王婷婷

摘要根據(jù)國(guó)內(nèi)外關(guān)于美國(guó)紅楓組織培養(yǎng)的研究，以及實(shí)際生產(chǎn)中的經(jīng)驗(yàn)系統(tǒng)闡述了美國(guó)紅楓組織培養(yǎng)體系建立的具體過(guò)程及研究進(jìn)展，并提出了存在的問(wèn)題及展望，為美國(guó)紅楓的大批量組培苗商業(yè)生產(chǎn)提供基礎(chǔ)資料。

關(guān)鍵詞美國(guó)紅楓；組織培養(yǎng)；組培苗

中圖分類號(hào)S723.1+32.6文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2017）11-0121-02

AbstractAccording to correlational research about tissue culture of Acer rubrum L. and experience in actual production，the specific process and research progress of tissue culture system were described systematically.It also put forward the existing problems and prospect to lay the foundation for the large quantities of A. rubrum L. seedlings commercial production.

Key wordsAcer rubrum L.；Tissue culture；Tissue culture seedling

美國(guó)紅楓（Acer rubrum L.）又名紅花槭，為槭樹(shù)科（Aceraceae）槭屬（Acer Linn.）一種重要的彩色觀葉類落葉喬木。美國(guó)紅楓的木材纖維非常短，做成的紙漿粗糙度適宜，是一種重要的造紙類木材[1]。美國(guó)紅楓生長(zhǎng)速度快，每年達(dá)0.6～1.0 m，壽命可達(dá)100年[2]。自十幾年前引進(jìn)我國(guó)以來(lái)，其以優(yōu)良的性狀以及廣泛的適應(yīng)性迅速在我國(guó)苗木市場(chǎng)占有一席之地。

美國(guó)紅楓傳統(tǒng)的繁殖方法主要有播種、扦插以及嫁接，但是相較于傳統(tǒng)的繁殖方法來(lái)說(shuō)，組織培養(yǎng)可以在短期內(nèi)獲得大批量的優(yōu)質(zhì)種苗，同時(shí)可以保持原有品種的優(yōu)良性狀。國(guó)外對(duì)于美國(guó)紅楓組培體系建立的研究比較早，最早為1986年Welsh對(duì)于美國(guó)紅楓品種‘Red Sunset的研究。美國(guó)紅楓引入我國(guó)的時(shí)間不是很長(zhǎng)，國(guó)內(nèi)學(xué)者對(duì)其研究相對(duì)較晚，集中在2005年以后，主要是利用帶芽莖段作為外植體，通過(guò)腋芽萌發(fā)的方式建立組培體系，也有部分學(xué)者利用愈傷組織途徑進(jìn)行擴(kuò)繁。筆者通過(guò)概述美國(guó)紅楓組織培養(yǎng)各個(gè)階段關(guān)鍵技術(shù)的研究進(jìn)展，以期為美國(guó)紅楓的大規(guī)模生產(chǎn)提供基礎(chǔ)資料。

1腋芽萌發(fā)方式

1.1外植體采集和消毒美國(guó)紅楓組培體系中最常用的外植體為帶芽莖段。帶芽莖段的類型以及取材時(shí)間對(duì)于消毒成功率影響很大。最容易消毒的外植體為當(dāng)年的實(shí)生苗，但是考慮到當(dāng)年實(shí)生苗萌芽時(shí)間長(zhǎng)以及萌芽率較低，綜合各因素考慮，選擇半木質(zhì)化莖段作為美國(guó)紅楓腋芽萌發(fā)的外植體最為合適[3]。另外，外植體消毒的難易程度也容易受到季節(jié)的影響，春季取材消毒效果最好[4]。

