王興吉 劉文龍 郭慶亮 張杰

摘要[目的]研究茂源鏈霉菌LD195產(chǎn)TGase的最佳發(fā)酵工藝條件，并探討TGase的酶學(xué)特性。[方法]采用L9（34）正交試驗(yàn)對產(chǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的茂源鏈霉菌菌株培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化。[結(jié)果]最佳無機(jī)鹽配方為Na2HPO4 2.0 g/L，MgSO4·7H2O 1.5 g/L，KH2PO4 2.5 g/L，CaCl2 3.0 g/L，最佳培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度30 ℃，裝液量25 mL，搖床轉(zhuǎn)速200 r/min，接種量10%。該谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的最適反應(yīng)溫度為50 ℃，在40～60 ℃條件下保溫30 min酶活基本沒有損失；最適反應(yīng)pH為6.0，在pH為5.0～7.0條件下保存30 min仍具有85%以上酶活；同時(shí)Fe3+、Cu2+ 、Zn2+會(huì)強(qiáng)烈抑制酶的活性。[結(jié)論]茂源鏈霉菌LD195產(chǎn)TGase具有良好的耐酸性和耐熱性，在商業(yè)化生產(chǎn)中具有廣闊前景。

關(guān)鍵詞培養(yǎng)基；茂源鏈霉菌；谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶；酶學(xué)性質(zhì)

中圖分類號S188文獻(xiàn)標(biāo)識碼

A文章編號0517-6611（2017）32-0161-04

Fermentation Process Optimization of Transglutaminase and Its Enzymatic Properties

WANG Xingji，LIU Wenlong*，GUO Qingliang et al（Shandong Long Kete Enzyme Co.，Ltd.，Shandong Province Key Laboratory of Enzyme Preparation Fermentation Technology ，Linyi，Shandong 276400）

Abstract[Objective]To investigate the optimum fermentation conditions of TGase produced by Streptomyces lanceolata LD195 and explore the enzymatic properties of TGase.[Method] L9（34） orthogonal design on media and culture conditions of Streptomyces lanceolata were optimized.[Result]The best medium： Na2HPO4 2.0 g/L，MgSO4·7H2O 1.5 g/L，KH2PO4 2.5 g/L，CaCl2 3.0 g/L.The optimal culture conditions： culture temperature 30 ℃，bottling capacity 25 mL，agitation rate 200 r/min，inoculums size 10%.The produced TGase exhibited optimum activity at 50 ℃ and pH 6.0.It was stably incubated in 40～60 ℃ for 30 min and the remained enzyme activity was above 85% dealed with pH 5.0～7.0 for 30 min.The enzyme was strongly inactivated by Fe3+，Cu2+，Zn2+.[Conclusion]TGase produced by Streptomyces lanceolata LD195 has good acid resistance and heat resistance，and which has broad prospects in commercial production.

Key wordsMedium； Streptomyces lanceolata；Transglutaminase；Enzymatic properties

谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶（Transglutaminase.EC2.3.2.13，TGase），又稱轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶（TGase），是一種催化?；D(zhuǎn)移反應(yīng)的轉(zhuǎn)移酶，是由331個(gè)氨基組成的分子量約38 000的具有活性中心的單體蛋白質(zhì)，可催化蛋白質(zhì)多肽發(fā)生分子內(nèi)和分子間共價(jià)交聯(lián)[1-2]，從而改善蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，影響蛋白質(zhì)的性質(zhì)，如發(fā)泡性、乳化性、乳化穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性、保水性和凝膠能力等，進(jìn)而改善食品的風(fēng)味、口感、質(zhì)地和外觀等，目前已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)。但由于其生產(chǎn)成本過高，嚴(yán)重限制了該酶的推廣及使用[3]。

微生物來源的TGase（Microbial transglutaminase，MTG）主要來自于芽孢桿菌屬（Bacillus spp.）和鏈霉菌屬（Streptomyces spp.）。從茂源鏈輪絲菌（Streptomyces mobaraensis）中分離得到的TGase，酶分子量為37.9 kD，由331個(gè)氨基酸組成，活性中心含有1個(gè)半胱氨酸殘基，活性不依賴鈣離子[4]。此外，研究者在Streptomyces hygroscopic[5]、Streptomyces griseoverticillatumt[6]、Bacillus circulans[7]、Streptomyces libani[8]及Bacillus subtilis[9]等微生物中也發(fā)現(xiàn)了TGase的存在，并且進(jìn)行了酶純化、發(fā)酵工藝優(yōu)化、基因工程表達(dá)等相關(guān)研究， 取得了一定成果。目前僅S.mobaraensis來源的TGase實(shí)現(xiàn)了商業(yè)化生產(chǎn)，其他微生物仍處于研究階段。該研究探討了茂源鏈霉菌產(chǎn)TGase的最佳發(fā)酵工藝條件，分析了TGase的酶學(xué)特性，以期為TGase的商業(yè)化生產(chǎn)提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1菌株

茂源鏈霉菌為山東隆科特酶制劑有限公司山東省酶制劑生物發(fā)酵技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室篩選保藏菌種（Streptomyces lanceolata），命名為LD195。

