王春梅 任健 蘭平秀 馬向麗 李陽(yáng)春 白昌軍 徐立

摘 要 為探討山螞蝗屬植物遺傳多樣性和親緣關(guān)系，利用擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（AFLP）標(biāo)記技術(shù)對(duì)46份山螞蝗屬植物種質(zhì)進(jìn)行遺傳多樣性分析，從64對(duì)引物中篩選出條帶清晰、多態(tài)性高的2對(duì)引物E-AAC/M-CAA、E-AAG/M-CAA，共擴(kuò)增出172條譜帶，其中154條為多態(tài)性帶，多態(tài)性檢出率為89.53%，表明在分子水平上山螞蝗屬植物遺傳多樣性豐富。采用離差平方和法將46個(gè)供試材料分為6類，聚類結(jié)果與《中國(guó)植物志》的分類體系相吻合；其中，卵葉山螞蝗和糙伏山螞蝗可能也屬于三點(diǎn)金亞屬，卵葉山螞蝗親緣關(guān)系離大葉山螞蝗較近，糙伏山螞蝗離假地豆較近，這個(gè)結(jié)論可以為中國(guó)植物志的修訂提供一個(gè)依據(jù)；引種材料CIAT350（29）與其他卵葉山螞蝗的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)?？傮w來(lái)看，聚類結(jié)果與地理來(lái)源沒(méi)有必然聯(lián)系。此外，從本實(shí)驗(yàn)來(lái)看，AFLP技術(shù)擴(kuò)增效率高，信息量大、結(jié)果穩(wěn)定、重復(fù)性好，可用于山螞蝗屬植物的遺傳多樣性分析和鑒定。

關(guān)鍵詞 山螞蝗屬；AFLP；遺傳多樣性；聚類分析

中圖分類號(hào) S567；S54 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract In order to classify the genetic diversity and genetic relationship of Desmodium species， 46 Desmodium Desv. lines were studied using amplified fragment length polymorphism（AFLP）markers. Two primer combinations （E-AAC/M-CAA， E-AAG/M-CAA）with higher polymorphism were selected from 64 combinations. A total of 172 AFLP markers were generated from the selected two primer combinations and of which， 154 were polymorphic （89.53%）， indicating that the genetic diversity of Desmodium was abundant. According to AFLP marker data， the experimented 46 materials were clustered into 6 groups by using NTSYS software， and the cluster analysis results were consistent with the classification system published in-the Chinese flora. D. ovalifolium and D. strgillosum may also be classified to the Subgen. Sagotia（Duchass. et Walpers）Baker. D. ovalifolium and D. strgillosum was closely related， and similar results were observed between D. strgillosum and D. heterocarpon. In contrast， relationships between the introduced species-CIAT350（29）and other D. ovalifolium materials were far. Overall， there was not much relationship between the clustering results and the geographical origin. Regarded to AFLP technique， it is noted in efficiency and replicate， stable results as well as more information， which contributes to the genetic diversity analysis and identification of Desmodium species.

Key words Desmodium Desv； AFLP； genetic diversity； clustering analysis

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.03.022

山螞蝗屬（Desmodium Desv.）為豆科碟形花亞科一年生或多年生草本或灌木植物。全世界約350～450種，多分布于亞熱帶和熱帶地區(qū)，我國(guó)有27種5變種，大部分布于西南經(jīng)中南部至東南部，僅1種產(chǎn)陜、甘西南部[1]。目前，對(duì)山螞蝗屬植物的藥用價(jià)值[2-8]，細(xì)胞學(xué)[9-10]，飼草與飼料[11-14]等方面研究較多，但在山螞蝗屬植物遺傳多樣性方面的研究較少，特別是山螞蝗屬植物從廣義山螞蝗屬中獨(dú)立出來(lái)后，在分子評(píng)定方面更是鮮有報(bào)道。

擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP）是荷蘭科學(xué)家Zabeau[15]和Vos[16]于1992年建立起來(lái)的一種檢測(cè)DNA多態(tài)性的新方法，其原理是基于PCR技術(shù)選擇性擴(kuò)增基因組DNA限制性酶切片段。AFLP綜合了RFLP和RAPD的優(yōu)點(diǎn)，既具有RFLP的穩(wěn)定性和PCR反應(yīng)快速、靈敏的特點(diǎn)，又具有RAPD的方便性，同時(shí)還克服了RFLP操作繁瑣，周期長(zhǎng)和RAPD重復(fù)性較差的缺點(diǎn)[17-21]，自問(wèn)世以來(lái)就被廣泛地用于分類和系統(tǒng)發(fā)育方面的研究，在鑒定與評(píng)估種質(zhì)資源方面也有廣泛的應(yīng)用前景[22-31]。

因此，本研究采用AFLP分子標(biāo)記技術(shù)，對(duì)山螞蝗屬植物的5個(gè)國(guó)內(nèi)種和2個(gè)引進(jìn)種共計(jì)46份材料進(jìn)行了遺傳多樣性和親緣關(guān)系的分析，旨在為山螞蝗屬植物的分類提供分子水平的證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗(yàn)選用 27份國(guó)內(nèi)的野生山螞蝗屬植物種質(zhì)和19份國(guó)外引進(jìn)的山螞蝗種質(zhì)，共46份，采集信息見(jiàn)表1。種質(zhì)保存在中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所牧草中心，并在中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所資源圃內(nèi)少量種植。每份種質(zhì)選10粒經(jīng)過(guò)發(fā)芽處理的種子，分別播種于大棚的花盆里。3片真葉后開(kāi)始采樣提取DNA。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 選擇生長(zhǎng)良好無(wú)病蟲害感染的植物嫩葉提取DNA，DNA提取采用改進(jìn)的SDS法[32]。DNA濃度和純度用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)，OD260/OD280比值在1.6～1.8之間，OD260/OD230的比值都大于2.0，表明所提的DNA純度高，可用于AFLP的操作。將DNA濃度稀釋至50 ng/μL，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物篩選 先用差異性較大的2個(gè)種（卵葉山螞蝗和大葉山螞蝗）對(duì)64對(duì)引物進(jìn)行了篩選。選出了8對(duì)主帶在5條或5條以上而且比較清晰的引物。然后對(duì)這8對(duì)引物進(jìn)行二次篩選，最終選擇了2對(duì)種間主帶較多、種內(nèi)差異較大而且較清晰的引物E-AAC/M-CAA、E-AAG/M-CAA，對(duì)所有供試材料進(jìn)行選擇性擴(kuò)增。

1.2.3 AFLP分析

（1）限制性酶切與連接。酶切體系為25 μL，包含DNA模板4 μL，EcoRⅠ/MseⅠ 2 μL，10×Reaction buffer 2.5 μL，ddH2O 16.5 μL，混勻后37 ℃水浴8 h。70 ℃水浴15 min。再加入Adapter 1 μL，10 mmol/L ATP 2.5 μL，T4 Ligase 1 μL，18 ℃水浴連接過(guò)夜。

（2）預(yù)擴(kuò)增。反應(yīng)總體系為25 μL，包含模板-DNA 2 μL，Pre-ampmix 1 μL，dNTPs 0.5 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，Taq DNA polymease 0.5 μL，ddH2O 16.5 μL，混勻后37 ℃水浴8 h。70 ℃水浴15 min。再加入Adapter 1 μL，10 mmol/L ATP 2.5 μL，離心混勻后用以下程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 80 s，25個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min；4 ℃保存。預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋50倍后于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

