薛松 汪軍 王國(guó)芬 楊臘英 丁兆建 周游 黃俊生

摘 要 采用改良的海藻糖電轉(zhuǎn)化法獲得GFP標(biāo)記菌株X5-GFP、BQA2-GFP，顯微鏡觀察標(biāo)記菌株在土壤和水培中的番茄根際的定殖情況。結(jié)果表明：標(biāo)記菌株單獨(dú)或與青枯菌先后加入進(jìn)行處理，番茄根際標(biāo)記菌株的種群數(shù)量變化趨勢(shì)都是一致的。在土壤番茄根際中，X5-GFP單獨(dú)處理后當(dāng)天的菌量為1.05×106 CFU/g，隨之菌量逐漸下降；處理30 d后，為1.50×103 CFU/g；而B(niǎo)QA2-GFP單獨(dú)處理后當(dāng)天菌量為1.68×106 CFU/g，隨之菌量也逐漸下降；處理30 d后，為2.50×103 CFU/g；在水培番茄根際中，X5-GFP單獨(dú)處理后當(dāng)天的菌量為2.70×105 CFU/g，隨之菌量逐漸下降；處理30 d后，為1.00×103 CFU/g；而B(niǎo)QA2-GFP單獨(dú)處理后當(dāng)天菌量為3.60×105 CFU/g，隨之菌量同樣逐漸下降；處理30 d后，為1.50×103 CFU/g。這表明解淀粉芽胞桿菌X5、BQA2均在番茄根際有較強(qiáng)的定殖能力。

關(guān)鍵詞 解淀粉芽胞桿菌；綠色熒光蛋白；定殖

中圖分類號(hào) S432 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract In this study， green fluorescent protein tagged strains X5 and BQA2 were obtained by improvement in electroporation transformation efficiency of gene for Bacillus amyloliquefaciens with trehalose. X5-GFP and BQA2-GFP colonization in the rhizosphere of tomato were observed by microscope. The experimental results indicated that changing tendency of population quantity in marking strains of tomato rhizosphere was consistent after dealing with individual marking strains or adding Ralstonia solanacearum successively. In the soil， the population of X5-GFP on the roots of tomato reached 1.05×106 CFU/g after inoculating X5-GFP alone， and then decreased 30 days later， eventually remained at 1.50×103 CFU/g. The population of BQA2-GFP on the roots of tomato reached 1.68×106 CFU/g after inoculating BQA2-GFP alone， and then decreased 30 days later， eventually remained at 2.50×103 CFU/g. In Hydroponics， the population of X5-GFP on the roots of tomato reached 2.70×105 CFU/g after inoculating X5-GFP alone， and then decreased 30 days later， eventually remained at 1.00×103 CFU/g. The population of BQA2-GFP on the roots of tomato reached 3.60×105 CFU/g after inoculating BQA2-GFP alone， and then decreased 30 days later， eventually remained at 1.50×103 CFU/g. The results showed that B. amyloliquefaciens X5 and B. amyloliquefaciens BQA2 displayed good colonization ability in the rhizosphere of tomato.

