南竹 曹博恒

摘要[目的]利用乳酸菌發(fā)酵菠蘿皮渣制備菠蘿皮渣酵素。[方法]以蛋白酶活性為指標(biāo)，運(yùn)用Box-Behnken Design 8.0.5v響應(yīng)面法優(yōu)化制作菠蘿皮渣酵素的工藝參數(shù)。[結(jié)果]菠蘿皮渣酵素制備的最佳工藝條件為發(fā)酵溫度23 ℃，酵母菌接種量0.3%，發(fā)酵時(shí)間16.5 h。按上述工藝制得的菠蘿皮渣酵素顏色均勻，酸甜適口并伴有發(fā)酵香味，有光澤。[結(jié)論]研究可為菠蘿副產(chǎn)物的綜合開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞菠蘿皮渣；酵素；響應(yīng)面法；發(fā)酵

中圖分類號(hào)TS255文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2017）20-0098-03

Abstract[Objective] Preparation of pineapple peel enzyme by fermentation of pineapple peel with lactic acid bacteria .[Method]The process parameters of pineapple peel were optimized by BoxBehnken Design 8.0.5v response surface method using protease activity as an index.[Result] The optimum conditions were as follows： the fermentation temperature was 23 ℃， the inoculation amount of yeast was 0.3%， the fermentation time was 16.5 h.According to the above process made of pineapple skin residue enzyme color uniform， sweet and sour taste and accompanied by fermentation fragrance， shiny.[Conclusion] The study can provide a theoretical basis for the comprehensive utilization of pineapple byproducts.

Key wordsPineapple peel；Enzyme；Response surface method；Fermentation

菠蘿皮渣是菠蘿鮮食或生產(chǎn)加工后的副產(chǎn)物，約占全果重量的50%。研究顯示，菠蘿皮渣中的營(yíng)養(yǎng)成分比例與果肉相差并不多[1]。目前菠蘿生產(chǎn)過(guò)程中產(chǎn)生的皮渣多被廢棄，不僅污染環(huán)境，同時(shí)浪費(fèi)了大量的生物資源。如果對(duì)菠蘿皮渣進(jìn)一步加工制成菠蘿皮渣酵素，它的經(jīng)濟(jì)價(jià)值會(huì)大大提高，并且可為菠蘿副產(chǎn)物的綜合利用開(kāi)辟新的途徑。

酵素又稱作酶，是一種具有催化作用的大分子物質(zhì)，深受日本及我國(guó)臺(tái)灣地區(qū)人民喜愛(ài)的一種植物功能食品。酵素中含有豐富的礦物質(zhì)、維生素、低聚糖、多酚、黃酮、酶和次生代謝產(chǎn)物等營(yíng)養(yǎng)成分，具有美白抗氧化、抗菌消炎、潤(rùn)腸通便、解酒護(hù)肝、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、修復(fù)機(jī)體損傷等保健功能[2-5]。但目前國(guó)內(nèi)關(guān)于菠蘿酵素的介紹和研究并不多見(jiàn)。筆者以加工生產(chǎn)后的廢棄物菠蘿皮渣為原料，利用酵母菌發(fā)酵制備菠蘿皮渣酵素，探究制備的工藝條件，為菠蘿的副產(chǎn)物綜合利用以及以后的規(guī)模化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1原料與主要試劑。

菠蘿皮渣，購(gòu)置于農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)，低溫保存；果酒專用酵母，安琪酵母股份有限公司；乳酸菌，錦州醫(yī)科大學(xué)醫(yī)療學(xué)院形態(tài)實(shí)驗(yàn)中心。

1.1.2儀器設(shè)備。

CR21G高速冷凍離心機(jī)，日本日立公司；泰光 906200 手持式折光儀，河北潤(rùn)聯(lián)科技開(kāi)發(fā)有限公司；TU-1810 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；HZP-250 型全溫振蕩培養(yǎng)箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；血球計(jì)數(shù)板，上海市求精生化試劑儀器有限公司；真空冷凍干燥機(jī)，沈陽(yáng)航天新陽(yáng)速凍設(shè)備制造有限公司。

1.2工藝流程

菠蘿皮渣→酶解→滅菌→接種+酵母菌發(fā)酵→濃縮→真空冷凍干燥→菠蘿皮渣酵素→包裝。

1.3操作要點(diǎn)

1.3.1酶解。將菠蘿皮渣用果膠酶及纖維素酶進(jìn)行酶解，水解后生成了便于吸收和利用的小分子糖類[6-7]。酶解工藝條件如下：pH 4.5，料液比1∶5（g∶mL），溫度為 55 ℃，酶解時(shí)間160 min。加酶量為纖維素加酶量1.5%，果膠酶加酶量1.0%。菠蘿皮渣酶解率為63.50%，可溶性固形物含量為6.23%。

