肖乃衍 林冰 劉迪 陳平華 許躍語 施桂姣 王恒波 郭晉隆 高三基 許莉萍 陳如凱

摘 要 克隆鑒定甘蔗內源低拷貝基因鮮有研究，影響轉基因甘蔗精確鑒定。根據其他作物已有的內標基因和內源低拷貝基因，按照內標基因的物種特異性和通用性原則，用12個有代表性甘蔗栽培品種對11個候選基因進行篩選與鑒定，獲得了甘蔗特有的內源低拷貝基因，并以該基因建立了甘蔗內標基因PCR檢測技術體系，為轉基因甘蔗的精確檢測和轉基因標準的制定奠定了基礎。

關鍵詞 甘蔗；內標基因；鑒定；PCR檢測技術

中圖分類號 S566.1；Q78 文獻標識碼 A

Abstract Cloning and identification of endogenous low copy gene in sugarcane has been rarely reported， which affects the accurate determination of the transgenic sugarcane. Low copy endogenous genes of sugarcane were identified referring to the known endogenous reference genes and low copy endogenous genes of other crops. Eleven candidate genes were tested with twelve representative sugarcane cultivars based on the principles of species specific and universal existence. PCR protocol to amplify the low copy endogenous gene was set up subsequently， which contributes to identify transgenic sugarcane plants precisely and lays the foundation for development of relevant detection standards.

Key words sugarcane； endogenous reference genes； determination； PCR detection technology

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.03.019

目前，轉基因作物的推廣已給全世界帶來了巨大的社會效益和經濟效益[1]，為了檢測轉基因作物的需要，農業(yè)部制訂了一系列標準。甘蔗（Saccharum officinarum）轉基因研究也越來越多，涉及增加蔗糖分積累和蔗莖產量、增強抗病能力、提高抗逆性等方面[2-5]，但迄今為止，尚沒有制訂一例轉基因甘蔗檢測標準。農業(yè)部制訂的轉基因檢測標準大部分是定性PCR檢測標準。定性PCR是檢測轉基因植物常用的方法，具有快速、靈敏等優(yōu)點，能夠有效擴增低拷貝的靶片段DNA[6]。影響PCR檢測效果的因素有很多，如PCR反應程序、退火溫度、Taq酶質量等，通過設立對照可以有效檢驗這些因素合適與否。但樣品DNA質量卻難以通過設立對照的方式來解決，因為常用紫外分光光度計測定OD260/OD280比值的方法來衡量DNA質量并把1.8作為純DNA的理論值，而OD260和OD280只是測定溶液中核酸和蛋白質的含量，其他物質的含量情況不得而知。抑制或干擾PCR反應的物質很多，如蛋白酶、有機溶劑、表面活性劑、鹽類、絡合物、金屬離子、多糖以及酸類物質等，這些物質是OD260/OD280比值所不能反映的。這就是有些經測定純度很高的DNA樣品在PCR測定中結果卻很差的主要原因。逐個測定和去除這些抑制物需要耗費大量的時間和試劑，顯然不可取。目前研究人員已經在某些作物上找到解決辦法，即鑒定該物種特有的低拷貝基因并作為內標基因建立PCR檢測方法，在目的基因PCR檢測前先對DNA樣品進行內標基因PCR檢測，根據內標基因擴增效果判定待檢DNA質量是否滿足準確測定目的基因的要求。多數主要作物的內標基因已被克隆并在轉基因檢測中得到應用，如水稻的SPS[7]、gos9[8]基因，玉米的IVR[9]、zSSIIb[10]基因等，大豆的Lectin[9]、β-actin[11]基因等。但到目前為止，尚未有甘蔗內標基因被克隆鑒定，一個主要原因是：與上述整倍體植物不同，甘蔗是高度雜合的異源多倍體植物，其遺傳背景非常復雜，篩選和鑒定甘蔗內源低拷貝基因比較困難。本研究試圖通過內源低拷貝基因篩選鑒定，建立起甘蔗內標基因PCR檢測方法，為甘蔗轉基因檢測標準的制訂奠定基礎。研究結果對于甘蔗DNA樣品質量判定和轉基因甘蔗準確鑒定具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 甘蔗品種 甘蔗栽培品種是由甘蔗屬中5個種即熱帶種、大莖野生種、細莖野生種、印度種和中國種中的幾個種雜交而來的。由于甘蔗本身遺傳背景非常復雜，為了使實驗材料具有代表性，參考各實驗材料的親本血緣，選取中國甘蔗主產區(qū)12個不同栽培品種（系）為材料，分別是廣西的柳城03-1137，廣東的粵甘34、粵甘35，云南的云蔗04-241、云蔗05-51、云蔗06-407，福建的FN36、FN02-5707、FN39，江西的贛南02-70，臺灣的ROC16、ROC22。其中云蔗04-241的父母本分別為ROC10、84-153；FN36的父母本分別為崖82-96、ROC1；ROC22的父母本分別為ROC5、69-435；粵甘34的父母本分別為ROC22、粵糖92-1287；云蔗05-51的父母本分別為ROC23、崖城90-56；FN39的父母本分別為CP84-1198、粵糖91-976；粵甘35的父母本分別為CP85-384和CP92-624、粵糖73-204；贛南02-70的父母本分別為CP84-1198、桂69-435；ROC16的父母本分別為F171、74-575；云蔗06-407的父母本分別為ROC25、粵糖92-70。以上品種的父母本覆蓋目前生產上常用的雜交育種親本材料，可以代表大多數甘蔗栽培品種的遺傳背景。上述材料由福建農林大學甘蔗綜合研究所提供。