Key words Bacillus amyloliquefaciens； green fluorescent protein； colonization

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.03.026

由于人們對(duì)糧食質(zhì)量安全要求的提高，綠色環(huán)保糧食已經(jīng)受到人們的青睞。在生產(chǎn)綠色環(huán)保糧食過(guò)程中，生物防治由于其環(huán)保、低毒等優(yōu)點(diǎn)受到了廣泛的關(guān)注[1]。據(jù)報(bào)道，生防菌在植物上的定殖能力和病害防治效果緊密相關(guān)[2-3]，有關(guān)研究也成為目前生防菌研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一[4-5]。很多標(biāo)記方法被開(kāi)發(fā)用于標(biāo)記目標(biāo)微生物，使其與其它微生物區(qū)別開(kāi)來(lái)，以闡明生防菌的定殖能力?？股貥?biāo)記作為最早使用的標(biāo)記方法，主要有硫酸鏈霉素、卡那霉素、四環(huán)素、氨芐青霉素等標(biāo)記法[6-7]，但抗生素標(biāo)記法不能區(qū)別出對(duì)標(biāo)記抗生素有同樣抗性的其它微生物。隨著標(biāo)記基因技術(shù)的不斷進(jìn)步，由于綠色熒光蛋白（Green Fluorescent Protein， GFP）具有易于檢測(cè)、靈敏度高、穩(wěn)定性較好、構(gòu)建載體方便、對(duì)宿主細(xì)胞無(wú)毒害作用、不受假陽(yáng)性干擾、廣譜性等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)已成為探究目標(biāo)微生物與寄主植物相互作用的重要工具[8]。劉郵洲等[9]將GFP轉(zhuǎn)到枯草芽胞桿菌PTS-394中，標(biāo)記菌株P(guān)TS-GFP與野生菌株P(guān)TS-394在生長(zhǎng)性狀和平板抑菌效果等方面基本相同。楊秀榮等[10]用GFP標(biāo)記生防細(xì)菌 B579，結(jié)果表明標(biāo)記菌株B579-gfp可在黃瓜根部大量定殖并形成生物膜狀。Cao等[11]發(fā)現(xiàn)枯草芽胞桿菌SQR 9能使黃瓜枯萎病的發(fā)病率降低49%～61%，同時(shí)發(fā)現(xiàn)GFP轉(zhuǎn)化的枯草芽胞桿菌SQR 9在黃瓜根部的定殖數(shù)量能達(dá)到106 CFU/g，這說(shuō)明枯草芽胞桿菌SQR 9能很好的防控黃瓜枯萎病。Gao等[12]用GFP標(biāo)記Bacillus subtilis 168和它的2株衍生菌OKB105、OKBHF（菌株OKB105和OKBHF能產(chǎn)生脂肽物質(zhì)），將他們接種至番茄根部，結(jié)果發(fā)現(xiàn)OKB105、OKBHF這2個(gè)菌株在番茄根部的定殖數(shù)量是B. subtilis 168菌株定殖數(shù)量的2～3倍。這說(shuō)明枯草芽胞桿菌可能通過(guò)脂肽物質(zhì)的產(chǎn)生來(lái)提高定殖效率，從而促進(jìn)植物生長(zhǎng)。Yuan等[13]發(fā)現(xiàn)解淀粉芽胞桿菌YL-25能有效防控香蕉枯萎病的發(fā)生，同時(shí)也能促進(jìn)植物生長(zhǎng)。

在前期，本實(shí)驗(yàn)室從香蕉根際分離到2株解淀粉芽胞桿菌X5和BQA2，它們對(duì)番茄青枯病菌（Ralstonia solanacearum）和香蕉枯萎病菌（Fusarium oxysporum f. sp. cubense）具有較強(qiáng)的拮抗作用。為了深入研究解淀粉芽胞桿菌X5和BQA2在植物上的定殖能力，本研究對(duì)他們進(jìn)行GFP標(biāo)記，并通過(guò)顯微鏡觀察X5-GFP和BQA2-GFP在番茄根部定殖數(shù)量的變化，為將來(lái)開(kāi)發(fā)利用解淀粉芽胞桿菌X5和BQA2作為生防菌奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株：解淀粉芽胞桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）X5和BQA2及番茄青枯病菌（Ralstonia solanacearum）R4、香蕉枯萎病菌（Fusarium oxysporum）FOC-B2均由中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所微生物資源研究與利用研究室提供。

TTC瓊脂培養(yǎng)基：0.1%酸水解酪蛋白1 g、蛋白胨10 g、葡萄糖5 g、瓊脂17 g、蒸餾水1 000 mL（1%氯化三苯基四氮唑鹽酸鹽（TTC）在使用前待滅菌的基礎(chǔ)培養(yǎng)基冷卻至55 ℃時(shí)再加入）。PDA培養(yǎng)基： 馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 000 mL。LB培養(yǎng)基：酵母粉5 g、胰蛋白胨10 g、NaCl 10 g、瓊脂15 g、蒸餾水1 000 mL。電擊洗液：海藻糖0.5 mol/L、山梨醇0.5 mol/L、甘露醇0.5 mol/L、甘油10%?；謴?fù)液：分別含0.5 mol/L海藻糖、0.5 mol/L山梨醇、0.38 mol/L甘露醇的LB。

