賈福懷 黃貝梅 涂宏建 陶剛 涂建飛

摘要[目的]通過不同提取方法測定桑葉中黃酮和多糖的含量，探討最佳提取方法。[方法]分別采用超聲波提取法、堿水提取法和煎煮法3種方法提取桑葉中多糖和黃酮，利用分光光度計(jì)法測定桑葉中多糖和黃酮的含量。[結(jié)果]超聲波法測得黃酮含量最高，為1.702%；煎煮法測得多糖含量最高，為2.437%；堿水法測得黃酮和多糖均為3種方法最低的。[結(jié)論]利用不同提取方法，桑葉中黃酮和多糖測定結(jié)果差異較大，黃酮測定用超聲波法效果最佳，多糖測定用煎煮法效果最佳。

關(guān)鍵詞桑葉；提取方法；黃酮；多糖；含量

中圖分類號S789.4文獻(xiàn)標(biāo)識碼

A文章編號0517-6611（2017）10-0124-02

Different Extraction Methods for Determining the Contents of Flavonoid and Polysaccharide in Mulberry Leaves

JIA Fuhuai，HUANG Beimei*，TU Hongjian et al（Ningbo Yufangtang Biological Technology Co.，Ltd，Ningbo，Zhejiang 315012）

Abstract[Objective] The research aimed to determine the contents of flavonoid and polysaccharide in mulberry leaves by different extraction methods，and discuss the optimum extraction methods.[Method] Polysaccharide and flavonoid in mulberry leaves were extracted by ultrasonic extraction，alkaline extraction and decoction respectively.The contents of polysaccharide and flavonoid in mulberry leaves were determined by spectrophotometer.[Result] The content of flavonoid was the highest by ultrasonic method，1.702%.The content of polysaccharide was the highest by decoction，2.437%.The flavonoid and polysaccharide were the lowest by alkaline extraction in three methods.[Conclusion] Using different extraction methods，the results of determination of flavonoid and polysaccharide in mulberry leaves are quite different.Determination of flavonoid by ultrasonic method is the best and polysaccharide determination by decoction is the best.

Key words Mulberry leaf；Extraction method；Flavonoid；Polysac

桑葉（Mulberry Leaf）別名鐵扇子、家桑、黃桑葉等，為?？疲∕oraceae）植物桑（Morus alba L.）的干燥葉。桑屬植物全球約有16種，分布于北溫帶、亞洲熱帶和非洲熱帶及美洲地區(qū)。桑葉是蠶的主要食物，我國約有11種，南北各地廣泛種植，以江浙一帶等南方養(yǎng)蠶地區(qū)種植較廣[1]。

桑葉藥用價值廣，近年來多位學(xué)者對桑葉進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)桑葉中含有黃酮類、生物堿、植物甾醇等物質(zhì)，且多糖、氨基酸、維生素等含量豐富[2]。桑葉中多糖作為生物活性物質(zhì)，具有顯著的降血糖、抑制血脂升高、抗凝血的作用[3-4]，且能增強(qiáng)機(jī)體免疫力[5-6]和抗氧化能力[7-8]。黃酮的功效是多方面的，它是一種很強(qiáng)的抗氧劑，可有效清除體內(nèi)的氧自由基，抗氧化作用可以阻止細(xì)胞的退化、衰老，也可阻止癌癥的發(fā)生[9]。該研究采用超聲波提取法、堿水提取法和煎煮法3種方法提取桑葉中多糖和黃酮，利用分光光度計(jì)法測定桑葉中多糖和黃酮的含量，以確定提取多糖和黃酮的良好制備工藝，為工業(yè)生產(chǎn)桑葉多糖和黃酮提供依據(jù)，便于桑葉資源的開發(fā)利用。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1試材。桑葉由陜西瑞康生物科技有限公司提供，經(jīng)鑒定為植物桑的干燥葉。