1.1.2 內標基因 從國家轉基因生物安全標準中查找到的已有轉基因植物內標基因有：IVR[12]、Lectin[12]、18S rRNA[12]、SPS[13]。美國農業(yè)部以植物5S rRNA-ITS基因作為甘蔗內標基因[14]。

1.1.3 試劑 2×Premix Ex Taq酶、pMD18-T載體購自TaKaRa公司；膠回收試劑盒購自日本BioFlux公司；100 bp DNA Ladder、E.coli DH5α感受態(tài)細胞購自北京天根生化科技公司；SYBR Green PCR Master Mix購自美國ABI公司；PCR引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成；其他生化試劑為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 已有轉基因植物內標基因檢測篩選 根據農業(yè)部科技發(fā)展中心編寫的《農業(yè)轉基因生物安全標準》以及國家技術監(jiān)督局《1949.5.4-2004轉基因產品檢測核酸定性PCR檢測方法》，檢索其中已有轉基因植物內標基因及其PCR檢測引物序列和PCR反應體系，按照標準或文獻中各參試基因定性PCR反應體系，在PCR反應管中依次加入各反應試劑，輕輕混勻，離心10 s后，將PCR管放入PCR儀中，按照擴增參數進行擴增反應。PCR產物的特異性和通用性分析：PCR產物的特異性就是要求PCR產物擴增只有單一的目的條帶并達到一定濃度，PCR產物的通用性就是要求PCR產物在甘蔗栽培品種中都能有效擴增，并且擴增的條帶符合特異性要求。利用入選的甘蔗品種DNA，對測試基因進行PCR擴增，通過對PCR產物條帶的電泳分析判定測試基因是否符合內標基因的標準。制備含有EB的1.5%瓊脂糖凝膠對PCR擴增產物進行電泳，用凝膠成像系統(tǒng)分析產物的特異性和通用性。膠回收目的片段，并進行克隆和測序。

1.2.2 已知低拷貝基因檢測篩選 通過檢索文獻資料或登錄GenBank檢索已經克隆的植物低拷貝基因或者甘蔗的低拷貝基因，檢索到已經克隆的植物低拷貝基因和基因序列有：ALS[15]（登錄號：EU243998.1）、UGPase[16]（登錄號：FJ536261.1）、vrn2[17]（登錄號：CA080033.1）、LeftsH6[18]（登錄號：DN193862.1）、LsD1[19]（登錄號：CA224873.1）、NCED1[20]（登錄號：AY838901.1）。利用已有PCR檢測引物或根據其序列用Primer Premier 5軟件設計適合甘蔗的引物，計算引物適宜退火溫度，建立PCR反應體系。參照1.2.1進行PCR產物特異性和通用性分析。