1.3.2

酵母菌的活化和培養(yǎng)。用0.5 mL的生理鹽水溶解酵母菌粉，使菌體溶解成懸浮液狀態(tài)，然后將菌液在YPD培養(yǎng)基上進(jìn)行涂布，在30 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2～3 d。菌種經(jīng)過(guò)冷凍干燥后，生長(zhǎng)延遲期較長(zhǎng)，故需經(jīng)過(guò)2次繼代培養(yǎng)，菌液待用[8]。

1.3.3發(fā)酵液的制備。

將酶解液濃縮至可溶性固形物含量為25%[9]，適量補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。

1.3.4接種和發(fā)酵。設(shè)置溫度26 ℃，pH 5.0條件下，接種0.3%酵母菌到發(fā)酵液，酵母菌初始活菌數(shù)為3.28×105 CFU/mL左右，發(fā)酵20 h。最后保持溫度在18～20 ℃，靜置24 h，進(jìn)行后發(fā)酵，使發(fā)酵液產(chǎn)香[10]。

1.3.5真空冷凍干燥。

將發(fā)酵液可溶性固形物含量濃縮到45%，通過(guò)真空冷凍干燥得到水分含量小于4%的菠蘿皮渣酵素粉。在冷凍溫度為-20 ℃，真空度為10～20 Pa，冷阱溫度為-45 ℃的條件下進(jìn)行真空冷凍干燥[11]。

1.4酵母菌發(fā)酵單因素試驗(yàn)

1.4.1發(fā)酵溫度的確定。

發(fā)酵溫度的高低會(huì)直接影響酵母菌的生長(zhǎng)繁殖和發(fā)酵產(chǎn)物的生成。菠蘿皮渣發(fā)酵液要充分溶氧，并設(shè)置酵母菌接種量0.3%，分別在20、22、24、26、28 ℃下進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵時(shí)間20 h。發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定蛋白酶活性，以確定最適的酵母菌發(fā)酵溫度。

1.4.2起始pH的確定。

菠蘿發(fā)酵液自身的pH在4.6左右，試驗(yàn)用到的葡萄酒酵母在微酸性環(huán)境下適宜生長(zhǎng)。菠蘿皮渣發(fā)酵液在充分溶氧的條件下，控制發(fā)酵溫度為24 ℃，酵母菌接種量為0.3%，用CaCO3調(diào)節(jié)發(fā)酵液酸度，使pH分別在4.8、5.0、5.2、5.4、5.6 條件下進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵時(shí)間為20 h。發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定蛋白酶活性，以確定最適的發(fā)酵起始pH。

1.4.3接種量的確定。

發(fā)酵液發(fā)酵的速度會(huì)隨著接種量的不同而變化，并進(jìn)一步影響了發(fā)酵產(chǎn)物的品質(zhì)。菠蘿皮渣發(fā)酵液在充分溶氧的條件下，控制發(fā)酵溫度為24 ℃，pH為5.2，分別接種0.20%、0.25%、0.30%、0.35%、0.40%酵母菌進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵時(shí)間為20 h。發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定蛋白酶活性，以確定最適的酵母菌接種量。

1.4.4發(fā)酵時(shí)間的確定。

菠蘿皮渣發(fā)酵液在充分溶氧的條件下，控制發(fā)酵溫度為24 ℃，酵母菌接種量為0.3%，pH為5.2，發(fā)酵時(shí)間分別設(shè)置為10、15、20、25、30 h。發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定蛋白酶活性，以確定最適的發(fā)酵時(shí)間。

1.5響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，選取對(duì)酵母菌發(fā)酵有顯著影響的3個(gè)因素，發(fā)酵溫度（A）、酵母菌接種量（B）和發(fā)酵時(shí)間（C）為自變量，以蛋白酶活性為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)3因素3水平試驗(yàn)，確定最佳參數(shù)進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)（表1）。

2結(jié)果與分析

2.1酵母菌發(fā)酵單因素試驗(yàn)

2.1.1發(fā)酵溫度對(duì)蛋白酶活性的影響。由圖 1 可知，發(fā)酵溫度在20～24 ℃范圍內(nèi)的時(shí)候，蛋白酶的活性隨著溫度的升高而升高，在24 ℃時(shí)達(dá)到最大值。當(dāng)溫度超過(guò)24 ℃后，蛋白酶的活性明顯降低。所以選擇發(fā)酵溫度在24 ℃最適宜。

