谷彩紅　趙寶添　高世慶

摘要[目的]對鹽芥EsABI1基因進(jìn)行克隆及功能預(yù)測。[方法]克隆鹽芥EsABI1基因cDNA序列，對其蛋白保守結(jié)構(gòu)域和系統(tǒng)進(jìn)化進(jìn)行分析。[結(jié)果]EsABI1與AtABI1屬于進(jìn)化上的同一分支，有最近的親緣關(guān)系，都含有包含PP2C蛋白磷酸酶催化活性位點(diǎn)在內(nèi)的11個(gè)保守功能域。定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)，鹽芥EsABI1沉默植株中EsABI1表達(dá)水平較野生型均有不同程度的降低。60 μmol/L ABA分別處理EsABI1沉默植株0、3和6 h后，發(fā)現(xiàn)EsABI1基因表達(dá)水平受ABA誘導(dǎo)上調(diào)，而且相比于鹽芥野生型，EsABI1沉默植株中EsABI1受ABA誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)更加明顯。[結(jié)論]EsABI1是ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的負(fù)調(diào)控因子，參與了鹽芥對環(huán)境脅迫的響應(yīng)。

關(guān)鍵詞鹽芥；EsABI1；ABA；基因沉默；基因表達(dá)

中圖分類號S188文獻(xiàn)標(biāo)識碼

A文章編號0517-6611（2017）30-0134-06

Abstract[Objective]To clone the EsABI1 of Eutrema salsugineum and predict the function.[Method]The cDNA sequence of EsABI1 of E.salsugineum was cloned to study the protein conserved domain and phyletic evolution.[Result]EsABI1 and AtABI1 had highest similarity and belonged to one branch in evolution，which contained 11 conserved domains，including PP2C protein phosphatase catalytic active site.Quantitative PCR detection showed that the expression level of EsABI1 in EsABI1 silent plants was lower than that in the wild type.The expression of EsABI1 had been upregulated under 60 μmol/L ABA for 0，3，6 hours in E.salsugineum，and the higher upregulated expression of EsABI1 compared with wide type.[Conclusion] EsABI1 acted as a negative regulator in ABA signal transduction pathway of E.salsugineum，which participated in the response of E.salsugineum to environmental stress.

Key wordsEutrema salsugineum；EsABI1；Abscisic acid；Gene silencing；Gene expression

植物在生長發(fā)育過程中經(jīng)常遭受干旱、鹽、極端溫度等非生物脅迫的傷害，脫落酸（ABA）作為主要的逆境相關(guān)激素參與植物對外界脅迫的應(yīng)答，研究表明多數(shù)情況下ABA負(fù)調(diào)控植物對環(huán)境脅迫的響應(yīng)[1-2]。蛋白激酶和蛋白磷酸酶是ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的核心組分，參與植物蛋白的可逆磷酸化反應(yīng)，是許多生理過程的主要調(diào)節(jié)機(jī)制[3-4]。

蛋白磷酸酶主要分為2個(gè)類型：Ser/Thr蛋白磷酸酶（Ser/Thr phosphatases）和Try蛋白磷酸酶（Ttry phosphatases）。Ser/Thr蛋白磷酸酶家族在信號傳遞、細(xì)胞分裂周期調(diào)控、細(xì)胞分化和新陳代謝中具不可或缺的作用，根據(jù)其作用底物的專一性、對抑制劑的敏感性以及是否需要二價(jià)陽離子可分為PP1、PP2A、PP2B和PP2C[5-6]。不同于其他Ser/Thr蛋白磷酸酶家族，PP2C（Ser/Thr phosphatases protein 2C）家族進(jìn)化最明顯，為單體酶，其不受調(diào)控亞基的調(diào)控，而是通過結(jié)構(gòu)的改變行使功能；PP2C功能受表達(dá)水平、胞內(nèi)定位和第二信使等的調(diào)節(jié)[5，7]。真核生物PP2C結(jié)構(gòu)具有共性，即蛋白的N端或C端具有11個(gè)保守基序的催化區(qū)域[8]。植物中PP2C保守催化域多位于C端，如擬南芥ABI1的催化結(jié)構(gòu)域就在C端；而PP2C的N端保守性較低，其具有其他功能，如ABI1蛋白靠近N末端位置有一可與Ca2+結(jié)合的類似EF指基序[8-9]。

