王春梅 任健 蘭平秀 馬向麗 李陽春 白昌軍 徐立

摘 要 為探討山螞蝗屬植物遺傳多樣性和親緣關系，利用擴增片段長度多態(tài)性（AFLP）標記技術對46份山螞蝗屬植物種質(zhì)進行遺傳多樣性分析，從64對引物中篩選出條帶清晰、多態(tài)性高的2對引物E-AAC/M-CAA、E-AAG/M-CAA，共擴增出172條譜帶，其中154條為多態(tài)性帶，多態(tài)性檢出率為89.53%，表明在分子水平上山螞蝗屬植物遺傳多樣性豐富。采用離差平方和法將46個供試材料分為6類，聚類結果與《中國植物志》的分類體系相吻合；其中，卵葉山螞蝗和糙伏山螞蝗可能也屬于三點金亞屬，卵葉山螞蝗親緣關系離大葉山螞蝗較近，糙伏山螞蝗離假地豆較近，這個結論可以為中國植物志的修訂提供一個依據(jù)；引種材料CIAT350（29）與其他卵葉山螞蝗的親緣關系較遠?？傮w來看，聚類結果與地理來源沒有必然聯(lián)系。此外，從本實驗來看，AFLP技術擴增效率高，信息量大、結果穩(wěn)定、重復性好，可用于山螞蝗屬植物的遺傳多樣性分析和鑒定。

關鍵詞 山螞蝗屬；AFLP；遺傳多樣性；聚類分析

中圖分類號 S567；S54 文獻標識碼 A

Abstract In order to classify the genetic diversity and genetic relationship of Desmodium species， 46 Desmodium Desv. lines were studied using amplified fragment length polymorphism（AFLP）markers. Two primer combinations （E-AAC/M-CAA， E-AAG/M-CAA）with higher polymorphism were selected from 64 combinations. A total of 172 AFLP markers were generated from the selected two primer combinations and of which， 154 were polymorphic （89.53%）， indicating that the genetic diversity of Desmodium was abundant. According to AFLP marker data， the experimented 46 materials were clustered into 6 groups by using NTSYS software， and the cluster analysis results were consistent with the classification system published in-the Chinese flora. D. ovalifolium and D. strgillosum may also be classified to the Subgen. Sagotia（Duchass. et Walpers）Baker. D. ovalifolium and D. strgillosum was closely related， and similar results were observed between D. strgillosum and D. heterocarpon. In contrast， relationships between the introduced species-CIAT350（29）and other D. ovalifolium materials were far. Overall， there was not much relationship between the clustering results and the geographical origin. Regarded to AFLP technique， it is noted in efficiency and replicate， stable results as well as more information， which contributes to the genetic diversity analysis and identification of Desmodium species.

Key words Desmodium Desv； AFLP； genetic diversity； clustering analysis

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.03.022

山螞蝗屬（Desmodium Desv.）為豆科碟形花亞科一年生或多年生草本或灌木植物。全世界約350～450種，多分布于亞熱帶和熱帶地區(qū)，我國有27種5變種，大部分布于西南經(jīng)中南部至東南部，僅1種產(chǎn)陜、甘西南部[1]。目前，對山螞蝗屬植物的藥用價值[2-8]，細胞學[9-10]，飼草與飼料[11-14]等方面研究較多，但在山螞蝗屬植物遺傳多樣性方面的研究較少，特別是山螞蝗屬植物從廣義山螞蝗屬中獨立出來后，在分子評定方面更是鮮有報道。

擴增片段長度多態(tài)性（Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP）是荷蘭科學家Zabeau[15]和Vos[16]于1992年建立起來的一種檢測DNA多態(tài)性的新方法，其原理是基于PCR技術選擇性擴增基因組DNA限制性酶切片段。AFLP綜合了RFLP和RAPD的優(yōu)點，既具有RFLP的穩(wěn)定性和PCR反應快速、靈敏的特點，又具有RAPD的方便性，同時還克服了RFLP操作繁瑣，周期長和RAPD重復性較差的缺點[17-21]，自問世以來就被廣泛地用于分類和系統(tǒng)發(fā)育方面的研究，在鑒定與評估種質(zhì)資源方面也有廣泛的應用前景[22-31]。