1.2.3 入選基因實時熒光定量PCR測試和拷貝數分析 采用兩步法進行PCR擴增：Holding Stage：50 ℃ 2 min；95 ℃ 10 min；Cycling Stage：95 ℃ 1 s；60 ℃ 1 min；40 cycles；Melt Curve Stage：95 ℃ 15 s；60 ℃ 1 min；95 ℃ 30 s；60 ℃ 15 s。反應體系：DNA模板1.0 μL，SYBR Green PCR Master Mix 12.5 μL，上下游引物（10 μmol/L）各1.0 μL，加ddH2O使總體積為25.0 μL。實時熒光定量PCR引物擴增效率：將已知濃度的含目的基因質粒濃度調整到109 copies/μL，再依次稀釋為108、107、106、105、104、103、102、101，然后作為模板進行實時熒光定量PCR反應，根據反應結果制作標準曲線，標準曲線以log10為橫坐標，Ct值為縱坐標。如引物的擴增效率（E）大于0.8、擴增曲線相關系數（R2）大于0.95則認為曲線線性關系成立，所設計引物能夠滿足實時熒光定量PCR擴增的要求，可用于下一步甘蔗內源基因拷貝數分析。定量PCR反應中，為了避免引物二聚體干擾并保證引物擴增的效率，擴增的目的片段一般都不大，以200 bp左右為宜。把測得的各樣品的Ct值代入標準曲線方程計算出目的基因拷貝數，再代入公式：拷貝數/{[6.02×1023×10-9×40/（7 740×106×660）]}得出基因在單個細胞基因組中的拷貝數。

1.2.4 入選基因定性PCR檢測體系 為確定入選基因PCR檢測體系的靈敏度，根據優(yōu)化的入選基因定性PCR反應體系，將甘蔗基因組DNA濃度依次稀釋為20、2、0.2、0.02、0.01、0.001 ng/μL，然后進行PCR反應，根據能夠擴增出目的片段的最低甘蔗基因組DNA濃度高低，確定入選基因PCR反應的靈敏度。

1.2.5 入選基因PCR檢測體系甘蔗物種特異性驗證

為驗證入選基因的物種特異性，以已經有轉基因品種的典型作物如雙子葉植物大豆、單子葉植物水稻、玉米等和甘蔗DNA為模板，利用優(yōu)化的PCR反應體系同時進行入選基因PCR檢測，根據PCR反應結果判定甘蔗入選基因PCR檢測體系的物種特異性。

2 結果與分析

2.1 甘蔗材料的遺傳背景和代表性分析

甘蔗育種的改良對象主要為栽培種，因此甘蔗栽培種的親本材料在甘蔗育種中有著重要的作用。中國大陸目前大多數的甘蔗優(yōu)良栽培品種是美國CP49-50、印度Co419和中國臺灣F134等的后代，而Co419、F134等又是印尼爪哇POJ2878的后代[21]。本研究的甘蔗材料中，父本為F系列的有ROC16；父本為“ROC”系列的有云蔗04-241、ROC22、粵甘34、云蔗05-51、云蔗06-407；母本為“ROC”系列的有FN36；父本為美國CP系列的有FN39、粵甘35、贛南02-70。此外，考慮到中國不同蔗區(qū)的特點，又增加了主要蔗區(qū)常用育種親本，如父母本分別為崖城系列的FN36和云蔗05-51；母本為粵糖系列的粵甘34、FN39、粵甘35、云蔗06-407；母本為桂糖系列的贛南02-70。以上受試品種的父母本不僅涵蓋美國CP系列、中國臺灣ROC和F系列，而且還有崖城系列、粵糖系列、桂糖系列等，基本可以代表目前生產上栽培品種的遺傳背景。由此可以看出，本研究的試驗材料具有較廣泛的代表性，能夠較好地反映甘蔗遺傳背景的總體情況。

2.2 已有轉基因植物內標基因檢測篩選

2.2.1 PCR產物電泳檢測與產物特異性和通用性分析 用表1中5個基因的引物對甘蔗DNA進行PCR檢測，結果發(fā)現(xiàn)：SPS、5S rRNA-ITS、Lectin基因PCR擴增出多個條帶（圖1-A、B、C），其中SPS基因擴增出3個不同的高豐度帶；5S rRNA-ITS基因個別甘蔗品種擴增出的非特異條帶較亮；Lectin基因主擴增帶長度偏離很大。這些現(xiàn)象主要是引物特異性不強造成的，因此，沒有再進行體系優(yōu)化研究。IVR基因PCR雖然只在部分材料中產生非特異條帶，高豐度帶也較單一，但條帶大小介于200～300 bp且接近200 bp，與玉米已有IVR內標基因的226 bp大小一致，因已被鑒定、使用，故不再進一步研究（圖1-D）；18S rRNA（圖1-E）PCR只擴增出1個條帶并且所有受試甘蔗品種均能擴增出來，符合內標基因標準，但條帶大小與棉花擴增條帶大小一致。由于18S rRNA已作為棉花內標基因使用，不符合甘蔗物種特異性原則，不能作為甘蔗內標基因。