美國(guó)紅楓莖段外植體消毒通常先使用70%～75%乙醇浸潤(rùn)20～30 s[5]。之后使用無(wú)菌水沖洗3～4次，使用次氯酸鈉或者0.1%升汞溶液進(jìn)行后續(xù)消毒。當(dāng)使用次氯酸鈉溶液作為消毒試劑時(shí)，采用2%次氯酸鈉5～10 min或者1%次氯酸鈉溶液4 min最為適宜；當(dāng)使用0.1%升汞溶液作為消毒試劑時(shí)，最適宜的消毒時(shí)間為1～2 min，污染率為36.7%～433%。經(jīng)過(guò)短時(shí)間的升汞溶液消毒新芽能夠正常生長(zhǎng)，但長(zhǎng)時(shí)間的消毒處理會(huì)導(dǎo)致腋芽不易抽芽，新芽畸形。筆者在實(shí)際生產(chǎn)中發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于升汞而言，次氯酸鈉的消毒效果更加穩(wěn)定，且對(duì)于后續(xù)的腋芽萌發(fā)影響較小。當(dāng)使用紅楓的幼嫩莖段作為外植體時(shí)，利用2%次氯酸鈉溶液消毒15 min可以獲得最佳的消毒效果。

1.2外植體萌發(fā)

1.2.1外植體褐化。在對(duì)美國(guó)紅楓莖段進(jìn)行萌芽培養(yǎng)時(shí)發(fā)現(xiàn)，外植體普遍容易褐化。外植體褐化程度通常與品種特性以及所用外植體老嫩程度有關(guān)，改良美國(guó)紅楓的褐化率要明顯低于美國(guó)紅楓，嫩枝的褐化率要低于硬枝莖段。

在培養(yǎng)基中添加防褐化物質(zhì)以及在培養(yǎng)初期將外植體連續(xù)轉(zhuǎn)移至新鮮培養(yǎng)基會(huì)顯著減輕外植體的褐化情況。研究表明，用200 mg/L的VC與PVP處理外植體之后，褐化率明顯降低；在培養(yǎng)基中添加0.4%的活性炭，可降低褐化程度，但對(duì)抑制細(xì)菌污染沒(méi)有效果[6]；在培養(yǎng)基中分別加入1 g/L活性炭、10 mg/L硝酸銀、1 g/L PVP的處理，均對(duì)褐化有所抑制，但是如果在外植體培養(yǎng)初期每隔2 d轉(zhuǎn)移至新鮮培養(yǎng)基中，2～3次以后就可徹底去除褐化現(xiàn)象。

在實(shí)際生產(chǎn)中發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)初期將外植體避光培養(yǎng)7 d左右，且調(diào)低培養(yǎng)室的溫度至20 ℃可以明顯降低褐化率。在培養(yǎng)基中添加0.5g/L的活性炭同樣有較好的改善效果，但是要注意的是由于活性炭對(duì)培養(yǎng)基中的激素有一定的吸附作用，在添加活性炭的同時(shí)要適當(dāng)調(diào)高培養(yǎng)基中的激素濃度。

1.2.2萌芽培養(yǎng)基配方。美國(guó)紅楓外植體消毒成功之后需要在合適的萌芽培養(yǎng)基上進(jìn)行腋芽的誘導(dǎo)培養(yǎng)。一般在進(jìn)行美國(guó)紅楓外植體萌發(fā)時(shí)所用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為WPM、MS以及DKW，搭配使用細(xì)胞分裂素6-BA、TDZ、ZT和生長(zhǎng)素IBA、NAA進(jìn)行腋芽的誘導(dǎo)。

李源等[7]采用L16（45）正交試驗(yàn)，結(jié)果顯示以WPM作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加0.5 mg/L的IBA和2.0 mg/L的6-BA，萌芽率最高。羅煥榮[8]研究得到相似的結(jié)果。

宗樹(shù)斌[9]采用正交試驗(yàn)得出，MS培養(yǎng)基最有利于腋芽的萌發(fā)，最佳的培養(yǎng)基組合為MS+6-BA 0.6 mg/L+IAA 0.4 mg/L。利用6-BA、TDZ和IBA誘導(dǎo)腋芽萌發(fā)，結(jié)果顯示單獨(dú)以6-BA作為細(xì)胞分裂素，無(wú)菌芽并不分化，MS+6-BA 0.5 mg/L+TDZ 0.1～0.2 mg/L+IBA 0.2 mg/L為最適的誘導(dǎo)培養(yǎng)基。也有一些研究使用DKW作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，所用的萌芽培養(yǎng)基配方為DKW+TDZ 0.01～0.03 mg/L+6-BA 0.015～0.025 mg/L+AC 0.4～0.8 g/L[10]。

