型病毒的檢測(cè)和疫病防控迫在眉睫[4]。該研究選取了 H9N2亞型禽流感病毒W(wǎng)D-1株，制備了針對(duì)HA蛋白且具有中和活性的特異性單克隆抗體（McAbs）。利用噬菌體展示表位技術(shù)對(duì)其抗原保護(hù)決定簇進(jìn)行鑒定[5]，以期獲得具有免疫保護(hù)功能的抗原表位。該研究旨在通過(guò)體外篩選、人工制備等方法，獲得禽流感病毒特異性McAbs，以期為禽流感病毒快速診斷方法的建立提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1主要試驗(yàn)材料

H9N2 亞型禽流感病毒株WD-1由青島蔚藍(lán)生物制品有限公司提供；H5、H7、H9亞型標(biāo)準(zhǔn)血凝抗原及血清均從哈爾濱獸醫(yī)研究所獲得；對(duì)照病毒株NDV 毒株Lasota 由青島蔚藍(lán)生物制品有限公司提供；IBV 毒株Massachussetts41和SP2/0細(xì)胞由青島蔚藍(lán)生物制品有限公司生藥研發(fā)實(shí)驗(yàn)室保存；表達(dá)AIV（H9N2）的HA重組質(zhì)粒Pet28a-HA 由青島蔚藍(lán)生物制品有限公司生藥研發(fā)實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建；SPF雞胚購(gòu)自梅里亞；6～8周齡SPF BALB/c 雌性小鼠購(gòu)自北京醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2主要試劑

PrimeSTAR HS DNA 聚合酶、限制性內(nèi)切酶、DNA Marker均購(gòu)自TaKaRa公司；T4 DNA連接酶購(gòu)自NEB公司；質(zhì)粒抽提試劑盒、膠回收試劑盒購(gòu)自Axygen公司；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的兔抗鼠IgG（IgG-HRP）抗體和兔抗鼠IgG-FITC均購(gòu)自Sigma公司；Ni-NTA Agarose和Chromatography Column純化柱均購(gòu)自Qiagen公司；Prestained Protein Ladder 購(gòu)自MBI公司；PEG6000購(gòu)自Merc公司；蔗糖購(gòu)自上海國(guó)藥；噬菌體展示肽庫(kù)試劑盒購(gòu)自NEB公司。

1.3H9亞型禽流感病毒的純化

將保存的禽流感病毒用生理鹽水按1∶10 000倍稀釋后接種于10日齡雞胚，每個(gè)雞胚注射0.2 mL，37 ℃、60%濕度培養(yǎng)3 d后將雞胚置于4 ℃過(guò)夜，收集尿囊液測(cè)定其血凝活性。反復(fù)凍融3次后離心取上清，緩慢攪拌加入NaCl至 0.5 mol/L，再攪拌加入等體積10%的PEG6000，4 ℃過(guò)夜。8 000 r/min離心30 min取沉淀，加入原體積10%的PBS混懸后4 ℃過(guò)夜。8 000 r/min離心取上清，用20%、40%、60%的蔗糖18 000 r/min密度梯度離心2 h，收集病毒層，加入適量PBS后18 000 r/min離心2 h取沉淀PBS混懸，測(cè)定血凝價(jià)和蛋白濃度，分裝后于-20 ℃保存?zhèn)溆?。同時(shí)SPF雞胚尿囊液同上操作留存陰性對(duì)照品。

1.4動(dòng)物免疫

將H9N2 禽流感病毒經(jīng)蔗糖密度梯度離心純化后，按每只100 μg（ 0.2 m L）分點(diǎn)皮下注射BALB/c小鼠。初次免疫后14 d，再皮下分點(diǎn)加強(qiáng)免疫1次。融合前3 d，采用尾靜脈注射法加強(qiáng)免疫1次。