番茄品種：櫻桃番茄京丹1號(hào)品種，由中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所微生物資源研究與利用研究室提供。

試劑：海藻糖從北京索萊寶科技有限公司購(gòu)買(mǎi)，Taq DNA聚合酶從寶生物工程（大連）有限公司購(gòu)買(mǎi)。帶有綠色熒光蛋白標(biāo)記的表達(dá)載體P101-P4322由中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所微生物資源研究與利用研究室提供。引物合成和基因測(cè)序由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司來(lái)完成。

1.2 方法

1.2.1 解淀粉芽胞桿菌X5和BQA2的盆栽實(shí)驗(yàn)

將長(zhǎng)出20片真葉的番茄苗移栽至裝有滅菌土壤的盆缽中，每盆1株，設(shè)置8個(gè)重復(fù)。本實(shí)驗(yàn)共設(shè)置3個(gè)處理組：（1）加入5 mL解淀粉芽胞桿菌X5菌液（菌液濃度為108 CFU/mL）和5 mL青枯菌R4菌液（菌液濃度為108 CFU/mL）；（2）加入5 mL解淀粉芽胞桿菌BQA2菌液（菌液濃度為108 CFU/mL）和5 mL青枯菌R4菌液（菌液濃度為108 CFU/mL）；（3）加入5 mL的滅菌水和5 mL青枯菌R4菌液（菌液濃度為108 CFU/mL）；

分別在移栽后7、15、30 d調(diào)查番茄苗的發(fā)病情況。病情指數(shù)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：0級(jí)為番茄苗無(wú)萎蔫癥狀；1級(jí)為番茄苗葉片≤25%萎蔫；2級(jí)為番茄苗葉片26%～50%萎蔫；3級(jí)為番茄苗葉片51%～75%萎蔫；4級(jí)為番茄苗葉片76%～100%萎蔫或者死亡。

病情指數(shù)=×100

防治效果=×100%

1.2.2 解淀粉芽胞桿菌X5和BQA2的GFP標(biāo)記

從解淀粉芽胞桿菌X5、BQA2的平板中挑取單菌落，接接至LB液體培養(yǎng)基中，于37 ℃、170 r/min過(guò)夜培養(yǎng)，待菌液OD600為2.0時(shí)停止培養(yǎng)，將菌液冰浴10 min后，再于4 ℃、5 000 r/min離心6 min。用預(yù)冷的電擊洗液沖洗菌體之后，在4 ℃、5 000 r/min離心10 min，共洗滌4次。最后用500 μL電擊洗液懸浮菌體，則得到X5和BQA2的感受態(tài)細(xì)胞。

電轉(zhuǎn)化時(shí)取60 μL的感受態(tài)細(xì)胞與1 μL質(zhì)粒（190.6 ng/μL）混勻后轉(zhuǎn)入到冰置電擊杯（1 mm電擊縫隙）中，冰浴8 min后進(jìn)行電擊，電擊條件是2.6 kV/mm，電擊1次，電擊時(shí)間為4.5 ms。電擊后立即加入1 mL恢復(fù)液（LB含0.5 mol/L海藻糖、0.5 mol/L山梨醇、0.38 mol/L甘露醇），于37 ℃、100 r/min孵育3 h后，涂布于含有20 μg/mL四環(huán)素的LB平板上，過(guò)夜37 ℃倒置培養(yǎng)觀察轉(zhuǎn)化子。利用primer5.0軟件設(shè)計(jì)gfp基因的特異性引物，W3：ATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTCACTGG，W16：AAAGAATTCCTATTTGTATAGTTCATCCATGCCATG。