2.2.2 目的片段回收測序 為進一步驗證18S rRNA PCR擴增的單一條帶大小，對目的條帶進行了回收測序，結果顯示目的片段長度137 bp，序列長度與圖1-E中電泳條帶大小一致，兩種方法結果相互印證。

2.3 已知低拷貝基因檢測篩選

根據檢索到的6個低拷貝基因ALS、UGPase、vrn2、LeftsH6、LsD1、NCED1的序列設計特異引物，引物序列及產物長度見表2，其PCR反應參數見表3。

2.3.1 PCR產物電泳檢測與產物特異性和通用性分析 用ALS、UGPase、vrn2、LeftsH6、LsD1、NCED1的引物對甘蔗進行PCR檢測，結果發(fā)現(xiàn)ALS基因引物PCR擴增只出現(xiàn)1個條帶并且每個甘蔗品種均能擴增出同一條帶，符合甘蔗品種通用性原則，結果見圖2-A，擴增條帶大小在100～200 bp之間，接近預期長度170 bp。該基因未作為內標基因使用，且在甘蔗上未進行過鑒定，值得進一步研究。NCED1基因引物擴增出一個主帶，大小接近預期長度203 bp，但有一個弱的非特異擴增帶，結果見圖2-B。因已篩選到與預期目標一致的基因，未對該基因深入研究。其他基因中UGPase和LeftsH6未擴增出目的條帶，vrn2和LsD1擴增出多個條帶，不符合內標基因標準（圖未列出）。

2.3.2 目的片段回收測序 對ALS基因PCR擴增的單一條帶進行膠回收并測序，測序結果如下（5′-3′）：

測序結果顯示：ALS基因PCR目的片段長度171 bp，與圖2-A中ALS基因PCR產物電泳條帶長度一致。經Blast比對，從甘蔗上克隆的ALS基因序列與水稻ALS基因只有62%的同源性（登錄號：XM_015779138.1、AP014960.1、AP014960.1），可見，利用甘蔗DNA為模板擴增到的ALS基因片段，其序列與水稻相比差異很大，說明該基因具有甘蔗物種特異性，符合內標基因物種特異性原則，但其在甘蔗基因組中的拷貝數未知，需要進一步研究鑒定。

2.4 ALS實時熒光定量PCR檢測

利用表2中ALS基因PCR引物進行實時熒光定量PCR反應，繪制出ALS基因的標準曲線，結果引物的擴增效率（E）大于0.95，擴增曲線相關系數（R2）為0.999（見表4），表明該引物適用于ALS基因實時熒光定量PCR擴增的要求，可用于下一步甘蔗內源基因拷貝數分析。

2.4.1 實時熒光定量PCR溶解曲線 對實時熒光定量PCR溶解曲線的分析實質上是產物的特異性分析。如果溶解曲線為單峰則說明引物的特異性強，峰值高則說明PCR擴增效率好。ALS基因的實時熒光定量PCR溶解曲線為單峰，且峰值較高，說明引物特異性強，PCR擴增效率好（圖3）。圖中有12條PCR溶解曲線，每條PCR溶解曲線代表一個受試甘蔗品種。

2.4.2 ALS基因拷貝數分析 以12個受試甘蔗品種的DNA為模板，把模板濃度調整為20 ng/μL，進行實時熒光定量PCR反應，確定Ct值，然后按照ALS基因的標準曲線公式將12個甘蔗品種的Ct值代入，計算出其相應的拷貝數。然后按公式：拷貝數/{[6.02×1023×10-9×40/（7740×106×660）]}得出ALS基因在單個細胞基因組中的拷貝數，結果見表5。對表5的數據進行t檢驗，結果顯示：ALS基因的樣本均值為1.107，與1接近，t統(tǒng)計量為0.778，自由度為11，p值為0.453。由于p值大于顯著水平0.05，所以接受ALS基因在甘蔗基因組中的拷貝數為低拷貝的原假設，推斷ALS基因是單拷貝基因。

2.5 ALS基因定性PCR檢測體系

表6是根據常見轉基因檢測標準設計的ALS基因定性PCR反應體系，按照優(yōu)化的反應程序進行PCR反應：95 ℃變性5 min；進行35次循環(huán)擴增反應（94 ℃變性30 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s）；最后72 ℃延伸5 min。反應結束后取出PCR反應管，對PCR反應產物進行電泳檢測或在4 ℃下保存待用。

PCR產物電泳結果見圖4，可以看到：當甘蔗基因組DNA濃度為0.2 ng/μL時仍然可以看到目的條帶，但當濃度低于0.2 ng/μL就難以辨別目的條帶了，可見要檢測到甘蔗內源低拷貝基因，DNA濃度應在0.2 ng/μL以上。