1.5雜交瘤細(xì)胞的制備

參照文獻(xiàn)[6]，將小鼠脾細(xì)胞和SP2/0 融合后的細(xì)胞用禽流感病毒蛋白間接ELISA和HA間接ELISA平行檢測(cè)，取雙陽(yáng)性的克隆，用有限稀釋法進(jìn)行克隆培養(yǎng)?？寺?次后獲得穩(wěn)定分泌特異性McAbs。將取得的陽(yáng)性細(xì)胞株上清用HI試驗(yàn)做篩選，取有HI效價(jià)的克隆進(jìn)行建株。

1.6HA1重組蛋白間接ELISA 方法的建立

按常規(guī)間接ELISA 操作，利用方陣法確定McAbs 的篩選條件。將該試驗(yàn)制備的重組HA1蛋白純化后濃度為1.25 mg/mL，用包被液對(duì)其進(jìn)行1∶10、1∶50、1∶100、1∶200、1∶500 倍稀釋，用PBS對(duì)陽(yáng)性血清進(jìn)行1∶500、1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000、1∶8 000倍稀釋。以陽(yáng)性孔OD值最接近于1，P/N 值大于2.1的蛋白和血清濃度作為最佳工作濃度。

1.7陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞的篩選與克隆純化

用間接ELISA檢測(cè)方法及間接免疫熒光法（Immunofluorence assay，IFA）檢測(cè)雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清，篩選出的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞，及時(shí)進(jìn)行克隆純化及擴(kuò)大培養(yǎng)，克隆純化采用有限稀釋法進(jìn)行。剩余細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)后進(jìn)行細(xì)胞凍存。

1.8McAbs的特性鑒定

1.8.1

Western blot分析。按常規(guī)SDS-PAGE方法：6%濃縮膠，15%分離膠進(jìn)行電泳后，PVDF膜，15 V轉(zhuǎn)印30 min，將轉(zhuǎn)印后的PVDF膜封閉過(guò)夜后，PBST洗滌后將腹水1∶200稀釋后37 ℃孵育1 h，洗滌后加二抗37 ℃孵育1 h，洗滌后DAB避光顯色15～30 min至條帶清晰，用蒸餾水終止顯色反應(yīng)。

1.8.2

免疫球蛋白亞類(lèi)鑒定。應(yīng)用SBA ClonotypingTM System/HRP抗體亞類(lèi)鑒定試劑盒（Southern Biotech公司）鑒定AIV H9單克隆抗體的亞類(lèi)。具體操作：取AIV純化病毒作為抗原包被的間接ELISA板，以雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清作為一抗；以1∶250倍稀釋HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgA、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM、κ、λ作為二抗；室溫下TMB避光顯色15 min，讀取OD450值。

1.8.3

特異性檢測(cè)。對(duì)篩選判為陽(yáng)性的細(xì)胞培養(yǎng)上清，采用間接ELISA方法和血凝抑制試驗(yàn)，分別與H5 亞型、H7亞型和H9亞型AIV 血凝素分型抗原、EDS-76病毒、NDV、IBV 抗原進(jìn)行特異性交叉檢測(cè)。

1.9McAbs腹水的制備與純化

取10～12周齡的BALB/c雌鼠，每只腹腔注射0.5 mL滅菌液體石蠟，7 d后腹部注射5×105個(gè)陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞，7～10 d后觀察小鼠腹部膨大明顯時(shí)，立即采集腹水。8 000 r/min，離心5 min，以去除油脂，收集上清，分裝后于-20 ℃凍存。

將腹水按照HiTrap Protein G HP說(shuō)明書(shū)，使用Protein G柱進(jìn)行純化。純化后的腹水用SDS-PAGE電泳進(jìn)行純度鑒定。

1.10McAbs腹水的抗體效價(jià)

獲得的AIV H9單抗腹水自1∶100開(kāi)始進(jìn)行10倍連續(xù)稀釋至1∶108，用建立的間接ELISA方法測(cè)抗體效價(jià)，同時(shí)設(shè)立陰、陽(yáng)性對(duì)照。P/N比值大于2.1的McAbs的最大稀釋度為其效價(jià)。

1.11雞胚中和試驗(yàn)