1.2.3 X5-GFP和BQA2-GFP生長(zhǎng)特性 將X5-GFP和BQA2-GFP的單菌落接種至30 mL含40 μg/mL四環(huán)素的LB液體培養(yǎng)基中，于37 ℃、170 r/min培養(yǎng)過(guò)夜。取100 μL培養(yǎng)過(guò)夜的菌液接種至60 mL含40 μg/mL四環(huán)素的LB液體培養(yǎng)基中，于37 ℃、170 r/min培養(yǎng)過(guò)夜。用野生菌株 X5、BQA2作為對(duì)照，在相同的處理下進(jìn)行培養(yǎng)，每2 h測(cè)量菌液OD600值1次，從而得到X5、BQA2和X5-GFP、BQA2-GFP 的生長(zhǎng)特性。

1.2.4 X5-GFP和BQA2-GFP的平板拮抗性能

從TTC瓊脂平板挑取青枯病菌的菌落接種至LB中，于28 ℃、190 r/min速度培養(yǎng)過(guò)夜，用無(wú)菌水稀釋至菌含量達(dá)108 CFU/mL，取稀釋后的青枯病菌液100 μL涂布至TTC瓊脂平板，用牙簽挑取X5-GFP和X5點(diǎn)到直徑方向左右兩側(cè)（距平板邊緣20 mm），在28 ℃下恒溫培養(yǎng)24 h，每次處理3個(gè)重復(fù)。設(shè)清水對(duì)照。而B(niǎo)QA2-GFP和BQA2作相同處理。待對(duì)照平板青枯菌長(zhǎng)滿平板時(shí)，調(diào)查抑菌圈直徑。

挑取香蕉枯萎病菌接種至PDA液體培養(yǎng)基中，于28 ℃、190 r/min速度培養(yǎng)過(guò)夜，用無(wú)菌水稀釋菌液濃度至108 CFU/mL。取稀釋后的香蕉枯萎病菌液100 μL涂布至PDA瓊脂平板，用孔徑6 mm的滅菌打孔器在直徑方向左右兩側(cè)（距平板邊緣20 mm）處各打一個(gè)孔，分別滴加X(jué)5-GFP和X5菌液20 μL，在28 ℃下恒溫培養(yǎng)24 h，每次處理3個(gè)重復(fù)。設(shè)清水對(duì)照。而B(niǎo)QA2-GFP和BQA2作相同處理。等到對(duì)照平板香蕉枯萎病菌長(zhǎng)滿平板的時(shí)候，測(cè)量抑菌圈的直徑。

1.2.5 X5-GFP和BQA2-GFP質(zhì)粒的穩(wěn)定性測(cè)試

將X5-GFP的單菌落接種至含40 μg/mL四環(huán)素和不含四環(huán)素的20 mL液體LB培養(yǎng)基當(dāng)中，于37 ℃、170 r/min培養(yǎng)過(guò)夜記為0代，隔24 h后取100 μL的過(guò)夜培養(yǎng)的菌液分別接種至含40 μg/mL四環(huán)素和不含四環(huán)素的液體LB培養(yǎng)基中，于37 ℃、180 r/min連續(xù)培養(yǎng)10代。每培養(yǎng)24 h后取100 μL傳代菌液涂布到不含四環(huán)素的LB平板，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜后取20個(gè)單菌落接種至含有40 μg/mL四環(huán)素的LB平板上，37 ℃培養(yǎng)24 h后在熒光顯微鏡下統(tǒng)計(jì)發(fā)光的菌落數(shù)。而B(niǎo)QA2-GFP作相同處理。計(jì)算標(biāo)記菌株質(zhì)粒的穩(wěn)定性[14]：質(zhì)粒的穩(wěn)定性=發(fā)光菌落數(shù)/20。