擬南芥（Arabidopsis thaliana）PP2C家族的成員主要包括ABI1、ABI2、HAB1、AHG3和PP2CA，它們均為ABA信號途徑的負(fù)調(diào)控因子。目前，擬南芥中至少已發(fā)現(xiàn)了69個(gè)PP2C基因，其中ABI1與ABI2分別由ABI1、ABI2基因編碼，是擬南芥ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中重要的負(fù)調(diào)控因子，可削弱植物對ABA的敏感性，影響與ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的植物表型和生理性狀[1]。abi1-1和abi2-1突變體均為甘氨酸替換為天冬氨酸的單錯(cuò)義突變體，所不同的是前者突變在其等位基因的第180位，而后者在第168位，二者對ABA的響應(yīng)較之于野生型均減弱，即abi1-1和abi2-1均導(dǎo)致植株ABA的耐受性增強(qiáng)[10]。

多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，高等植物中PP2C廣泛參與ABA誘導(dǎo)的種子萌發(fā)和休眠[11-14]、氣孔關(guān)閉[15]、保衛(wèi)細(xì)胞[16]和離子通道的調(diào)控[17]以及逆境脅迫的應(yīng)答[18-20]等。Finkelstein等[21]研究發(fā)現(xiàn)，在外源ABA處理的 abi1、abi2突變體中其脯氨酸積累量明顯低于野生型，說明ABI1與ABI2是植物耐逆相關(guān)基因。在ABA不敏感突變體abi1-1和abi2-1中，其氣孔關(guān)閉的調(diào)控機(jī)制受損，因而它們均對水分脅迫非常敏感[18，22]。苜蓿中的PP2C受環(huán)境脅迫誘導(dǎo)且為MAPK途徑的負(fù)調(diào)控因子[23]。Thtiharju等[19]報(bào)道PP2CA為冷脅迫下擬南芥ABA信號途徑的負(fù)調(diào)節(jié)因子，通過對PP2CA基因沉默植株的研究發(fā)現(xiàn)，植株對冷脅迫的耐受性大大增強(qiáng)，而對于ABA則更為敏感。研究表明，PP2CA過量表達(dá)植株較野生型表現(xiàn)出對ABA的更加不敏感，而pp2ca-1和pp2ca-2插入突變體表現(xiàn)出對ABA的敏感性增強(qiáng)[15，24]。

植物體內(nèi) PP2C的廣泛多樣性表明其在不同組織和器官中信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的多樣性。鑒于ABI1 為擬南芥ABA信號通路最主要的負(fù)調(diào)控因子，在ABA誘導(dǎo)的植物保衛(wèi)細(xì)胞氣孔運(yùn)動(dòng)中發(fā)揮重要作用，該研究以擬南芥近緣的耐逆模式植物——鹽芥（Eutrema salsugineum，之前名稱為 Thellungiella halophila或Thellungiella salsugineum）為試材，通過構(gòu)建EsABI1沉默表達(dá)載體獲得鹽芥EsABI1沉默植株，研究EsABI1在ABA誘導(dǎo)下的表達(dá)特點(diǎn)，為進(jìn)一步研究鹽芥EsABI1功能及ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制提供基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1研究材料。鹽芥的種子采自山東省東營鹽堿地，幼苗時(shí)生長于22 ℃光照培養(yǎng)箱約14 d，再4 ℃低溫春化約30 d移至22～25 ℃人工氣候室。