1.2培養(yǎng)基及其優(yōu)化

1.2.1基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

1.2.1.1斜面培養(yǎng)基。麥芽粉3 g/L，酵母膏4 g/L，葡萄糖4 g/L，瓊脂粉15 g/L，pH 7.0。

1.2.1.2種子培養(yǎng)基。葡萄糖30 g/L，酵母膏5 g/L，蛋白胨20 g/L，大豆粉15 g/L，磷酸氫二鈉2.0 g/L，磷酸二氫鉀2.5 g/L，硫酸鎂1.0 g/L，氯化鈣5.0 g/L，pH 7.0。

1.2.1.3發(fā)酵培養(yǎng)基。葡萄糖30 g/L，酵母膏5 g/L，蛋白胨20 g/L，大豆粉15 g/L，磷酸氫二鈉2.0 g/L，磷酸二氫鉀2.5 g/L，硫酸鎂1.5 g/L，氯化鈣3.0 g/L，pH 7.0。

1.2.1.4孢子萌發(fā)培養(yǎng)基。2×YT培養(yǎng)基。

1.2.2無機(jī)鹽優(yōu)化的正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)。選用L9（34）正交表，對“1.2.1”基礎(chǔ)培養(yǎng)基的無機(jī)鹽進(jìn)行正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)，以找出菌體發(fā)酵最好的優(yōu)化培養(yǎng)基，試驗(yàn)因素及水平見表1。

1.3培養(yǎng)方法及培養(yǎng)條件的優(yōu)化

1.3.1培養(yǎng)方法。

1.3.1.1斜面種子培養(yǎng)。試管種子32 ℃恒溫培養(yǎng)7 d。

1.3.1.2搖瓶種子培養(yǎng)。取1環(huán)生長好的斜面培養(yǎng)物，接種至裝有100 mL種子培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，30 ℃、200 r/min培養(yǎng)24 h。

1.3.1.3搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)。按接種量10%將種子液接種于裝有25 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，30 ℃、200 r/min培養(yǎng)45 h。

1.3.2培養(yǎng)條件優(yōu)化的正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)。

選用L9（34）正交表，對“1.3.1”中培養(yǎng)條件進(jìn)行一次正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)，以找出菌體發(fā)酵最好的培養(yǎng)條件，試驗(yàn)因素及水平見表2。

1.4酶活測定方法

比色法測定酶活[10-11]：以α-NA-CBZ-GLN-GLY為作用底物，L-谷氨酸-γ-單羥胺酸（L-glutamic acid γ-monohydroxamate）做標(biāo)準(zhǔn)曲線。1個(gè)單位 TGase的酶活為1 min催化生成1 μmol L-谷氨酸-γ-單羥胺酸的酶量（U/mL）。

酶活測定條件：37 ℃條件下反應(yīng)10 min。試劑A：將100 mg底物α-NA-CBZ-GLN-GLY完全溶解于2 mL 0.2 mol/L NaOH中，依次加入4 mL 0.2 mol/L pH6.0的Tris（三羥甲基氨基甲烷）-HCl緩沖液、2 mL 0.1 mol/L鹽酸羥胺、2 mL 0.01 mol/L還原型谷胱甘肽，用NaOH固體調(diào)pH至6.0。

試劑B：3 mol/L HCl、12% TCA、5% FeCl3·6H2O這3種試劑以1∶1∶1混合配制。

準(zhǔn)備0～12 μmol/mL的L-谷氨酸-γ-單羥胺酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，取40 μL標(biāo)準(zhǔn)溶液于1.5 mL EP管中，加100 μL試劑A，7 ℃保溫10 min，加入40 μL試劑B終止反應(yīng)。在吸光度525 nm下進(jìn)行比色，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。以100 ℃加熱10 min后離心的上清液作為空白。

1.5TGase的酶學(xué)性質(zhì)測定

1.5.1TGase反應(yīng)的最適溫度。通過離子交換層析、凝膠過濾等方法，純化谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶，對其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行測定。

將純化后的酶液在pH5.0條件下，分別放置于20、30、40、50、60、70 ℃保溫30 min測定酶活，以處理前酶液的酶活為100%，得到相對酶活，從而確定最適反應(yīng)溫度。

1.5.2TGase反應(yīng)的最適pH。將酶反應(yīng)底物分別溶于pH為3.0～5.0的50 mmol/L的醋酸緩沖液，pH為6.0～9.0的50 mmol/L Tris-鹽酸緩沖液中，設(shè)置pH 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0共7個(gè)梯度；將純化后的酶液經(jīng)pH為3.0～5.0的50 mmol/L的醋酸緩沖液，pH為6.0～9.0的50 mmol/L Tris-鹽酸緩沖液處理，分別在50 ℃下放置30 min，與相應(yīng)的pH底物混合后測定酶活，以處理前酶液的酶活為100%，得到相對酶活。