2.6 甘蔗ALS基因PCR檢測體系物種特異性驗證

根據設計的驗證入選基因物種特異性方法，以水稻、大豆、玉米、甘蔗DNA為模板，用ALS基因的引物（表2中ALS-F和ALS-R）進行PCR反應，結果只有甘蔗得到擴增，且PCR擴增產物很特異，亮度很強（圖5）。其他已經有轉基因品種的作物如雙子葉植物大豆、單子葉植物水稻和玉米均未擴增出任何條帶，這表明本研究利用甘蔗內源低拷貝基因ALS建立的 PCR檢測體系可以從典型轉基因作物中特異地鑒定出甘蔗。

3 討論

實驗材料的選擇。基于不同的研究目標選取相應的實驗材料。本實驗選取的甘蔗實驗材料基于三個原則：一是栽培品種，因為轉基因目的是應用，受體材料用栽培品種才有更大利用價值。二是糖蔗，因為根據人們對轉基因的敏感性，直接食用的果蔗很難獲得環(huán)境釋放；糖蔗作為工業(yè)原料則相對容易。三是材料要具有較廣泛代表性。因為鑒定的是甘蔗栽培種內標基因，在甘蔗栽培種內要廣泛存在。由于甘蔗本身遺傳背景非常復雜，不同栽培種之間基因組大小差別就很大[22]，為使實驗材料具有代表性，既要考慮實驗材料的血緣，能夠代表大多數甘蔗栽培品種的遺傳背景，同時也要考慮甘蔗的來源，覆蓋較多的甘蔗不同產區(qū)才能進一步提高實驗材料的代表性。本研究所選材料較好滿足了上述要求。

基因拷貝數計算公式分析。在實時熒光定量PCR拷貝數分析中，先通過標準曲線計算出基因拷貝數，然后再采用公式：拷貝數/{[6.02×1023×10-9×40/（物種單個細胞的基因組大小×660）]}得出該基因在單個細胞基因組的拷貝數。公式中6.02×1023為阿伏伽德羅常數，660為4個脫氧核糖核苷酸（A、T、G、C）的平均分子量的2倍（雙鏈），由于甘蔗基因組比較復雜，不同甘蔗品種間基因組大小差異較大，一般在7 500×106～11 780×106 bp之間，而80%的甘蔗高貴種的基因組大小在7 500×106～8 500×106 bp之間[23]，本研究所用材料為栽培品種，因此以甘蔗高貴種平均基因組大小7 740×106 bp作為計算公式中的“物種單個細胞基因組大小”的值代入公式進行計算。從正文表5中拷貝數計算結果可以看出不同來源品種間存在差異，這與甘蔗學術界普遍認為不同甘蔗品種間基因組大小差異較大的看法一致，由于本研究取樣具有較廣泛的代表性，且樣品數較多，多個樣品的平均值就比較接近真值。

參試基因篩選鑒定的標準。對于參試的基因是否需要進行深入鑒定，一是要看測試基因是否符合內標基因標準，有3個基本要求，種間特異性、種內非特異性和恒定低拷貝數的特點[24]，種間特異性指該基因在不同的物種間同源性極低，本研究在篩選過程中已充分考慮該要求；種內非特異性要求該基因在同一物種的不同品種中具有很高的同源性和穩(wěn)定性，具體到本研究，要求PCR產物在甘蔗栽培品種中都能有效擴增；恒定低拷貝數指的是在同一物種拷貝數不變，一般為1～3個拷貝，單拷貝最佳。參試基因首先要符合上述3個要求。二是在測試基因符合內標基因標準的前提下，看測試基因PCR產物大小是否與已有內標基因相同，如果相同，說明不具備物種特異性要求，繼續(xù)研究失去意義；如果該基因尚未被鑒定為內標基因，則可進一步鑒定。對于有明顯單一條帶的新基因，無論條帶大小如何，都值得進一步研究鑒定。

參考文獻

[1] 任志強， 肖建紅， 楊慧珍， 等. 轉基因植物在農業(yè)上的應用[J]. 安徽農業(yè)科學， 2016， 44（3）： 109-110， 125.

[2] Guo J L， Gao S W， Lin Q L， et al. Transgenic sugarcane resistant to sorghum mosaic virus based on coat protein gene silencing by RNA interference[J]. BioMed Research International， Volume 2015（2015）， Article ID 861907， 9 pages， http： //dx.doi.org/10.1155/2015/861907.

