楊豆豆，田茂琳，蘇滿春，萬瑞斌，王都留，陳海明

摘要：采用苯酚-硫酸法測(cè)定油橄欖葉多糖含量，優(yōu)化得出最佳測(cè)定條件為苯酚0.8 mL，硫酸4 mL，反應(yīng)溫度20 ℃，反應(yīng)時(shí)間10 min。加樣回收率為99.95%，測(cè)得油橄欖葉多糖含量為（12.064±0.265） mg/g。

關(guān)鍵詞：苯酚-硫酸法；多糖；油橄欖葉；測(cè)定

中圖分類號(hào)：TS201.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-1463（2017）11-0048-03

doi：10.3969/j.issn.1001-1463.2017.11.016

Study on Determination of Olive Leaf Polysaccharide Using Phenol Sulfuric Acid Method

YANG Doudou， TIAN Maolin， SU Manchun， WAN Ruibin， WANG Duliu， CHEN Haiming

（Longnan Normal College， Chengxian Gansu 742500， China）

Abstract：This paper established a phenol - sulfuric acid method for determining the method of olive leaf polysaccharide content， the result shows that the optimized result shows that： A2B1C1D1， namely the best conditions is phenol 0.8 mL， 4 mL of sulfuric acid， reaction temperature 20 ℃， the reaction time is 10 min. The recovery rate is 99.95%. The polysaccharide content is 12.064±0.265 mg/g.

Key words： Phenol sulfuric acid method；Polysaccharide；Olive leaf；Determination

油橄欖（Olea europaea L.）是一種原產(chǎn)于地中海沿岸的木犀科（Europaea）木犀欖屬（Olea）常綠喬木，與油棕、油茶和椰子并稱為世界四大木本油料作物。油橄欖主要分布在歐洲地中海沿岸國(guó)家和美國(guó)加州地區(qū)，自1956年起開始在我國(guó)引 種[1 ]。其果可以榨油，也可以加工成各種食品[2 ]。油橄欖葉中也含有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分及活性物質(zhì)，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，油橄欖葉提取物具有抗氧化、抗真菌、降血壓、降血脂等活性[1， 3 ]。油橄欖多糖具有抗氧化性和抑菌性等多種活性[4 ]，屬于植物多糖，國(guó)內(nèi)外已有相關(guān)的專家對(duì)其做了研究，但主要研究其生理活性及提取方法，對(duì)其含量的測(cè)定報(bào)道較少。我們利用苯酚-硫酸法測(cè)定了油橄欖多糖含量，優(yōu)化了各個(gè)測(cè)定條件及方法，建立了油橄欖多糖含量的測(cè)定方法，可為以后相關(guān)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料與試劑

供試油橄欖葉采自隴南師范高等專科學(xué)校智能溫室大棚（春季生長(zhǎng)的新葉）。苯酚分析純由上海埃彼化學(xué)試劑有限公司提供；濃硫酸（分析純，98%），由天津紅巖試劑廠提供；無水乙醇（分析純，98%），由天津紅巖試劑廠提供；葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品（純度 > 99%），由西安匯林生物科技有限公司提供。

1.2 主要儀器與設(shè)備

包括量筒、溫度計(jì)、電子分析天平（德國(guó)賽多利斯）、電熱恒溫干燥箱（由陜西欣鵬教育科技有限公司提供）、紫外分光光度計(jì)（Thermo Scientific GENESYS 10S）、不銹鋼粉碎機(jī)、120目篩子、50 mL玻璃刻度試管、數(shù)控恒溫水浴鍋（由陜西欣鵬教育科技有限公司提供）、渦旋混合器、貝克曼高速離心機(jī)。

2 方法

2.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)采用L9 34正交設(shè)計(jì)，吸取1.0 mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。各因素與水平見表1，處理組合見 表2。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 油橄欖葉前處理 鮮葉采摘后用自來水沖洗干凈表面的泥土后，放入烘箱中60 ℃烘干至恒重，用不銹鋼粉碎機(jī)粉碎，過120目篩，存于-18 ℃冰箱待用。

2.2.2 油橄欖葉多糖提取 參照中華人民共和國(guó)出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN/T 4260-2015《出口植物源食品中粗多糖的測(cè)定 苯酚-硫酸法》[5 ]。稱取樣品0.200 0 g于50 mL具賽離心管中，用5 mL蒸餾水浸濕樣品，緩慢加入20 mL無水乙醇，同時(shí)用渦旋混合器震搖，置120W超聲波提取器中提取30 min。提取結(jié)束后，在4 000 r/min的條件下離心10 min，棄去上清液。不溶物用10 mL 80%乙醇溶液洗滌、離心。將不溶物轉(zhuǎn)移到圓底燒瓶中，加入50 mL蒸餾水，于120W超聲波提取器中提取30 min，重復(fù)2次，冷卻至室溫，過濾，將上清液轉(zhuǎn)移至200 mL容量瓶中，殘?jiān)礈?～3次，定容。此樣品液為測(cè)定液。