2.1.2

起始pH對(duì)蛋白酶活性的影響。由圖2可知，隨著pH的升高，蛋白酶的活性逐漸升高，當(dāng)pH超過(guò)5.2后，隨著pH的升高，蛋白酶活性逐漸降低?？赡苁怯捎谌芤黑呌谥行裕种屏私湍妇陌l(fā)酵作用。起始pH為5.2時(shí)，蛋白酶活性達(dá)到最大值 2 535.70 U/g，所以確定該酵母的最適起始pH為5.2。

2.1.3

接種量對(duì)蛋白酶活性的影響。由圖3可知，酵母菌的接種量在0.20%～0.25%時(shí)，蛋白酶的活性迅速升高，在0.25%時(shí)達(dá)到最高點(diǎn)，蛋白酶的活性為2 582.30 U/g。當(dāng)接種量超過(guò)0.25%后，蛋白酶活性基本保持不變并略有降低。綜合考慮實(shí)際生產(chǎn)及經(jīng)濟(jì)等因素，選擇酵母菌的最適宜接種量為0.25%。

2.1.4發(fā)酵時(shí)間對(duì)蛋白酶活性的影響。由圖4可知，蛋白酶的活性隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，但到15 h后，蛋白酶活性增長(zhǎng)的速度并不明顯，所以將發(fā)酵時(shí)間選在15 h比較適宜。

2.2酵母菌發(fā)酵工藝條件優(yōu)化

2.2.1響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果。該試驗(yàn)采用Design-Expert 8.0.5v進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)，獲得的結(jié)果詳見(jiàn)表2，對(duì)表2進(jìn)行回歸分析，得到回歸方程：Y=521.18-34.68A+7.53B- 83.03C+18.83AB+34.72AC+15.81BC-60.48A2-64.39B2-70.90C2。

2.2.2響應(yīng)面分析與方差分析結(jié)果。

圖5、6、7分別表示的是兩兩因素的交互作用對(duì)蛋白酶活性的影響。如圖5所示，隨著發(fā)酵溫度的升高及酵母菌接種量的增大，蛋白酶活性都是先升高后降低，兩者交互作用使蛋白酶的活性達(dá)到最大值為2 485.30 U/g；如圖6所示，發(fā)酵溫度與發(fā)酵時(shí)間兩者交互作用的最大值達(dá)2 452.70 U/g；由圖7可知，酵母菌接種量和發(fā)酵時(shí)間對(duì)蛋白酶活性的影響都較大，兩者交互影響蛋白酶活性的最大值達(dá)2 558.20 U/g。通過(guò)軟件分析，得到菠蘿皮渣酵素發(fā)酵的最佳工藝是發(fā)酵溫度22.98 ℃，酵母菌接種量0.29%，發(fā)酵時(shí)間16.39 h，考慮到實(shí)際生產(chǎn)的需要及可操作性，修正其工藝條件為發(fā)酵溫度為23 ℃，酵母菌接種量為0.3%，發(fā)酵時(shí)間為16.5 h，重復(fù)試驗(yàn)3次，得到蛋白酶活性分別為2 549.70、2 543.60和2 547.10 U/g，其平均值為2 546.80 U/g，與模型的預(yù)測(cè)值2 559.60 U/g較為接近，說(shuō)明該模型對(duì)菠蘿皮渣酵素制備的預(yù)測(cè)具有實(shí)際意義。

2.3真空冷凍干燥制備菠蘿皮渣酵素產(chǎn)品質(zhì)量指標(biāo)

試驗(yàn)制得的產(chǎn)品質(zhì)量各指標(biāo)如下：①色澤：顏色均一的淡黃色。

②氣味：菠蘿特有的酸甜果香味及發(fā)酵香味。③酸度：酸甜適口。④組織形態(tài)：松散無(wú)結(jié)塊。

3結(jié)論

該試驗(yàn)選用菠蘿加工后的廢棄皮渣為原料，利用乳酸菌進(jìn)行發(fā)酵制備酵素，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)進(jìn)行試驗(yàn)并分析數(shù)據(jù)，再結(jié)合實(shí)際操作情況，獲得制備菠蘿皮渣酵素的工藝條件為發(fā)酵溫度23 ℃，酵母菌接種量0.3%，發(fā)酵時(shí)間16.5 h，在此條件下，制得的菠蘿皮渣酵素顏色均勻，酸甜適口并伴有發(fā)酵香味，蛋白酶活性為2 546.80 U/g。該試驗(yàn)結(jié)果可以為規(guī)?；a(chǎn)及功能性產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)，其理化性質(zhì)及穩(wěn)定性有待進(jìn)一步研究。

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