在實(shí)際生產(chǎn)中發(fā)現(xiàn)，MS培養(yǎng)基優(yōu)于WPM和DKW培養(yǎng)基。在WPM培養(yǎng)基中培養(yǎng)的組培苗瘦弱、生長(zhǎng)勢(shì)緩慢，可能是與WPM 培養(yǎng)基中較低的離子濃度有關(guān)。在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加0.01 mg/L的TDZ作為細(xì)胞分裂素，同時(shí)添加0.2～0.5 mg/L 6-BA可以明顯提高腋芽的萌動(dòng)比率。

1.3增殖培養(yǎng)增殖培養(yǎng)也叫繼代培養(yǎng)，是組培苗擴(kuò)大繁殖的重要步驟。培養(yǎng)基中激素的類型、濃度、比例是影響增殖效果的主要因素。

對(duì)于美國(guó)紅楓增殖培養(yǎng)基配方的研究主要集中在不同細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素的搭配使用上。TDZ作為一種新型的高效細(xì)胞分裂素，在木本類植物上應(yīng)用廣泛，尤其在槭樹(shù)科植物組培應(yīng)用上非常廣泛[11]。

在對(duì)美國(guó)紅楓增殖培養(yǎng)的研究中發(fā)現(xiàn)MS+6-BA 0.2 mg/L+TDZ 0.01 mg/L+IBA 0.2 mg/L為最適宜的增殖培養(yǎng)基，當(dāng)TDZ濃度高于0.05 mg/L時(shí)，組培苗玻璃化率大于50%。研究表明，0.001 mg/L的TDZ和0.4 mg/L的NAA組合培養(yǎng)基更適于美國(guó)紅楓組培苗的增殖，將組培苗放在MS+TDZ 0.005 mg/L+NAA 0.5 mg/L的培養(yǎng)基中，30 d繼代1次，增殖倍率可以達(dá)3.8倍。

筆者在紅楓組培苗實(shí)際研發(fā)生產(chǎn)過(guò)程中同樣發(fā)現(xiàn)，TDZ作為細(xì)胞分裂素對(duì)于紅楓苗的組培增殖作用最為關(guān)鍵。單獨(dú)使用BA作為細(xì)胞分裂素時(shí)，很低的濃度就會(huì)造成愈傷組織大量生長(zhǎng)以及植物玻璃化。而搭配使用低濃度的TDZ時(shí)，增殖出的小苗長(zhǎng)勢(shì)旺盛，玻璃化概率大為降低。

1.4生根培養(yǎng) 美國(guó)紅楓組培苗生根相對(duì)簡(jiǎn)單，在沒(méi)有添加生長(zhǎng)素的培養(yǎng)基中都可以生根，但在添加有IBA和NAA的培養(yǎng)基中，生根率高于空白培養(yǎng)基。一般美國(guó)紅楓組培苗生根培養(yǎng)基中所添加的生長(zhǎng)素為IBA，濃度為1～2 mg/L。在生根培養(yǎng)基中添加1～2 mg/L NAA，可以改善生根質(zhì)量，提高組培苗的移栽成活率。美國(guó)紅楓生根所用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基一般為MS、1/2MS以及WPM培養(yǎng)基，同時(shí)添加活性炭的生根培養(yǎng)基可以促進(jìn)組培苗生根，添加的最適宜濃度為1 mg/L。

2愈傷組織途徑

愈傷組織誘導(dǎo)途徑屬于器官的間接發(fā)生方式，通過(guò)愈傷組織發(fā)生方式進(jìn)行增殖可以得到更高的增殖倍率，同時(shí)變異系數(shù)高，容易選育出新的品種。在基因育種領(lǐng)域，愈傷組織對(duì)于遺傳轉(zhuǎn)化體系建立具有重要的作用。

2.1外植體的選擇 美國(guó)紅楓愈傷組織誘導(dǎo)所選用的外植體類型主要有嫩莖段、葉片以及種胚。嫩莖段在接入培養(yǎng)基中7 d左右出現(xiàn)粉紅色致密愈傷，同時(shí)愈傷組織生長(zhǎng)較快、質(zhì)量較好。葉片在接種后9～10 d出現(xiàn)嫩綠稍帶紅色的疏松愈傷。相比而言，莖段更適宜作為愈傷組織誘導(dǎo)的外植體。