因此，本研究采用AFLP分子標記技術，對山螞蝗屬植物的5個國內(nèi)種和2個引進種共計46份材料進行了遺傳多樣性和親緣關系的分析，旨在為山螞蝗屬植物的分類提供分子水平的證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗選用 27份國內(nèi)的野生山螞蝗屬植物種質(zhì)和19份國外引進的山螞蝗種質(zhì)，共46份，采集信息見表1。種質(zhì)保存在中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶作物品種資源研究所牧草中心，并在中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶作物品種資源研究所資源圃內(nèi)少量種植。每份種質(zhì)選10粒經(jīng)過發(fā)芽處理的種子，分別播種于大棚的花盆里。3片真葉后開始采樣提取DNA。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 選擇生長良好無病蟲害感染的植物嫩葉提取DNA，DNA提取采用改進的SDS法[32]。DNA濃度和純度用紫外分光光度計檢測，OD260/OD280比值在1.6～1.8之間，OD260/OD230的比值都大于2.0，表明所提的DNA純度高，可用于AFLP的操作。將DNA濃度稀釋至50 ng/μL，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物篩選 先用差異性較大的2個種（卵葉山螞蝗和大葉山螞蝗）對64對引物進行了篩選。選出了8對主帶在5條或5條以上而且比較清晰的引物。然后對這8對引物進行二次篩選，最終選擇了2對種間主帶較多、種內(nèi)差異較大而且較清晰的引物E-AAC/M-CAA、E-AAG/M-CAA，對所有供試材料進行選擇性擴增。

1.2.3 AFLP分析

（1）限制性酶切與連接。酶切體系為25 μL，包含DNA模板4 μL，EcoRⅠ/MseⅠ 2 μL，10×Reaction buffer 2.5 μL，ddH2O 16.5 μL，混勻后37 ℃水浴8 h。70 ℃水浴15 min。再加入Adapter 1 μL，10 mmol/L ATP 2.5 μL，T4 Ligase 1 μL，18 ℃水浴連接過夜。

（2）預擴增。反應總體系為25 μL，包含模板-DNA 2 μL，Pre-ampmix 1 μL，dNTPs 0.5 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，Taq DNA polymease 0.5 μL，ddH2O 16.5 μL，混勻后37 ℃水浴8 h。70 ℃水浴15 min。再加入Adapter 1 μL，10 mmol/L ATP 2.5 μL，離心混勻后用以下程序進行PCR擴增：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 80 s，25個循環(huán)；72 ℃ 5 min；4 ℃保存。預擴增產(chǎn)物稀釋50倍后于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

（3）選擇性擴增反應。反應總體系為25 μL，包含稀釋后的預擴增產(chǎn)物2 μL，EcoRⅠ和MseⅠ引物各1 μL，dNTPs 0.5 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，Taq DNApolymease 0.5 μL，ddH2O 17.5 μL，離心混勻后用以下程序進行擴增：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s，72 ℃ 80 s，12個循環(huán)，每循環(huán)降低0.7 ℃；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 80 s，30個循環(huán)；72 ℃ 5 min；4 ℃保存。

（4）擴增產(chǎn)物檢測。選擇擴增產(chǎn)物中加入等體積的loading buffer，95 ℃變性5 min后立即置于冰浴中冷卻。在80 W下用6%的聚丙烯酰胺凝膠電泳2 h，最后銀染檢測擴增產(chǎn)物。

1.3 數(shù)據(jù)處理

對擴增產(chǎn)物的電泳結果采用“0-1”系統(tǒng)記錄譜帶位置，統(tǒng)計多態(tài)性帶譜帶百分比。采用NTSYS分析軟件進行數(shù)據(jù)處理與聚類分析。

2 結果與分析

2.1 多態(tài)性分析

采用2對引物，對46份供試材料進行檢測，部分擴增結果見圖1、2。2對引物共擴增出172條譜帶，其中具有多態(tài)性的條帶為154條，多態(tài)性檢出率為89.53%。表明在分子水平上，山螞蝗屬植物遺傳多樣性豐富。同時說明，用AFLP標記揭示山螞蝗屬植物不同基因型的遺傳多樣性效率較高。2對引物中，引物組合E-AAC/M-CAA擴增的條帶較多，共113條，有7條共帶，106條多態(tài)性條帶，其多態(tài)性檢出率較高，為93.81%；引物組合E-AAG/M-CAA擴增的條帶相對較少，共59條，其中有11條共帶，48條多態(tài)性條帶，多態(tài)性檢出率為81.36%（表2）。