1.2.6 X5-GFP和BQA2-GFP番茄根際的定殖情況

將長(zhǎng)出8片真葉的番茄苗種植至裝有滅菌土的盆缽中，每盆種植1株，設(shè)置9個(gè)重復(fù)。青枯菌R4接種前需要刺傷番茄的根部[15]。本實(shí)驗(yàn)共設(shè)置3個(gè)處理組：（1）加入X5-GFP菌液3 mL；（2）先加入X5-GFP菌液3 mL，隔1 d后加入青枯菌液1 mL；（3）先加入青枯菌液1 mL，隔1 d后再加入X5-GFP菌液3 mL。BQA2-GFP同樣設(shè)上述的3個(gè)處理組。

加入X5-GFP菌液4 h后取1 g番茄根，將其磨碎后，取100 μL涂板37 ℃培養(yǎng)24 h后統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)，即為第0天X5-GFP的定殖量。隨后第2，4，6，8，10，15，30天分別取樣測(cè)定。同時(shí)，顯微鏡觀察標(biāo)記菌株在番茄根際的定殖情況。BQA2-GFP定殖量的測(cè)定方法和上述方法相同。

將長(zhǎng)出8片真葉的番茄苗種植至裝有60 mL滅菌水的錐形瓶中，每盆種植1株，設(shè)置9個(gè)重復(fù)。青枯菌R4接種前同樣需要刺傷番茄的根部[15]。處理組的設(shè)置和標(biāo)記菌株定殖數(shù)量測(cè)定與觀察和上述方法相同。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用EXCEL2013軟件對(duì)X5、BQA2和X5-GFP、BQA2-GFP的OD600值進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 解淀粉芽胞桿菌X5和BQA2的盆栽防效

解淀粉芽胞桿菌X5和BQA2的盆栽防治效果見(jiàn)表1。由表1可知，解淀粉芽胞桿菌X5和BQA2的盆栽防治效果分別為61.8%和80.9%，兩者都能較好的抑制青枯病的發(fā)生，經(jīng)比較，解淀粉芽胞桿菌BQA2的盆栽防治效果更好。

2.2 解淀粉芽胞桿菌X5和BQA2的GFP標(biāo)記

將重組質(zhì)粒P101-P4322電擊轉(zhuǎn)入野生型菌株X5和BQA2中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用熒光顯微鏡觀察標(biāo)記菌株發(fā)出的綠色熒光（圖1）。

2.3 X5-GFP、BQA2-GFP的生長(zhǎng)特性

X5和X5-GFP的生長(zhǎng)曲線相似（圖2）。菌株的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的在培養(yǎng)后2 h，穩(wěn)定生長(zhǎng)期是在6 h后，隨后一直較為穩(wěn)定。這表明野生菌株X5進(jìn)行GFP標(biāo)記后，質(zhì)粒P101-P4322未對(duì)菌株X5的生長(zhǎng)產(chǎn)生明顯影響。

BQA2和BQA2-GFP的生長(zhǎng)曲線也是相似（圖3）。菌株的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期是在培養(yǎng)后2 h，穩(wěn)定生長(zhǎng)期是在培養(yǎng)10 h后，隨后也是一直較為穩(wěn)定。這同樣表明野生菌株BQA2進(jìn)行GFP標(biāo)記后，質(zhì)粒P101-P4322未對(duì)菌株BQA2的生長(zhǎng)產(chǎn)生明顯影響。

2.4 X5-GFP和BQA2-GFP的平板拮抗

與野生菌株x5和BQA2相比， X5-GFP和BQA2-GFP對(duì)番茄青枯病菌和香蕉枯萎病菌的平板抑菌活性無(wú)明顯差別（圖4）。X5和X5-GFP對(duì)番茄青枯病菌的抑菌圈的直徑為1.5 cm；X5和X5-GFP對(duì)香蕉枯萎病菌的抑菌圈的直徑為1.9 cm；BQA2對(duì)番茄青枯病菌的抑菌圈的直徑為1.7 cm；BQA2-GFP對(duì)番茄青枯病菌的抑菌圈的直徑為1.5 cm；BQA2對(duì)香蕉枯萎病菌的抑菌圈直徑為1.6 cm；BQA2-GFP對(duì)香蕉枯萎病菌的抑菌圈直徑為1.5 cm。