2.2愈傷誘導(dǎo)及增殖培養(yǎng)基以美國(guó)紅楓莖段作為外植體時(shí)，愈傷組織非常容易進(jìn)行誘導(dǎo)生長(zhǎng)，而且美國(guó)紅楓的愈傷組織誘導(dǎo)一般需要使用較高濃度的細(xì)胞分裂素搭配使用生長(zhǎng)素進(jìn)行。王振龍等通過(guò)種胚誘導(dǎo)愈傷試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中低濃度的無(wú)機(jī)鹽離子更有利于愈傷組織的誘導(dǎo)，因此選用1/2MS作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基[12]。宗樹(shù)斌[9]利用正交試驗(yàn)得出最適宜的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為 WAP+6-BA 0.6 mg/L+IAA 0.3 mg/L。于傳[4]認(rèn)為美國(guó)紅楓愈傷組織誘導(dǎo)最佳方案為選擇莖段作為外植體，并放在WPM+NAA 0.7 mg/L+KT 0.6 mg/L+BA 0.4 mg/L培養(yǎng)基上。同時(shí)應(yīng)注意的是，美國(guó)紅楓愈傷組織的誘導(dǎo)需要光照，暗培養(yǎng)下的愈傷組織雖有少許可以增殖，但部分死亡。

初代培養(yǎng)中的愈傷組織一般需要在生長(zhǎng)30 d后轉(zhuǎn)入增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行繼代培養(yǎng)，所用的增殖培養(yǎng)基和誘導(dǎo)培養(yǎng)基相似。但是愈傷組織在繼代3次后很容易發(fā)生褐化而死亡，這可能與美國(guó)紅楓的基因型有關(guān)。

2.3愈傷分化在植物組織培養(yǎng)愈傷再生途徑中，愈傷組織的分化是建立組培體系的重要步驟之一，只有愈傷組織可以分化為芽，組培苗才得以進(jìn)一步擴(kuò)繁。但是筆者在進(jìn)行美國(guó)紅楓愈傷組織分化試驗(yàn)中，大部分結(jié)果顯示愈傷組織量不斷增大，但均未能分化誘導(dǎo)出芽。

如上所述，美國(guó)紅楓經(jīng)過(guò)愈傷組織分化階段進(jìn)行間接再生時(shí)，技術(shù)難度較高，主要困難在于愈傷組織分化成芽的能力較弱，需要進(jìn)一步研究。

3存在問(wèn)題和展望

美國(guó)紅楓莖段汁液豐富，在組織培養(yǎng)過(guò)程中極易褐化，如需大量的工廠化生產(chǎn)，仍需探索更好的防止褐化的標(biāo)準(zhǔn)化流程。同時(shí)，隨著繼代次數(shù)的增加，美國(guó)紅楓組培苗很容易出現(xiàn)玻璃化以及品種退化的現(xiàn)象，在大規(guī)模生產(chǎn)中，需要通過(guò)長(zhǎng)期多代的試驗(yàn)來(lái)確定穩(wěn)定的培養(yǎng)基配方。通過(guò)愈傷組織再生途徑很容易產(chǎn)生品種變異，是一種很好的新品種選育方式，目前的技術(shù)并不能使愈傷組織有效地分化為不定芽。因此，應(yīng)加大此方面的科研力度。

目前市場(chǎng)上存在的美國(guó)紅楓變種有很多，而大多數(shù)研究?jī)H是針對(duì)美國(guó)紅楓的原始種。不同變種的美國(guó)紅楓組織培養(yǎng)流程差異較大，在對(duì)美國(guó)紅楓組織培養(yǎng)進(jìn)行后續(xù)研究時(shí)，需要針對(duì)不同的品種進(jìn)行研究。同時(shí)，為了滿足工廠化生產(chǎn)要求，需要對(duì)組培技術(shù)的各個(gè)方面進(jìn)行改進(jìn)，以期將生產(chǎn)成本控制到最低。開(kāi)展美國(guó)紅楓愈傷組織誘變工作，培育具有優(yōu)良性狀的新品種，將美國(guó)紅楓組織培養(yǎng)技術(shù)應(yīng)用到工廠化生產(chǎn)中具有廣闊的前景。

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