[3] 陳利平， 陳平華， 陳忠偉， 等. 甘蔗黃葉病毒與花葉病毒CP基因RNAi載體構建與轉化甘蔗研究[J]. 熱帶作物學報， 2016， 37（1）： 99-106.

[4] 王文治， 楊本鵬， 蔡文偉， 等. 抗除草劑bar基因與EPSPS基因在轉基因甘蔗中的應用研究[J]. 生物技術通報， 2016（3）： 73-78.

[5] 張 卓， 陳平華， 許莉萍， 等. 四價抗病蟲除草劑RNAi植物表達載體構建與轉化甘蔗研究[J]. 基因組學與應用生物學， 2014， 33（3）： 661-673.

[6] Ahmed F E. Detection of genetically modified organisms in foods[J]. Trends in Biotechnology， 2002， 20（5）： 215-223.

[7] Ding J Y， Jia J W， Yang L T， et al. Validation of a rice specific gene， Sucrose Phosphate Synthase， used as the endogenous reference gene for qualitative and real-time quantitative PCR detection of transgenes[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2004， 52（11）： 3 372-3 377.

[8] Hernandez M， Esteve T， Pla M. Real-time polymerase chain reaction based assays for quantitative detection of barley， rice， sunflower， and wheat[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2005， 53（18）： 7 003-7 009.

[9] Hurst C D， Knight A， Bruce I J. PCR detection of genetically modified soya and maize in foodstuffs[J]. Molecular Breeding， 1999， 5（6）： 579-586.

[10] Tomoaki Y， Hideo K， Takeshi M， et al. Applicability of the quantification of genetically modified organisms to foods processed from maize and soy[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2005， 53（6）： 2 052-2 059.

[11] James D， Schmidt A M， Wall E， et al. Reliable detection and identification of genetically modified maize， soybean， and canola by multiplex PCR analysis[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2003， 51（20）： 5 829-5 834.

[12] GB/T 1949.5.4-2004轉基因產品檢測核酸定性PCR檢測方法[S]. 2004-04-13.

[13] 農業(yè)部953號公告-6-2007轉基因植物及其產品成分檢測抗蟲轉Bt基因水稻定性PCR方法[S]. 2008-03-01.

[14] Chen P H， Pan Y B， Chen R K. High-throughput procedure for single pollen grain collection and polymerase chain reaction in plants[J]. Journal of Integrative Plant Biology， 2008， 50（3）： 375-383.

[15] 宋貴生， 馮德江， 魏曉麗， 等. 水稻乙酰乳酸合成酶基因的克隆和功能分析[J]. 中國農業(yè)科技導報， 2007， 9（3）： 66-72.

[16] 張 楊， 隋正紅， 丁弘葉， 等. 龍須菜UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因的克隆及其表達與瓊膠產量的關系[J]. 中國海洋大學學報（自然科學版）， 2011， 41（1）： 80-86.

[17] 楊 ， 徐碧玉， 金志強. 擬南芥春化基因vrn2的克隆及相關分析[J]. 熱帶作物學報， 2003， 24（2）： 46-50.

[18] Sun A Q， Yang J Y， Yi S Y， et al. Cloning and molecular characteristic of the metalloprotease gene LeftsH6 from tomato[J]. Journal of plant physiology and molecular biology， 2006， 32（1）： 64-72.

[19] 王麗娟， 田穎川， 何朝族. 新基因水稻OsLSD1的克隆及擬南芥和水稻類LSD1基因家族的生物信息學分析[J]. 生物化學與生物物理進展， 2005， 32（3）： 268-274.

[20] 楊錦芬， 郭振飛， 楊 靜. 柱花草9-順式環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶基因（SgNCED1）的克隆及表達分析[J]. 草業(yè)學報， 2007， 16（3）： 21-28.

[21] 陳如凱. 現(xiàn)代甘蔗遺傳育種[M]. 北京： 中國農業(yè)出版社， 2011： 7-8.

[22] 鄭成木. 甘蔗核型及其染色體數目變化的研究[J]. 熱帶作物學報， 1993， 14（1）： 47-51，

[23] Zhang J S， Nagai C， Yu Q Y， et al. Genome size variation in three Saccharin species[J]. Euphytica， 2012， 185（3）： 511-519.

[24]丁春燕， 沈 峰， 陸 敏， 等. 辣椒內標準基因及其在食品檢測中的應用[J]. 浙江農業(yè)科學， 2014（1）： 89-92.