1.1.2儀器。NH-250DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司），AMCH-C20-H（予華60 W）型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海予華儀器設(shè)備有限公司），752紫外-可見光分光光度計(jì)（上海光譜儀器有限公司），ME204/02型分析天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]，TDZ4A-WA型離心機(jī)（湖南賽特湘儀離心機(jī)有限公司），HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋（國華電器有限公司），DHG-9140A型電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）。

1.1.3試劑。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品來自上?？道噬锟萍加邢薰荆黄咸烟莵碜灾袊称匪幤窓z定研究院；乙醇、氫氧化鈣、濃硫酸、苯酚、硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉等試劑均為分析純。

1.2方法

1.2.1多糖和黃酮的提取。

1.2.1.1超聲波法。

精確稱取干燥的桑葉粗粉50 g，加入85%乙醇超聲提取3次，每次1 h，過濾，合并提取液，用85%乙醇定容，即為桑葉黃酮的供試樣品液A。將殘?jiān)囊掖紦]干后，用水超聲提取3次，每次30 min，合并3次濾液，定容，即獲得多糖的供試樣品液B。

1.2.1.2堿水法。

精確稱取干燥的桑葉粗粉50 g，按20倍料液比加入pH為8的堿性Ca（OH）2溶液提取劑，浸泡24 h，超聲波提取2 h，過濾，殘?jiān)孟鄳?yīng)的提取劑洗滌，合并濾液，定容，離心沉淀20 min，上清液即為桑葉黃酮的供試樣品液C。精確稱取干燥的桑葉粗粉50 g，

按20倍料液比加入pH為8的堿性Ca（OH）2溶液提取劑，煎煮3 次，每次2 h，濾過，合并濾液，減壓濃縮，用95%乙醇過夜沉淀，取出后4 000 r/min離心分離15 min，棄去上清液，殘?jiān)盟芙?，定容，即獲得多糖的供試樣品液D。

1.2.1.3煎煮法。

精確稱取2份干燥的桑葉粗粉各50 g，20倍重量蒸餾水，沸水浴提取3次，每次2 h，合并3次濾液，減壓濃縮，其中一份為黃酮供試樣品液E，另一份加入10%三氯乙酸，靜置，離心，棄去沉淀繼續(xù)濃縮至一定體積，用95%乙醇過夜沉淀，取出后4 000 r/min離心分離15 min，棄去上清液，殘?jiān)盟芙?，定容，即獲得多糖的供試樣品液F。

1.2.2標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備。

1.2.2.1蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品于120 ℃干燥至恒重，準(zhǔn)確稱取15 mg，用60%乙醇溶解，置于100 mL容量瓶并定容，制成0.15 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

1.2.2.2葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品于105 ℃干燥至恒重，準(zhǔn)確稱取50 mg加水溶解，50 mL容量瓶中定容，搖勻，即得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

1.2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。

1.2.3.1黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。分別取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL于10 mL容量瓶中，加入5%亞硝酸鈉0.4 mL，放置6 min，加10%硝酸鋁0.4 mL，放置6 min，加4%氫氧化鈉4 mL，定容，搖勻，放置15 min，在510 nm處測定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)、總黃酮含量為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1），得回歸方程 Y=5.507 1X-0.004 2（R2=0.999 6）。

1.2.3.2葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。分別取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0 mL于50 mL容量瓶中，加水定容至刻度，各取1.0 mL于10 mL比色管中，分別加入5%苯酚溶液1.0 mL，加入5.0 mL濃硫酸，立即搖勻，沸水浴加熱10 min，冰水冷卻至室溫，在485 nm處測吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)、葡萄糖含量為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖2），得回歸方程Y=11.275 1X+0.004 6（R2=0.998 9）。

1.2.4樣品含量的測定。

1.2.4.1黃酮含量測定。準(zhǔn)確移取黃酮供試樣品液1.0 mL，置于25 mL容量瓶，用85%乙醇定容，再取2.0 mL定容至10 mL，用硝酸鋁顯色法顯色，測定吸光度，計(jì)算黃酮的含量。