1.11.1

雞胚半數(shù)致死量（LD50）的測(cè)定。取9日齡雞胚分為11組，每組5只雞胚，其中1組作為對(duì)照組。將AIV H9胚毒按10-1～10-10做倍比稀釋。分別將倍比稀釋的病毒液經(jīng)尿囊腔接種到雞胚中，每只注射0.2 mL，對(duì)照組注射等量的生理鹽水。逐日觀察每組雞胚的死亡數(shù)，并記錄。按Reed和Muench氏法計(jì)算雞胚半數(shù)致死量LD50。

1.11.2

雞胚中和試驗(yàn)。通過(guò)對(duì)雞胚半數(shù)致死量的測(cè)定，選擇病毒液的稀釋度，用滅菌生理鹽水將病毒稀釋成每0.1 mL含有100個(gè)LD50。將雜交瘤細(xì)胞株培養(yǎng)上清按10-1～10-6做倍比稀釋。將病毒液分別與稀釋單抗細(xì)胞培養(yǎng)上清等量混合，于37 ℃感作1 h。試驗(yàn)組為6組，其中不同稀釋度的單抗分別為1組，另設(shè)正常對(duì)照組和病毒對(duì)照組（100個(gè)LD50），共8組。對(duì)試驗(yàn)組每個(gè)稀釋度接種5只雞胚，每只02 mL，正常對(duì)照組注射02 mL生理鹽水，病毒對(duì)照組接種0.2 mL含有100個(gè)LD50的病毒液，置于37 ℃孵化箱孵育144 h，棄去24 h內(nèi)死亡的雞胚，此后每6 h照蛋1次，及時(shí)將死亡胚取出，至144 h將雞胚全部取出，并放置4 ℃保存。逐日觀察每組雞胚的死亡數(shù)，并記錄。按Reed和Muench氏法計(jì)算中和指數(shù)。

1.12McAbs抗原表位的鑒定

按照NEB 公司的噬菌體展示肽說(shuō)明書(shū)對(duì)McAbs對(duì)應(yīng)的抗原表位進(jìn)行鑒定。測(cè)定擴(kuò)增前后噬菌體的滴度，經(jīng)過(guò)3輪淘篩，第3輪淘選產(chǎn)物測(cè)完滴度后隨機(jī)挑取噬菌體克隆進(jìn)行擴(kuò)增。在擴(kuò)增噬菌斑進(jìn)行DNA測(cè)序時(shí)，利用ELISA方法檢測(cè)所選多肽對(duì)靶分子的結(jié)合能力。

將100 μL的純化單抗以 100 μg/mL 的濃度包被 96 孔板，每個(gè)待鑒定克隆包被1排，在密封的濕盒中4 ℃包被過(guò)夜。甩出多余靶分子溶液，在紙巾上拍除殘液。每孔加滿封阻液，4 ℃封閉1 h。另外，還需單獨(dú)準(zhǔn)備一個(gè)微量滴定板進(jìn)行噬菌體的系列稀釋，也要用封阻液封阻。甩出封阻液，TBST洗板6次，甩去洗液。在單獨(dú)的封阻板中每孔預(yù)先加入200 μL TBST，每排第1孔加1×1012個(gè)病毒子，開(kāi)始對(duì)噬菌體進(jìn)行4倍系列稀釋至第12孔，2×105個(gè)病毒子。將稀釋好的噬菌體加入包被有靶分子的板中，室溫振蕩作用1 h。TBST 洗板 6 次，甩出洗液。二抗每孔加入 M13-HRP抗體（1∶5 000倍稀釋）200 μL，室溫振蕩作用1 h。TBST 洗板 6 次，甩出洗液。加入OPD顯色液100 μL/孔，顯色 10 min，終止液終止，酶標(biāo)儀讀值OD492。按各個(gè)噬菌體OD值（S）與陰性對(duì)照OD值（N）的比值（S/N）>2.1鑒定陽(yáng)性克隆株。