1.1.2載體和菌種。pBluescript KS、pRT101、pCAMBIA3301克隆載體以及大腸桿菌DH10B、農(nóng)桿菌GV3101均由筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.3試劑。限制性內(nèi)切酶、連接酶、RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、DNA 聚合酶購自TaKaRa 公司。IPTG、XGal、Ampicillin、kanamycin購自Sigma 公司，除草劑FINALE Herbicide（Glufosinateammonium 11.33%，其他成分88.67%）購自Bayer Environmental Science公司。質(zhì)粒提取液、Geneclean回收系統(tǒng)為筆者所在實(shí)驗(yàn)室自制。其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純。所用引物由上海生物工程公司合成。

1.2方法

1.2.1Trizol法提取鹽芥總RNA。將25 ℃光照培養(yǎng)14～21 d的鹽芥按Trizol法提取總RNA，紫外分光光度計(jì)檢測RNA濃度和A260/A280，放于-80 ℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2引物設(shè)計(jì)與PCR擴(kuò)增。根據(jù)鹽芥EsABI1和EsActin等基因序列，利用 Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)用于EsABI1基因沉默構(gòu)建和實(shí)時(shí)定量PCR等引物，引物序列見表1。

1.2.3反轉(zhuǎn)錄PCR和EsABI1基因cDNA克隆。Oligo（dT） 1 μL，RNA 0.1～2.0 μg，DEPCH2O x μL，總體積 12 μL，混勻，離心后70 ℃，5 min；5×RTBuffer 4 μL，RNase inhibitor 1 μg，dNTP 2 μL，反轉(zhuǎn)錄酶1 μL，總體積 20 μL，混勻后離心，進(jìn)行RT：42 ℃ 60 min，99 ℃ 5 min，5 ℃ 5 min，得到20 μL反轉(zhuǎn)錄的cDNA。使用EsABI1基因cDNA全長引物，Pyrobest taq酶PCR擴(kuò)增EsABI1基因cDNA全長序列； Geneclean法回收基因片段。將以上DNA的回收片段與酶切后的KS載體進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌后的陽性克隆進(jìn)行測序，得到正確的KS∷EsABI1重組子。

1.2.4鹽芥EsABI1基因沉默載體的構(gòu)建和農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化。以上測序正確的KS∷EsABI1質(zhì)粒為模板，使用EsABI1基因沉默引物，Pyrobest taq酶進(jìn)行高保真PCR反應(yīng)，Geneclean法回收約218 bp用于EsABI1基因沉默片段。BamH Ⅰ酶切以上PCR產(chǎn)物，BamH Ⅰ和SmaⅠ雙酶切載體PINT4 （在pRT101中）；將這兩酶切產(chǎn)物連接、轉(zhuǎn)化。再以EcoR Ⅰ酶切以上PCR產(chǎn)物，以EcoR Ⅰ和Pml Ⅰ雙酶切以上檢測為陽性克隆的質(zhì)粒，連接組成含有反向互補(bǔ)片斷的載體，并用BamH Ⅰ酶切檢測；用Hind Ⅲ分別酶切上步中的重組質(zhì)粒和pCAMBIA3301質(zhì)粒，連接成重組質(zhì)粒。轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B，提質(zhì)粒后用Hind Ⅲ酶切驗(yàn)證。構(gòu)建成除草劑Basta為篩選標(biāo)記的EsABI1∷pCAMBIA3301沉默載體。EsABI1基因沉默載體轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌，Kan和Rif篩選陽性菌落，酶切驗(yàn)證正確的單克隆進(jìn)行其農(nóng)桿菌培養(yǎng)，用于鹽芥的轉(zhuǎn)化。

1.2.5鹽芥EsABI1沉默載體的植物轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)化子的篩選。使用含EsABI1基因沉默載體的根癌農(nóng)桿菌，用Floral dipping法[25]轉(zhuǎn)化鹽芥。收獲T1代種子，Basta除草劑篩選轉(zhuǎn)基因苗；播種T1代種子，幼苗出土7～21 d后，Basta篩選轉(zhuǎn)基因植株，單株收取T2代種子；種植T2代種子，統(tǒng)計(jì)黃苗和綠苗的棵數(shù)；播種T2代種子，Basta篩選純合T3代轉(zhuǎn)基因株系。提取轉(zhuǎn)基因植株的DNA，進(jìn)行Basta基因序列的PCR分子檢測。