1.5.3金屬離子對TGase酶活的影響。

將純化后的酶液分別加入一定濃度（5 mmol/L）的各種金屬離子，在37 ℃下保溫30 min，測定添加不同金屬離子后的殘余酶活，以不經(jīng)處理的酶液的酶活為100%，得到相對酶活。

2結(jié)果與分析

2.1優(yōu)化培養(yǎng)基正交試驗(yàn)結(jié)果分析

從表3可以看出，正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)中4因素對菌體發(fā)酵無特別明顯影響，由極差分析比較結(jié)果可知，該試驗(yàn)中4因素的相對影響順序由大到小為Na2HPO4、MgSO4·7H2O、KH2PO4、CaCl2，即菌體發(fā)酵產(chǎn)酶的最高組合為A2B2C3D2，即菌體發(fā)酵產(chǎn)酶最高的無機(jī)鹽組合為Na2HPO4 2.0 g/L、MgSO4·7H2O 1.5 g/L、KH2PO4 2.5 g/L、CaCl2 3.0 g/L。

同時(shí)，通過正交試驗(yàn)可以看出菌體對鈣離子的依賴性不強(qiáng)，微生物來源的TGase（MTG）不依賴于鈣離子的存在，與動(dòng)植物來源的TGase完全不同[12]。動(dòng)物來源的TGase分子量不等，需要鈣離子激活，酶活性中心為半胱氨酸殘基位點(diǎn)。動(dòng)物來源的TGase以豚鼠肝臟的TGase（GTG）研究最為深入，該酶的分子量為90 kD，其酶促反應(yīng)需要鈣離子激活，對底物特異性強(qiáng)[13]。MTG對鈣離子的依賴性和底物特異性都低，因此對鈣離子的需求較少，正交試驗(yàn)中鈣離子的影響較小也驗(yàn)證了這一點(diǎn)。

2.2培養(yǎng)條件優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果分析

從表4可以看出，A2B2C3D1為最優(yōu)組合，即培養(yǎng)溫度30 ℃，裝液量為25 mL，搖床轉(zhuǎn)速為200 r/min，接種量為10%時(shí)，菌體發(fā)酵產(chǎn)酶最好。同時(shí)，由極差分析比較可以看出培養(yǎng)條件對菌體產(chǎn)酶影響的主次順序?yàn)榕囵B(yǎng)溫度、接種量、裝液量、搖床轉(zhuǎn)速。培養(yǎng)溫度對菌體生長影響最大，由于選擇搖床轉(zhuǎn)速幅度較小，其對菌體生長影響較小。

2.3酶學(xué)性質(zhì)

2.3.1TGase反應(yīng)的最適溫度及熱穩(wěn)定性。將純化后的酶液分別放置在20、30、40、50、60、70 ℃進(jìn)行酶活測定。由圖2可知，50 ℃時(shí)，TGase相對酶活最高，接近100%，該酶的最適反應(yīng)溫度為50 ℃左右。在40～60 ℃時(shí)，相對酶活為75%以上，說明在此溫度范圍內(nèi)，該酶比較穩(wěn)定。

45卷32期王興吉等谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶發(fā)酵工藝優(yōu)化及其酶學(xué)性質(zhì)

2.3.2TGase反應(yīng)的最適pH及穩(wěn)定性。

將酶反應(yīng)底物分別溶于pH為3.0～5.0的50 mmol/L的醋酸緩沖液，pH為6.0～9.0的50 mmol/L Tris-鹽酸緩沖液中，測定酶在不同pH下的酶活。由圖3可知，TGase的最適反應(yīng)pH為6.0左右。TGase在不同pH下50 ℃放置30 min后，酶在pH為5.0～7.0時(shí)較穩(wěn)定，相對酶活為85%以上，說明該酶在pH為5.0～7.0時(shí)酶活相對穩(wěn)定。

2.3.3金屬離子對TGase酶活的影響。

金屬離子對酶活的影響主要分為激活作用及抑制作用[14-15]。由表5可知，Na+、Mg2+、K+、Ca2+對該酶活性沒有明顯的抑制作用，而Fe3+、Cu2+、Zn2+會(huì)強(qiáng)烈抑制酶的活性，由于所選用金屬離子濃度較高，金屬離子沒有表現(xiàn)出激活作用，對于低濃度下金屬離子對酶的激活作用尚未驗(yàn)證[16]。

3結(jié)論

通過正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)確定茂源鏈霉菌培養(yǎng)基中無機(jī)鹽的最優(yōu)組合為Na2HPO4 2.0 g/L、MgSO4·7H2O 1.5 g/L、KH2PO4 2.5 g/L、CaCl2 3.0 g/L。通過試驗(yàn)確定最佳發(fā)酵條件為培養(yǎng)溫度30 ℃、裝液量25 mL、搖床轉(zhuǎn)速200 r/min、接種量10%。

該谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的最適反應(yīng)溫度為50 ℃，在40～60 ℃條件下保溫30 min酶活維持在75%以上；最適反應(yīng)pH為6.0，在pH為5.0～7.0條件下保存30 min仍具有85%以上酶活； Fe3+、Cu2+、Zn2+會(huì)強(qiáng)烈抑制酶的活性。

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