2.5 X5-GFP和BQA2-GFP的質(zhì)粒穩(wěn)定性

菌株X5-GFP在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，連續(xù)培養(yǎng)4代后，質(zhì)粒的穩(wěn)定性是100%，培養(yǎng)8代后質(zhì)粒的穩(wěn)定性是95%，培養(yǎng)10代以后為90%；而菌株BQA2-GFP連續(xù)培養(yǎng)4代后，質(zhì)粒的穩(wěn)定性是95%，培養(yǎng)8代質(zhì)粒的穩(wěn)定性是85%，培養(yǎng)10代后為80%。在含四環(huán)素的LB培養(yǎng)基培養(yǎng)時(shí)， X5-GFP、BQA2-GFP在培養(yǎng)10代后的質(zhì)粒穩(wěn)定性均為95%。結(jié)果表明，質(zhì)粒P101-P4322在X5-GFP和BQA2-GFP中能夠穩(wěn)定遺傳，并且隨著連續(xù)的培養(yǎng)質(zhì)粒P101-P4322的穩(wěn)定性而降低。

2.6 X5-GFP和BQA2-GFP在番茄根際的定殖情況

X5-GFP在番茄根際的定殖情況見(jiàn)圖5和圖6。BQA2-GFP在番茄根際的定殖情況見(jiàn)圖7和圖8。X5-GFP和BQA2-GFP在處理當(dāng)天都能大量定殖在番茄根際；隨后標(biāo)記菌株數(shù)量逐漸下降，處理30 d后，標(biāo)記菌株仍有不少的菌體定殖在番茄根際。

在土壤番茄根際中，X5-GFP單獨(dú)處理后，當(dāng)天的菌量為1.05×106 CFU/g；隨之菌量逐漸下降，4 d后，菌量達(dá)1.82×104 CFU/g；6 d后，菌量達(dá)1.26×104 CFU/g；8 d后為9.00×103 CFU/g；15 d后菌量為2.50×103 CFU/g；30 d后為1.50×103 CFU/g。先接種X5-GFP后接種青枯菌的處理組，當(dāng)天的菌量為9.55×105 CFU/g；處理6 d，為4.27×103 CFU/g；15 d后菌量為2.00×103 CFU/g；處理30 d，為1.00×103 CFU/g；而先接種青枯菌后接種X5-GFP的處理組，當(dāng)天的菌量為9.33×105 CFU/g；處理6 d，為3.89×103 CFU/g；處理30 d，為5.00×102 CFU/g。與先加入青枯病菌R4再加入X5-GFP的處理組相比，在0～6 d內(nèi)，先加X(jué)5-GFP再加入青枯病菌R4的處理組，X5-GFP在番茄根部的定殖數(shù)量更高。

在水培番茄根際中，X5-GFP單獨(dú)處理后當(dāng)天初始菌量為2.70×105 CFU/g；隨之菌量逐漸下降，4 d后，菌量為1.00×104 CFU/g；6 d后，菌量為7.94×103 CFU/g；8 d后菌量為7.00×103 CFU/g；15 d后菌量為2.00×103 CFU/g；30 d后菌量為為1.00×103 CFU/g。先接種X5-GFP后接種青枯菌的處理組，當(dāng)天的菌量為2.19×105 CFU/g；處理4 d，菌量為8.91×103 CFU/g；處理30 d，菌量為5.00×102 CFU/g。而先接種青枯菌后接種X5-GFP的處理組，當(dāng)天的菌量為2.04×105 CFU/g；處理4 d，菌量為7.94×103 CFU/g；處理30 d，菌量為5.00×102 CFU/g。與先加入青枯病菌R4再加入X5-GFP的處理組相比，在0～4 d內(nèi)，先加X(jué)5-GFP再加青枯病菌R4的處理組，X5-GFP在番茄根部的定殖數(shù)量更高。