1.2.6鹽芥EsABI1沉默植株的分子鑒定。CTAB法提取鹽芥EsABI1沉默植株和野生型的基因組DNA，以該DNA為模板、Basta基因序列為引物，進(jìn)行Bar基因的PCR擴(kuò)增。

1.2.7鹽芥EsABI1沉默植株的實(shí)時(shí)定量PCR檢測。Trizol法提取鹽芥野生型和EsABI1沉默植株的總RNA，用TaKaRa公司的RNA PCR Kit （AMV）Ver.3.0進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到10 μL cDNA，稀釋10倍，作為實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)的模板。根據(jù)DNA Engine Opticon Continuous Fluorescence Detection System對實(shí)時(shí)定量PCR體系的要求，引物退火溫度設(shè)計(jì)為60 ℃左右，擴(kuò)增模板的長度為90～110 bp。根據(jù)鹽芥EsABI1基因序列設(shè)計(jì)引物，所用的內(nèi)標(biāo)基因?yàn)辂}芥Actin2基因，根據(jù)NCBI上提供的鹽芥EsActin2基因序列設(shè)計(jì)引物，引物序列見表1。進(jìn)行Realtime PCR反應(yīng)：SYBR Green PCR Master Mix 10 μL，稀釋的cDNA模板1 μL， Primer-F：0.4 μL， Primer-R：0.4 μL，加ddH2O至20 μL；進(jìn)行PCR反應(yīng)（94 ℃ 3 min；94 ℃ 10 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 20 s，終點(diǎn)讀板，82 ℃ 1 s，終點(diǎn)讀板，39 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 7 min；熔解曲線分析：72～95 ℃逐步升溫，0.2 ℃/步，每個(gè)溫度停留1 s；結(jié)束）。

1.3分析軟件主要有CluastalX、Primer premier 5、DNAMAN、Blast等。

2結(jié)果與分析

2.1鹽芥EsABI1基因分子克隆、序列和蛋白結(jié)構(gòu)域分析

對實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的鹽芥EST庫中含EsABI1 cDNA的質(zhì)粒測序，得到長約2 121 bp的EsABI1 cDNA序列，根據(jù)NCBI Blast分析，其中開放閱讀框架為1 320 bp，其編碼439個(gè)氨基酸，5非編碼區(qū)為469 bp，3非編碼區(qū)為332 bp，全序列測序結(jié)果及氨基酸編碼情況如圖1所示。

用Trizol試劑提取鹽芥總RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa）進(jìn)行鹽芥總RNA的反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA；以該cDNA為模板，以EsABI1基因序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR，EsABI1基因大小約為1 320 bp（圖2），與預(yù)期一致；回收該P(yáng)CR產(chǎn)物，連入KS載體后測序驗(yàn)證。

對鹽芥EsABI1進(jìn)行蛋白質(zhì)Blast分析，發(fā)現(xiàn)EsABI1屬于PP2C蛋白磷酸酶家族，其與AtABI1氨基酸序列具92%的相似性。鹽芥EsABI1蛋白的第132～420個(gè)氨基酸含有PP2C蛋白磷酸酶催化活性的保守結(jié)構(gòu)域（圖3）。利用在線工具進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)EsABI1蛋白第177～185個(gè)氨基酸為PP2C蛋白磷酸酶催化位點(diǎn)FFGVYDGHG，如圖1、4中方框所示。

將鹽芥EsABI1與擬南芥幾種重要的PP2C蛋白氨基酸序列進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)鹽芥EsABI1與這幾種PP2C蛋白在氨基酸水平上具有較高的序列相似性，它們都含有包括PP2C蛋白磷酸酶活性催化位點(diǎn)在內(nèi)的11個(gè)較保守的功能結(jié)構(gòu)域，且這些保守區(qū)域都集中在氨基酸序列的中間到C端的區(qū)域（圖4）。