（3）選擇性擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)總體系為25 μL，包含稀釋后的預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物2 μL，EcoRⅠ和MseⅠ引物各1 μL，dNTPs 0.5 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，Taq DNApolymease 0.5 μL，ddH2O 17.5 μL，離心混勻后用以下程序進(jìn)行擴(kuò)增：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s，72 ℃ 80 s，12個(gè)循環(huán)，每循環(huán)降低0.7 ℃；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 80 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min；4 ℃保存。

（4）擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)。選擇擴(kuò)增產(chǎn)物中加入等體積的loading buffer，95 ℃變性5 min后立即置于冰浴中冷卻。在80 W下用6%的聚丙烯酰胺凝膠電泳2 h，最后銀染檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。

1.3 數(shù)據(jù)處理

對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果采用“0-1”系統(tǒng)記錄譜帶位置，統(tǒng)計(jì)多態(tài)性帶譜帶百分比。采用NTSYS分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 多態(tài)性分析

采用2對(duì)引物，對(duì)46份供試材料進(jìn)行檢測(cè)，部分?jǐn)U增結(jié)果見(jiàn)圖1、2。2對(duì)引物共擴(kuò)增出172條譜帶，其中具有多態(tài)性的條帶為154條，多態(tài)性檢出率為89.53%。表明在分子水平上，山螞蝗屬植物遺傳多樣性豐富。同時(shí)說(shuō)明，用AFLP標(biāo)記揭示山螞蝗屬植物不同基因型的遺傳多樣性效率較高。2對(duì)引物中，引物組合E-AAC/M-CAA擴(kuò)增的條帶較多，共113條，有7條共帶，106條多態(tài)性條帶，其多態(tài)性檢出率較高，為93.81%；引物組合E-AAG/M-CAA擴(kuò)增的條帶相對(duì)較少，共59條，其中有11條共帶，48條多態(tài)性條帶，多態(tài)性檢出率為81.36%（表2）。

2.2 聚類分析

利用NTSYS進(jìn)行聚類分析，結(jié)果見(jiàn)圖3。聚類結(jié)果表明，46份山螞蝗屬植物野生種質(zhì)資源種間遺傳距離明顯，種內(nèi)遺傳多樣性也較豐富。在閾值為0.77時(shí)，將46份山螞蝗屬植物分為6大類。第一類中，大葉山螞蝗與赤山螞蝗聚在了一起，各為1個(gè)亞類。8份大葉山螞蝗又分為4個(gè)組，其中3份海南（1、5、8）的種質(zhì)首先聚在一起；貴州冊(cè)亨（4）和廣西靖西（2）的聚為第2個(gè)組；另一份廣西靖西（7）和廣西大新（6）聚為第3組，較其他種質(zhì)來(lái)說(shuō)，這一組的兩份種質(zhì)的相似系數(shù)相對(duì)較高，親緣關(guān)系較近；廣西田林（3）為第4組。第二類中，絨毛山螞蝗的8份種質(zhì)聚為一類，且地域性差異不明顯，說(shuō)明絨毛山螞蝗的起源和親緣關(guān)系較為復(fù)雜。第三類中，早年從國(guó)外引種的一份糙伏山螞蝗種質(zhì)單獨(dú)分出來(lái)，由于其耐鹽性和飼用價(jià)值，在海南得以保存與推廣。第四類中，假地豆的7份種質(zhì)聚在一起。選用的假地豆種質(zhì)大多采集自海南，地域差異不明顯，但種間差異明顯，表明假地豆遺傳多樣性豐富。第五類中，卵葉山螞蝗的18份種質(zhì)聚在一起。這18份種質(zhì)都是引進(jìn)的野生種質(zhì)，從聚類圖上可以看出遺傳多樣性比較復(fù)雜：當(dāng)閾值為0.95時(shí)，又可分為5個(gè)亞類：第1個(gè)亞類有一份種質(zhì)（29）；第2個(gè)亞類有一份種質(zhì)（34）；第3個(gè)亞類有兩份種質(zhì)（32和33）；第4個(gè)亞類有兩份種質(zhì)（46和43），它們之間的相似度較低；第5個(gè)亞類中包含了其余的12份種質(zhì)，其中第1個(gè)亞組的44和45號(hào)材料之間的相似系數(shù)在整個(gè)聚類圖中最大（0.99），說(shuō)明這兩份種質(zhì)的親緣關(guān)系最接近。第六類中，長(zhǎng)波葉山螞蝗的3份種質(zhì)聚在一起，3個(gè)不同地域的長(zhǎng)波葉山螞蝗的相似度比較高，表明它們的遺傳多樣性較為單一，親緣關(guān)系較近。