1.2.4.2多糖含量測定。準(zhǔn)確移取多糖供試樣品液1.0 mL，置于25 mL容量瓶，用蒸餾水定容，用“1.2.3.2”方法測定吸光度，計(jì)算多糖的含量。

2結(jié)果與分析

從表1可以看出，超聲波法、堿水法、煎煮法3種方法提取黃酮和多糖時，超聲波法測得黃酮含量最高，為1.702%；煎煮法測得多糖含量最高，為2.437%；堿水法測得黃酮和多糖均為3種方法最低的，分別為0.846%和1.142%。張強(qiáng)等[10]利用超聲波法、索氏提取法、水煮法測桑葉黃酮和多糖得率，超聲波法均為最高，該試驗(yàn)黃酮得率結(jié)果與此一致，但多糖含量結(jié)果與此存在差異，有待于進(jìn)一步研究。陸廣富等[11]用水煮法，采取正交試驗(yàn)得出，當(dāng)加水量為25倍，煎煮時間2 h，煎煮3次為桑葉多糖水提最佳工藝，該試驗(yàn)采用20倍重量蒸餾水，沸水浴提取3次，每次2 h，在加水量上有所減少。而Samavati等[12]得出提取溫度越高、煎煮時間越長多糖得率越高的結(jié)論。薛淑萍等[13]在優(yōu)化桑葉中黃酮類化合物的提取工藝時認(rèn)為，超聲波法提取黃酮時間雖短，但所需溶劑量大，前期投入大，對設(shè)備的要求高，工業(yè)化大生產(chǎn)存在一定困難。實(shí)驗(yàn)室理論研究與工業(yè)化大生產(chǎn)存在差異，試驗(yàn)結(jié)果的應(yīng)用與推廣還需要在工業(yè)生產(chǎn)中進(jìn)一步驗(yàn)證。

3結(jié)論

采用超聲波提取法、堿水提取法和煎煮法3種方法提取桑葉中多糖和黃酮，利用分光光度計(jì)法測定桑葉中多糖和黃酮的含量。結(jié)果表明，超聲波法測得黃酮含量最高，為1.702%；煎煮法測得多糖含量最高，為2.437%；堿水法測得黃酮和多糖均為3種方法最低的。利用不同提取方法，桑葉中黃酮和多糖測定結(jié)果差異較大，黃酮測定用超聲波法效果最佳，多糖測定用煎煮法效果最佳。實(shí)驗(yàn)室理論研究與工業(yè)化大生產(chǎn)存在差異，試驗(yàn)結(jié)果的應(yīng)用與推廣還需要在工業(yè)生產(chǎn)中進(jìn)一步驗(yàn)證。

參考文獻(xiàn)

[1]

江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典（下冊） [M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1986.

[2] 鄒盛勤，陳武.桑葉的化學(xué)成分、藥理活性及應(yīng)用研究進(jìn)展[J].林產(chǎn)化工通訊，2003，37（1）：22-25.

[3] HOSSEINZADEH H，SADEGHI A.Antihyperglycemic effects of Morus nigra and Morus alba in mice[J].Pharm Pharmacol Lett，1999，9（2）：63-65.

[4] 包立軍，張劍韻，黃龍全.桑葉中抗凝血活性成分的初步分離與純化[J].蠶業(yè)科學(xué)，2006，32（2）：418-421.

[5] 周啟升，劉訓(xùn)理，段祖安.植物多糖的研究與開發(fā)應(yīng)用進(jìn)展[J].蠶業(yè)科學(xué)，2010，36（3）： 465-469.

[6] 侯瑞宏，廖森泰，劉凡，等.桑葉多糖對小鼠免疫調(diào)節(jié)作用的影響[J].食品科學(xué)，2011，32（13）：280-283.