2.2鹽芥EsABI1的系統(tǒng)譜系分析

使用DNAMAN軟件，將鹽芥EsABI1氨基酸序列與多個(gè)物種的ABI1等PP2C蛋白的氨基酸序列進(jìn)行比對分析，建立包括鹽芥、擬南芥、玉米（Zea mays）、水稻（Oryza sativa）、山毛櫸（Fagus sylvatica）、小麥（Triticum aestivum）和煙草（Nicotiana tabacum）等不同物種的PP2C類蛋白氨基酸序列的系譜分析圖（圖5），結(jié)果顯示EsABI1與AtABI1屬于進(jìn)化上的同一分支，二者的親緣關(guān)系最近，EsABI1與AtABI1、AtABI2、AtHAB1、AtHAB2同處于一個(gè)較大的分支，AtAHG3則另屬于一個(gè)獨(dú)立的分支。

2.3鹽芥EsABI1沉默植株的獲得

2.3.1鹽芥EsABI1沉默載體的構(gòu)建。以含EsABI1 cDNA的質(zhì)粒為模板，用Pyrobest taq酶進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增后凝膠電泳分離得到218 bp左右的片段，Geneclean法回收PCR產(chǎn)物。BamH Ⅰ和Sma Ⅰ雙酶切載體PINT4 （在pRT101中），連接EsABI1基因的反向片段，用EcoR Ⅰ和Pml Ⅰ雙酶切上步的重組質(zhì)粒，連入正向片段，陽性克隆可用EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ雙酶切檢測；再用Hind Ⅲ酶切上步中的陽性克隆質(zhì)粒和pCAMBIA3301載體，連接、轉(zhuǎn)化，提質(zhì)粒后用Hind Ⅲ酶切驗(yàn)證。構(gòu)建成除草劑Basta為篩選標(biāo)記的EsABI1∷pCAMBIA3301沉默載體（圖6A）。

2.3.2鹽芥EsABI1沉默株系的篩選。用Floral dipping[26]法進(jìn)行鹽芥野生型遺傳轉(zhuǎn)化，收獲T1代種子；將轉(zhuǎn)化后的T1

代種子種植到營養(yǎng)土中，在幼苗出土14 d后噴施0.2%Basta溶液。非轉(zhuǎn)化苗在噴灑Basta溶液后開始黃化，并停止生長，7 d左右枯死；而抗性苗在噴灑Basta溶液后保持綠色（圖6B）。

2.3.3鹽芥EsABI1沉默株系的分子鑒定。將獲得的鹽芥EsABI1沉默植株，微量提取其基因組DNA；以轉(zhuǎn)基因植株及對照植株的DNA為模板、Bar基因特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，6株轉(zhuǎn)基因鹽芥植株可擴(kuò)增出Bar基因的特異條帶，大小約為500 bp，與預(yù)期一致；而野生型對照植株未出現(xiàn)陽性條帶（圖6C）。初步表明EsABI1∷pCAMBIA3301已整合到鹽芥基因組中。

提取鹽芥EsABI1 RNAi植株總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA；選擇鹽芥EsActin2基因作為內(nèi)標(biāo)，定量PCR檢測EsABI1基因的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，EsABI1 RNAi-1、2、3和4株系的EsABI1基因表達(dá)水平較對照均有不同程度的下降，分別為對照的0.581、 0.489、 0.617、0.446倍（圖6D）。