2.2 聚類分析

利用NTSYS進行聚類分析，結果見圖3。聚類結果表明，46份山螞蝗屬植物野生種質(zhì)資源種間遺傳距離明顯，種內(nèi)遺傳多樣性也較豐富。在閾值為0.77時，將46份山螞蝗屬植物分為6大類。第一類中，大葉山螞蝗與赤山螞蝗聚在了一起，各為1個亞類。8份大葉山螞蝗又分為4個組，其中3份海南（1、5、8）的種質(zhì)首先聚在一起；貴州冊亨（4）和廣西靖西（2）的聚為第2個組；另一份廣西靖西（7）和廣西大新（6）聚為第3組，較其他種質(zhì)來說，這一組的兩份種質(zhì)的相似系數(shù)相對較高，親緣關系較近；廣西田林（3）為第4組。第二類中，絨毛山螞蝗的8份種質(zhì)聚為一類，且地域性差異不明顯，說明絨毛山螞蝗的起源和親緣關系較為復雜。第三類中，早年從國外引種的一份糙伏山螞蝗種質(zhì)單獨分出來，由于其耐鹽性和飼用價值，在海南得以保存與推廣。第四類中，假地豆的7份種質(zhì)聚在一起。選用的假地豆種質(zhì)大多采集自海南，地域差異不明顯，但種間差異明顯，表明假地豆遺傳多樣性豐富。第五類中，卵葉山螞蝗的18份種質(zhì)聚在一起。這18份種質(zhì)都是引進的野生種質(zhì)，從聚類圖上可以看出遺傳多樣性比較復雜：當閾值為0.95時，又可分為5個亞類：第1個亞類有一份種質(zhì)（29）；第2個亞類有一份種質(zhì)（34）；第3個亞類有兩份種質(zhì)（32和33）；第4個亞類有兩份種質(zhì)（46和43），它們之間的相似度較低；第5個亞類中包含了其余的12份種質(zhì)，其中第1個亞組的44和45號材料之間的相似系數(shù)在整個聚類圖中最大（0.99），說明這兩份種質(zhì)的親緣關系最接近。第六類中，長波葉山螞蝗的3份種質(zhì)聚在一起，3個不同地域的長波葉山螞蝗的相似度比較高，表明它們的遺傳多樣性較為單一，親緣關系較近。

整體來看，第二類（絨毛山螞蝗）和第三類（糙伏山螞蝗）首先聚在一起，說明這兩類的親緣關系較近，再和第一類（大葉山螞蝗+赤山螞蝗）聚在一起；第四類（假地豆）和第五類（卵葉山螞蝗）首先聚到一起，說明這兩類親緣關系相對較近。聚類結果與地理來源有一定的一致性，但沒有必然聯(lián)系。

3 討論

3.1 應用銀染AFLP技術進行山螞蝗屬植物野生種質(zhì)指紋分析的優(yōu)越性

目前，在種質(zhì)資源遺傳多樣性研究中使用較多的分子標記有RAPD、RFLP、SSR、ISSR、AFLP等。RAPD簡單易行，DNA用量少（15～25 ng），但是對反應條件敏感，重復性較差；RFLP對DNA的需要量較大（5～10 μg），操作繁瑣，周期長，成本較高；SSR雖然具有共顯性標記和特種特異性以及發(fā)現(xiàn)的標記引物可以共用等優(yōu)點，但是非常費時，耗資。ISSR雖然具有很好的穩(wěn)定性和多態(tài)性，技術要求低，但其與RAPD類似，不能鑒別檢測位點的純合與雜合狀態(tài)；而AFLP技術結合了RFLP和RAPD各自的優(yōu)點，既有RFLP的可靠性，又有RAPD的簡便性，較之其他分子標記技術更能覆蓋整個基因組，多態(tài)性豐富，靈敏度高，被認為是迄今為止最有效的分子標記。王斌等[33]對水稻的研究表明，多態(tài)性檢出效率為AFLP>RAPD>RFLP。Russell[34]對大麥基因組的多樣性進行RFLP、RAPD、SSR、AFLP分析，結果發(fā)現(xiàn)揭示多樣性最多的是AFLP，最低的是RFLP。Nakajima[35]以胡蘿卜為材料進行了RAPD和AFLP分析，發(fā)現(xiàn)AFLP能產(chǎn)生4倍于RAPD的條帶數(shù)，具有更高的分辨能力。