整體來(lái)看，第二類（絨毛山螞蝗）和第三類（糙伏山螞蝗）首先聚在一起，說(shuō)明這兩類的親緣關(guān)系較近，再和第一類（大葉山螞蝗+赤山螞蝗）聚在一起；第四類（假地豆）和第五類（卵葉山螞蝗）首先聚到一起，說(shuō)明這兩類親緣關(guān)系相對(duì)較近。聚類結(jié)果與地理來(lái)源有一定的一致性，但沒(méi)有必然聯(lián)系。

3 討論

3.1 應(yīng)用銀染AFLP技術(shù)進(jìn)行山螞蝗屬植物野生種質(zhì)指紋分析的優(yōu)越性

目前，在種質(zhì)資源遺傳多樣性研究中使用較多的分子標(biāo)記有RAPD、RFLP、SSR、ISSR、AFLP等。RAPD簡(jiǎn)單易行，DNA用量少（15～25 ng），但是對(duì)反應(yīng)條件敏感，重復(fù)性較差；RFLP對(duì)DNA的需要量較大（5～10 μg），操作繁瑣，周期長(zhǎng)，成本較高；SSR雖然具有共顯性標(biāo)記和特種特異性以及發(fā)現(xiàn)的標(biāo)記引物可以共用等優(yōu)點(diǎn)，但是非常費(fèi)時(shí)，耗資。ISSR雖然具有很好的穩(wěn)定性和多態(tài)性，技術(shù)要求低，但其與RAPD類似，不能鑒別檢測(cè)位點(diǎn)的純合與雜合狀態(tài)；而AFLP技術(shù)結(jié)合了RFLP和RAPD各自的優(yōu)點(diǎn)，既有RFLP的可靠性，又有RAPD的簡(jiǎn)便性，較之其他分子標(biāo)記技術(shù)更能覆蓋整個(gè)基因組，多態(tài)性豐富，靈敏度高，被認(rèn)為是迄今為止最有效的分子標(biāo)記。王斌等[33]對(duì)水稻的研究表明，多態(tài)性檢出效率為AFLP>RAPD>RFLP。Russell[34]對(duì)大麥基因組的多樣性進(jìn)行RFLP、RAPD、SSR、AFLP分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)揭示多樣性最多的是AFLP，最低的是RFLP。Nakajima[35]以胡蘿卜為材料進(jìn)行了RAPD和AFLP分析，發(fā)現(xiàn)AFLP能產(chǎn)生4倍于RAPD的條帶數(shù)，具有更高的分辨能力。