2.4ABA處理下鹽芥EsABI1沉默株系中EsABI1表達(dá)分析

對生長28 d的鹽芥野生型植株進(jìn)行以下處理：①200 mmol/L甘露醇模擬干旱處理9 h，EsABI1基因的表達(dá)水平約為對照（未處理）的7.50倍；②400 mmol/L NaCl處理24 h，EsABI1基因的表達(dá)水平約為對照的3.67倍；③4 ℃冷處理24 h，EsABI1基因的表達(dá)水平約為對照的2.20倍；④60 μmmol/L ABA處理12 h，EsABI1基因的表達(dá)水平約為對照的7.69倍。由此看出，EsABI1基因受干旱、NaCl、冷脅迫和ABA的誘導(dǎo)后表達(dá)上調(diào)，其中以干旱和ABA處理后的EsABI1表達(dá)上調(diào)最為顯著[27]。

該試驗(yàn)使用60 μmol/L ABA均勻噴施于鹽芥野生型、EsABI1 RNAi轉(zhuǎn)基因株系2和4的葉片，分別在3、6 h后取樣進(jìn)行RNA的提取，以鹽芥內(nèi)源的EsActin2為內(nèi)標(biāo)、未作ABA處理的鹽芥為對照，進(jìn)行Realtime PCR檢測分析，發(fā)現(xiàn) 60 μmol/L ABA處理3、6 h后，EsABI1 RNAi-2株系中EsABI1的表達(dá)水平分別為對照的4.09和5.10倍，EsABI1 RNAi-4株系中EsABI1的表達(dá)水平分別為對照的3.34和3.87倍；而鹽芥野生型株系在60 μmol/L ABA處理3和6 h后EsABI1基因的表達(dá)水平為對照的1.55和2.79倍（圖7）。其結(jié)果說明，ABA處理EsABI1基因沉默株系后，EsABI1的表達(dá)水平受外源ABA誘導(dǎo)后其上調(diào)程度大于野生型。

3討論

擬南芥的生物學(xué)和分子遺傳學(xué)研究表明，PP2C蛋白磷酸酶是植物信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程的關(guān)鍵因子，廣泛參與脫落酸的各種信號途徑，作為大多數(shù)信號途徑的負(fù)調(diào)控因子。PP2C能與激酶、其他調(diào)控蛋白結(jié)合或直接與DNA 結(jié)合，調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)。目前，使用正、反向遺傳學(xué)及生化分析等方法已在植物中鑒定了ABA信號通路的多種組分及ABA的多個(gè)作用靶點(diǎn)，特別是PP2C家族中ABI1、ABI2、AHG3、ATPP2CA和HAB1等蛋白活性、調(diào)控、基因表達(dá)及其與逆境脅迫關(guān)系的研究[27-30]，為深入探究ABA信號通路奠定了基礎(chǔ)。

鹽芥野生型在干旱、鹽、冷和ABA處理下，EsABI1表達(dá)均有不同程度的上調(diào)，其中干旱和ABA處理下EsABI1表達(dá)水平的上調(diào)最明顯，說明EsABI1基因的表達(dá)受以上脅迫的誘導(dǎo)，尤以干旱和ABA更敏感。對60 μmol/L ABA處理鹽芥野生型和EsABI1基因沉默株系后3、6 h的定量檢測發(fā)現(xiàn)，不論是鹽芥野生型還是EsABI1沉默株系，其EsABI1的表達(dá)水平均受ABA的誘導(dǎo)而表達(dá)上調(diào)，而且EsABI1表達(dá)水平在ABA處理3、6 h后的上調(diào)較野生型均更為顯著，說明鹽芥EsABI1基因與擬南芥AtABI1基因一樣，均是ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的負(fù)調(diào)控因子，可削弱植物對ABA的敏感性，進(jìn)而在植物的生長發(fā)育及其對逆境脅迫的應(yīng)答中起調(diào)控作用。

4結(jié)論

鹽芥EsABI1基因是其ABA信號通路的負(fù)調(diào)控因子，可能在其耐逆功能中起到一定的作用。后續(xù)研究將探討不同逆境脅迫下EsABI1基因表達(dá)水平的變化及其與下游互作蛋白間的關(guān)系，尋找ABA信號通路的新組分及其與鹽芥耐逆性的關(guān)系。

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