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 將烘干至恒重的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)樣品準(zhǔn)確稱取0.100 0 g配制成100 mg/L的母液。分別用吸量管準(zhǔn)確吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL的母液于20 mL具塞玻璃試管中，用蒸餾水補(bǔ)足至1 mL，再分別按照實(shí)驗(yàn)優(yōu)化所得的苯酚、硫酸加入量、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。反應(yīng)結(jié)束后于490 nm處用紫外分光光度計(jì)測(cè)定吸光值。所得數(shù)據(jù)利用Excel做標(biāo)準(zhǔn)曲 線。

2.4 樣品測(cè)定

吸取樣品液1.0 mL于20 mL具塞試管中，然后按2.2.3操作方法讓其發(fā)生顯色反應(yīng)，并在490 nm處測(cè)定吸光值。

2.5 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與數(shù)據(jù)處理工具

樣品中的含糖量=（m1×v1）×0.9×10-4/（m2×v2）

式中，m1是從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的含糖量，單位為ug；v1是樣品定容體積，單位為mL；v2是比色測(cè)定時(shí)所取的樣液的體積，單位為mL；m2是樣品稱取質(zhì)量，單位為g；0.9是葡萄糖換算成葡聚糖的換算系數(shù)。

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)軟件為正交設(shè)計(jì)助手3.1（共享版）。

3 結(jié)果與分析

3.1 測(cè)定條件的優(yōu)化

根據(jù)表3所列的條件測(cè)定所得吸光值可知，苯酚硫酸法測(cè)定油橄欖葉多糖的最佳條件組合為：A2B1C1D1，即苯酚0.8 mL，硫酸4 mL，反應(yīng)溫度20 ℃，反應(yīng)時(shí)間10 min。測(cè)得的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。對(duì)本測(cè)定條件進(jìn)行了加樣回收率測(cè)定，如表4所示。實(shí)驗(yàn)測(cè)得的加樣回收率為99.95%。

3.2 橄欖葉多糖含量的測(cè)定

橄欖葉多糖含量的測(cè)定結(jié)果見表5。根據(jù)計(jì)算結(jié)果和對(duì)照葡萄糖標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)得油橄欖葉多糖含量為（12.064±0.265） mg/g。

4 結(jié)論

研究表明，采用苯酚-硫酸法測(cè)定油橄欖葉多糖含量最佳條件為苯酚0.8 mL，硫酸4 mL，反應(yīng)溫度20 ℃，反應(yīng)時(shí)間10 min。加樣回收率為99.95%。測(cè)得油橄欖葉多糖含量為12.064±0.265 mg/g。

參考文獻(xiàn)：

[1] 鄭媛媛，李 辰，封士蘭，等. 油橄欖葉中總黃酮含量測(cè)定方法探討[J]. 光譜學(xué)與光譜分析，2011（2）：547-550.

[2] 祁菲菲. 油橄欖葉食用歷史和保健功能研究進(jìn)展綜述[G]//中國(guó)營(yíng)養(yǎng)學(xué)會(huì). 中國(guó)營(yíng)養(yǎng)學(xué)會(huì)第十一次全國(guó)營(yíng)養(yǎng)科學(xué)大會(huì)暨國(guó)際DRIs研討會(huì)學(xué)術(shù)報(bào)告及論文摘要匯編（下冊(cè)）-DRIs新進(jìn)展：循證營(yíng)養(yǎng)科學(xué)與實(shí)踐學(xué)術(shù). 北京：中國(guó)營(yíng)養(yǎng)學(xué)會(huì)，2013.

[3] 葉建中，王成章，陳虹霞，等. 油橄欖葉中羥基酪醇的含量變化規(guī)律研究[J]. 林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè)，2011（2）：69-74.

[4] 李陳燊. 橄欖多糖提取分離及其功能特性的研究[D]. 福州：福建農(nóng)林大學(xué)，2014.

[5] 中華人民共和國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局. SN/T 4260-2015，出口植物源食品中粗多糖的測(cè)定 苯酚-硫酸法[S]. 北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2016.

（本文責(zé)編：楊 杰）