本研究利用銀染AFLP技術對46份山螞蝗屬植物進行遺傳多樣性分析，所有供試材料全部得到了區(qū)分，而且所獲得的系統(tǒng)分析結果與《中國植物志》上山螞蝗屬分類大致相同，為山螞蝗屬植物的分類提供了分子水平的依據(jù)。研究結果證明，采用銀染AFLP技術對山螞蝗屬植物進行遺傳多樣性分析具有很多優(yōu)越性。首先，AFLP擴增效率高，信息量大。本試驗采用2對引物組合進行擴增，獲得多態(tài)性條帶154條，多態(tài)性比率達89.53%，多態(tài)性豐富，比較深入地反映了山螞蝗屬植物的遺傳變異信息。其次，AFLP分析結果穩(wěn)定、重復性好。對46個材料的同一擴增產(chǎn)物做多次重復電泳試驗，擴增的帶型完全一致，表現(xiàn)出良好的重復性。第三，理想的三堿基引物還可以防止錯配產(chǎn)生的帶達到檢測水平。綜上所述，利用銀染AFLP技術進行山螞蝗的指紋分析，具有其他分子標記所不能比擬的優(yōu)越性，可以用于山螞蝗屬植物的遺傳多樣性分析和鑒定。

3.2 山螞蝗屬植物的親緣關系和分類系統(tǒng)

依據(jù)本研究所獲得的山螞蝗屬植物親緣關系聚類圖可以看出各種質(zhì)之間的親緣關系遠近，及其在分類上的系統(tǒng)位置。本實驗選用的5個國內(nèi)種中，大葉山螞蝗、赤山螞蝗、絨毛山螞蝗、假地豆在中國植物志分類系統(tǒng)中都屬于三點金亞屬，長波葉山螞蝗屬于餓螞蝗亞屬；大葉山螞蝗、赤山螞蝗、絨毛山螞蝗的形態(tài)學距離較近，假地豆相對其他3種較遠。本實驗聚類分析結果與《中國植物志》的分類體系[1]以及劉苗苗等[36]利用形態(tài)特征對山螞蝗植物進行聚類分析的結果相吻合。

從聚類圖上看，長波葉山螞蝗作為一個獨立的分支而從其他供試山螞蝗中分離出來，其親緣關系與其他種較遠，這與形態(tài)學分類系統(tǒng)一致。大葉山螞蝗、赤山螞蝗、絨毛山螞蝗和糙伏山螞蝗首先聚在一起，假地豆和卵葉山螞蝗首先聚在一起，然后這6個種聚在一起，從分子標記的結果來看卵葉山螞蝗和糙伏山螞蝗可能也屬于三點金亞屬，卵葉山螞蝗可能離大葉山螞蝗更近一些，糙伏山螞蝗可能離假地豆更近一些。這個結論可以為中國植物志的修訂提供一個依據(jù)。

在假地豆種間，形態(tài)差異較大?；贏FLP的聚類圖上也可以看出，雖然材料均采自海南，但是種間相似系數(shù)較小，遺傳距離較大，從分子角度支持了假地豆種間遺傳多樣性豐富這一結論。

卵葉山螞蝗CIAT350（29）是1981年從澳大利亞引入，經(jīng)過多年的馴化，已于2005年已經(jīng)申報為品種——熱研16號卵葉山螞蝗。從聚類圖上可以看出CIAT350（29）和其他卵葉山螞蝗的親緣關系較遠，說明人為的干預對種質(zhì)的遺傳多樣性的作用很明顯。

總體來看，聚類結果與地理來源沒有必然的聯(lián)系，這可能是山螞蝗屬植物的起源和親緣關系較為復雜所致，也可能反映了地區(qū)之間山螞蝗屬植物的廣泛交流。

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