本研究利用銀染AFLP技術(shù)對(duì)46份山螞蝗屬植物進(jìn)行遺傳多樣性分析，所有供試材料全部得到了區(qū)分，而且所獲得的系統(tǒng)分析結(jié)果與《中國(guó)植物志》上山螞蝗屬分類大致相同，為山螞蝗屬植物的分類提供了分子水平的依據(jù)。研究結(jié)果證明，采用銀染AFLP技術(shù)對(duì)山螞蝗屬植物進(jìn)行遺傳多樣性分析具有很多優(yōu)越性。首先，AFLP擴(kuò)增效率高，信息量大。本試驗(yàn)采用2對(duì)引物組合進(jìn)行擴(kuò)增，獲得多態(tài)性條帶154條，多態(tài)性比率達(dá)89.53%，多態(tài)性豐富，比較深入地反映了山螞蝗屬植物的遺傳變異信息。其次，AFLP分析結(jié)果穩(wěn)定、重復(fù)性好。對(duì)46個(gè)材料的同一擴(kuò)增產(chǎn)物做多次重復(fù)電泳試驗(yàn)，擴(kuò)增的帶型完全一致，表現(xiàn)出良好的重復(fù)性。第三，理想的三堿基引物還可以防止錯(cuò)配產(chǎn)生的帶達(dá)到檢測(cè)水平。綜上所述，利用銀染AFLP技術(shù)進(jìn)行山螞蝗的指紋分析，具有其他分子標(biāo)記所不能比擬的優(yōu)越性，可以用于山螞蝗屬植物的遺傳多樣性分析和鑒定。

3.2 山螞蝗屬植物的親緣關(guān)系和分類系統(tǒng)

依據(jù)本研究所獲得的山螞蝗屬植物親緣關(guān)系聚類圖可以看出各種質(zhì)之間的親緣關(guān)系遠(yuǎn)近，及其在分類上的系統(tǒng)位置。本實(shí)驗(yàn)選用的5個(gè)國(guó)內(nèi)種中，大葉山螞蝗、赤山螞蝗、絨毛山螞蝗、假地豆在中國(guó)植物志分類系統(tǒng)中都屬于三點(diǎn)金亞屬，長(zhǎng)波葉山螞蝗屬于餓螞蝗亞屬；大葉山螞蝗、赤山螞蝗、絨毛山螞蝗的形態(tài)學(xué)距離較近，假地豆相對(duì)其他3種較遠(yuǎn)。本實(shí)驗(yàn)聚類分析結(jié)果與《中國(guó)植物志》的分類體系[1]以及劉苗苗等[36]利用形態(tài)特征對(duì)山螞蝗植物進(jìn)行聚類分析的結(jié)果相吻合。

從聚類圖上看，長(zhǎng)波葉山螞蝗作為一個(gè)獨(dú)立的分支而從其他供試山螞蝗中分離出來(lái)，其親緣關(guān)系與其他種較遠(yuǎn)，這與形態(tài)學(xué)分類系統(tǒng)一致。大葉山螞蝗、赤山螞蝗、絨毛山螞蝗和糙伏山螞蝗首先聚在一起，假地豆和卵葉山螞蝗首先聚在一起，然后這6個(gè)種聚在一起，從分子標(biāo)記的結(jié)果來(lái)看卵葉山螞蝗和糙伏山螞蝗可能也屬于三點(diǎn)金亞屬，卵葉山螞蝗可能離大葉山螞蝗更近一些，糙伏山螞蝗可能離假地豆更近一些。這個(gè)結(jié)論可以為中國(guó)植物志的修訂提供一個(gè)依據(jù)。

在假地豆種間，形態(tài)差異較大?；贏FLP的聚類圖上也可以看出，雖然材料均采自海南，但是種間相似系數(shù)較小，遺傳距離較大，從分子角度支持了假地豆種間遺傳多樣性豐富這一結(jié)論。

卵葉山螞蝗CIAT350（29）是1981年從澳大利亞引入，經(jīng)過(guò)多年的馴化，已于2005年已經(jīng)申報(bào)為品種——熱研16號(hào)卵葉山螞蝗。從聚類圖上可以看出CIAT350（29）和其他卵葉山螞蝗的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，說(shuō)明人為的干預(yù)對(duì)種質(zhì)的遺傳多樣性的作用很明顯。

總體來(lái)看，聚類結(jié)果與地理來(lái)源沒(méi)有必然的聯(lián)系，這可能是山螞蝗屬植物的起源和親緣關(guān)系較為復(fù)雜所致，也可能反映了地區(qū)之間山螞蝗屬植物的廣泛交流。

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