2結(jié)果與分析

2.1H9亞型禽流感病毒的純化與鑒定

收獲的接毒尿囊液經(jīng)蔗糖梯度差速離心后，可明顯分為4個(gè)條帶。分別取出4個(gè)條帶，測(cè)定其血凝滴度，確定病毒抗原主要所在位置。結(jié)果表明，40%處的蛋白帶血凝價(jià)為1∶214；60%處蛋白帶血凝價(jià)為1∶ 216，將其同時(shí)收集作為免疫抗原。

2.2雜交瘤細(xì)胞株的篩選及特性分析

經(jīng)過(guò)3次亞克隆純化，最終獲得3株能分泌McAbs的雜交瘤細(xì)胞株：4C10、5D8和6E3。

2.2.1

Western blot分析結(jié)果。采用H9N2亞型禽流感病毒W(wǎng)D-1株重組HA1蛋白，對(duì)3株單抗4C10、5D8和6E3進(jìn)行Western blot鑒定。其中單抗4C10和6E3均在約51 kD處有明顯條帶，證明為HA1蛋白的單抗，5D8未見(jiàn)條帶，可能為針對(duì)HA1蛋白的構(gòu)象抗體。

2.2.2

單克隆抗體的免疫球蛋白亞類(lèi)鑒定。采用美國(guó)

Southern Biotech公司的SBA ClonotypingTM System/HRP抗體亞類(lèi)鑒定試劑盒對(duì)所獲得的3株針對(duì)AIV H9的單抗進(jìn)行免疫球蛋白亞類(lèi)鑒定，鑒定結(jié)果顯示，單抗4C10和5DB均屬于IgG1/；單抗6E3屬于IgG2b/。

2.3單克隆抗體的抗體效價(jià)（ELISA和HI效價(jià)）

對(duì)3株單抗制備的腹水效價(jià)進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如表1所示。ELISA檢測(cè)效價(jià)單抗6E3的效價(jià)最高（1∶105）；HI檢測(cè)效價(jià)單抗4C10和6E3的腹水效價(jià)較高，分別為215和214。

2.6McAbs抗原表位鑒定

利用噬菌體12肽庫(kù)淘選針對(duì)H9亞型AIV 單抗4C10和6E3的克隆，3輪淘洗后，能與單克隆抗體4C10和6E3特異性結(jié)合的噬菌體得到了選擇性富集，隨機(jī)挑取20個(gè)克隆，經(jīng)ELISA陽(yáng)性鑒定后獲得10個(gè)陽(yáng)性克?。≒/N≥2.1）。

陽(yáng)性克隆經(jīng)上海生工生物工程有限公司測(cè)序，對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析，2株單抗對(duì)比顯示其一致序列為CSKYIGIKS，與所用毒株的HA 蛋白編碼氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)其與aa257～aa265有7 個(gè)氨基酸位點(diǎn)完全匹配，提示257CRKYIGVKS265為HA 抗原的1個(gè)線性表位。

3討論

近年來(lái)H9亞型禽流感病毒的變異加劇，對(duì)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展和社會(huì)公共安全的威脅也越來(lái)越大。病毒分離鑒定和HI試驗(yàn)等方法是目前診斷禽流感病毒的常用手段，但多用于實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)，而臨床上期待針對(duì)禽流感病毒的快速診斷試劑，如免疫膠體金試紙條、禽流感多重檢測(cè)基因芯片等產(chǎn)品。

該研究應(yīng)用雜交瘤技術(shù)，通過(guò)體外篩選、人工制備等方法研制出了針對(duì)H9亞型禽流感病毒HA1蛋白的特異性單克隆抗體，并鑒定出一段具有免疫保護(hù)功能的抗原結(jié)合表位，旨在通過(guò)對(duì)功能性抗原表位的進(jìn)一步研究，針對(duì)性地開(kāi)發(fā)出一系列有應(yīng)用價(jià)值的快速診斷和治療用禽流感功能型抗體。通過(guò)對(duì)抗體的表達(dá)及親和力改進(jìn)，實(shí)現(xiàn)抗體的大規(guī)模制備，推動(dòng)禽流感病毒抗體產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程。