在土壤番茄根際中，BQA2-GFP單獨(dú)處理后當(dāng)天初始菌量為1.68×106 CFU/g；隨之菌量也逐漸下降，4 d后，菌量為9.80×104 CFU/g；6 d后，菌量為7.41×104 CFU/g；8 d后菌量為6.60×104 CFU/g；15 d后菌量為5.00×103 CFU/g；處理30 d后菌量為2.50×103 CFU/g。先接種BQA2-GFP后接種青枯菌的處理組，當(dāng)天的菌量為1.10×106 CFU/g；處理8 d，菌量為6.17×104 CFU/g；處理30 d，菌量為1.51×103 CFU/g。先接種青枯菌后接種BQA2-GFP的處理組，當(dāng)天的菌量為1.07×106 CFU/g；處理8 d，菌量為4.47×104 CFU/g；處理30 d，菌量為2.00×103 CFU/g。與先加青枯病菌R4再加BQA2-GFP的處理組相比，在0～8 d內(nèi)，先加BQA2-GFP再加青枯病菌R4的處理組，BQA2-GFP在番茄根部的定殖數(shù)量更高。

在水培番茄根際中，BQA2-GFP單獨(dú)處理后當(dāng)天初始菌量為3.60×105 CFU/g；隨之菌量也逐漸下降，4 d后，菌量為3.20×104 CFU/g；6 d后，菌量為2.40×104 CFU/g；8 d后菌量為7.50×103 CFU/g；15 d后菌量為2.50×103 CFU/g；30 d后菌量為1.50×103 CFU/g。先接種BQA2-GFP后接種青枯菌的處理組，當(dāng)天的菌量為1.66×105 CFU/g；處理6 d，菌量為2.09×104 CFU/g；處理30 d，菌量為1.00×103 CFU/g。先接種青枯菌后接種BQA2-GFP的處理組，當(dāng)天的菌量為1.51×105 CFU/g；處理6 d，菌量為1.35×104 CFU/g；處理30 d，菌量為1.00×103 CFU/g。與先加青枯病菌R4再加BQA2-GFP的處理組相比，在0～6 d內(nèi)，先加BQA2-GFP再加青枯病菌R4的處理組，BQA2-GFP在番茄根部的定殖數(shù)量更高。

綜上所述，在這3種不同的處理組中，在番茄根際的標(biāo)記菌株地定殖數(shù)量的變化趨向是一致的。與標(biāo)記菌株和青枯病菌R4混合加入的處理組相比，單獨(dú)加入標(biāo)記菌株的處理組的標(biāo)記菌株在番茄根部的定殖數(shù)量更高。同時(shí)，通過(guò)統(tǒng)計(jì)X5-GFP、BQA2-GFP在番茄根部的定殖數(shù)量，這表明X5-GFP、BQA2-GFP在番茄根部都有較好的定殖能力并且比劉郵洲等[9]報(bào)道的枯草芽胞桿菌PTS-394定殖能力強(qiáng)，兩者相比較而言，BQA2-GFP在番茄根部的定殖能力略好于X5-GFP。而就土壤和水培的2種不同培養(yǎng)方式而言，土壤中番茄根際的標(biāo)記菌株的定殖數(shù)量多于水培中的番茄根際標(biāo)記菌株的定殖數(shù)量。

3 討論

生防菌的應(yīng)用已經(jīng)成為生物防治的一個(gè)重要方面，而生防菌在植物根際的定殖能力與抑制植物根際有害微生物的能力緊密相關(guān)。目前，世界上已經(jīng)有很多科研人員對(duì)生防菌定殖能力進(jìn)行了研究[8，16-19]。與其他的標(biāo)記方法相比，由于GFP標(biāo)記方法具有易于檢測(cè)、靈敏度高、穩(wěn)定性較好、構(gòu)建載體方便等優(yōu)點(diǎn)受到了科研工作者的廣泛應(yīng)用。

本研究采用海藻糖改良的電轉(zhuǎn)化法進(jìn)行GFP標(biāo)記菌株X5-GFP、BQA2-GFP，分別進(jìn)行了X5-GFP、BQA2-GFP的生長(zhǎng)速率、X5-GFP、BQA2-GFP的抑菌活性等實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明：X5-GFP、BQA2-GFP和X5、BQA2在生長(zhǎng)特性、對(duì)青枯病菌R4和香蕉枯萎病菌的平板抑制效果等方面沒(méi)有明顯不同。張昕等[20]研究認(rèn)為無(wú)選擇壓力的條件下，隨著傳代次數(shù)越來(lái)越多，外源質(zhì)粒的穩(wěn)定性會(huì)降低，如菌株ZJY-1G連續(xù)傳10代，質(zhì)粒保存率是82.1%；連續(xù)傳70代，質(zhì)粒保存率是9.1%；菌株ZJY-116G連續(xù)傳10代，質(zhì)粒保存率是69.3%；連續(xù)傳70代，質(zhì)粒保存率是0。本研究中，X5-GFP在無(wú)四環(huán)素選擇壓力的條件下，連續(xù)傳6代后質(zhì)粒的穩(wěn)定性是95%，連續(xù)培養(yǎng)10代后為90%；X5-GFP在有四環(huán)素選擇壓力的條件下，連續(xù)傳6代后質(zhì)粒的穩(wěn)定性為100%，連續(xù)培養(yǎng)10代后高達(dá)95%；而B(niǎo)QA2-GFP在無(wú)四環(huán)素選擇壓力的條件下，連續(xù)傳6代后外源質(zhì)粒的穩(wěn)定性為90%，連續(xù)傳10代后為80%；BQA2-GFP在有四環(huán)素選擇壓力的條件下，連續(xù)傳6代后質(zhì)粒的穩(wěn)定性為100%，培養(yǎng)10代后為95%。X5-GFP、BQA2-GFP接種后在番茄根際的定殖數(shù)量逐漸下降，這與劉郵洲等[9]的報(bào)道一致。但不同的芽胞桿菌在植物根際定殖數(shù)量的變化趨勢(shì)并不都是一樣的，劉慶豐等[21]報(bào)道的枯草芽胞桿菌XF-1能定殖到大白菜的根部，在大白菜的根際定殖數(shù)量變化趨向是先降低后上升再降低，最后基本保持穩(wěn)定；而在根內(nèi)部定殖數(shù)量的變化趨向是先上升后降低。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與標(biāo)記菌株和青枯病菌R4混合加入的處理組相比，單獨(dú)加入標(biāo)記菌株的處理組的標(biāo)記菌株在番茄根部的定殖數(shù)量更高的原因可能是生防菌和青枯菌R4有營(yíng)養(yǎng)和根際定殖位點(diǎn)的競(jìng)爭(zhēng)，從而使標(biāo)記菌株X5-GFP、BQA2-GFP的定殖數(shù)量減少。同時(shí)生防菌與青枯菌R4的接種順序的不同也會(huì)影響生防菌在番茄根際的定殖數(shù)量，原因可能是先接種青枯病菌后，它會(huì)提前搶占番茄根際的定殖位點(diǎn)提前進(jìn)入番茄根際及優(yōu)先利用土壤和水中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)來(lái)進(jìn)行繁殖成為優(yōu)勢(shì)菌種，從而使得番茄根際的定殖位點(diǎn)和外界環(huán)境中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)減少，進(jìn)而使得生防菌在番茄根際的定殖數(shù)量減少，這需要進(jìn)一步的驗(yàn)證。而在土壤中番茄根際的標(biāo)記菌株的定殖數(shù)量多于水培中的番茄根際標(biāo)記菌株的定殖數(shù)量。這可能是由于土壤中能夠?yàn)樯谰峁└娴臓I(yíng)養(yǎng)，有利于生防菌的生長(zhǎng)和繁殖，從而使其在番茄根際的定殖數(shù)量更多。

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