王玲玲　王忠　顧蘊潔

摘要[目的]研究高粱胚乳細胞中淀粉體的發(fā)育情況。[方法]采用光學顯微鏡和電子顯微鏡相結合的技術觀察高粱胚乳細胞。[結果]發(fā)育前期，高粱胚乳中的淀粉體主要由前質體發(fā)育形成，此時主要為單粒淀粉，少部分為復粒淀粉。發(fā)育中后期胚乳細胞中1個或多個淀粉體發(fā)生中心出現(xiàn)，淀粉體發(fā)生中心處有許多質體，質體以先形成環(huán)狀膜結構、后積累淀粉的方式形成淀粉體，此時胚乳細胞中的淀粉主要為單粒淀粉和半復粒淀粉，也有少部分為復粒淀粉。[結論]該研究為高粱胚乳淀粉體的發(fā)生和發(fā)育方式的多樣性提供了理論依據(jù)。

關鍵詞高粱；胚乳；淀粉體；淀粉體發(fā)生中心

中圖分類號S514文獻標識碼

A文章編號0517-6611（2017）30-0028-04

Abstract[Objective] The aim was to study development of amyloplasts in sorghum endosperm cells.[Method] The endosperm cells of sorghum was observed by the combination of light microscopes and electron microscopes.[Result] At the early stage of development，the amyloplasts in sorghum endosperm cells were mainly developed from proplastids，most of them were single starch granules，and also a small number of them were compound starch granules.During the middle and late stage of endosperm development，there were one or several occurrence centers of amyloplast in cells.Occurrence center of amyloplast produced many plasmids，and the plasmids always formed annular membrane structures first，then synthesize starch to make the plasmid become amyloplast.The starch granules in the endosperm cells mainly were single starch granules and semicompound starch granules，they also had a few number of compound starch granules.[Conclusion] The research can provide a theoretical basis for the diversity of the occurrence and development of the amyloids of sorghum endosperm.

Key wordsSorghum；Endosperm；Amyloplast；Occurrence center of amyloplast

高粱是人類重要的谷類作物之一，可食用、飼用、釀造用、工藝用，是綜合利用價值高的作物，具有抗逆性強、適應性廣、營養(yǎng)價值高、產(chǎn)量高等特點[1]。隨著我國酒釀造工業(yè)的發(fā)展，高粱種植越來越受人們的重視[2]。高粱籽粒作為釀造原料的主要成分是胚乳中的淀粉。因此，研究高粱胚乳發(fā)育對提高高粱籽粒生產(chǎn)具有重要意義。

高粱籽粒主要包括果皮、種皮、胚乳、胚，其中胚乳為主要組成部分，在整個發(fā)育過程中起主要作用。高粱胚乳的貯藏物質主要由淀粉和少量蛋白質組成。在發(fā)育早期，胚乳主要進行淀粉體的發(fā)生和增殖。在發(fā)育中期，胚乳主要合成并積累淀粉和蛋白質。目前關于高粱的研究主要集中在胚乳傳遞細胞上[3-4]，對胚乳淀粉體的研究還比較少，為了探明高粱胚乳淀粉體的發(fā)生發(fā)育規(guī)律，在前人研究的基礎上[5-7]，以高粱穎果為研究材料，采用半薄切片和超薄切片相結合的方法著重觀察胚乳淀粉體的形態(tài)結構及發(fā)育過程，探討胚乳淀粉體發(fā)生方式的多樣性，以期完善高粱胚乳的發(fā)育過程，為高粱育種和品質改良提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1供試材料供試高粱[Sorghum bicolor（L.）Moench]品種為KS-304，按常規(guī)方法種植于揚州大學農(nóng)學院網(wǎng)室。開花期采用掛牌和點穎相結合的方式標記開花時間，采集花后不同天數(shù)的穎果進行試驗。

1.2樣品的固定、包埋、切片、染色和觀察

將樣品置于2.5%戊二醛中，4 ℃下固定4 h后用0.1 mol/L PBS 清洗3次，0.5%鋨酸4 ℃下固定3 h，0.1 mol/L PBS 清洗3次，乙醇系列脫水，環(huán)氧丙烷置換，Spurr樹脂浸透包埋?；驅悠分糜诎捅韧租c緩沖液配制的1.2%高錳酸鉀固定液中，4 ℃下固定4 h后用巴比妥鈉緩沖液洗滌5次，乙醇系列脫水，環(huán)氧丙烷置換，Spurr樹脂浸透包埋。

將2種固定方法獲得的包埋塊修樣后置于Leica超薄切片機上切取厚度為1 μm的半薄切片，甲苯胺藍-O （TBO） 染色后置于光學顯微鏡下觀察。將切過半薄切片的包埋塊進一步修塊后用鉆石刀切取厚度為70 nm的超薄切片，經(jīng)醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色后在透射電子顯微鏡（Philips Tecnai 12）下觀察拍照。

2結果與分析

高粱胚乳細胞發(fā)育可分為游離核時期、胚乳細胞化時期、胚乳細胞生長分化期、胚乳成熟期[8-9]，其中胚乳細胞化期是營養(yǎng)物質淀粉和貯藏蛋白大量積累的時期，因此，研究主要集中在胚乳細胞化期。高粱胚乳半薄切片經(jīng)TBO染色后，細胞中的淀粉體被膜被染成淺藍色，貯藏蛋白被染成藍色，細胞核、細胞壁等也有不同程度的染色，細胞的整體結構較為清晰。

花后5 d，高粱胚乳細胞中主要被液泡所填充，此時細胞中尚未有淀粉體出現(xiàn)（圖1a）。花后6 d，高粱胚乳細胞中有少量淀粉體積累，這些淀粉體主要在細胞核附近最先出現(xiàn)，淀粉體體積較小，細胞中充斥著許多液泡（圖1b）?；ê? d，淀粉體體積增大，數(shù)量增多，主要呈卵圓型，沿細胞核和細胞壁附近分布（圖1c）?；ê?1 d，淀粉體數(shù)量持續(xù)增多，體積增大，細胞中開始積累蛋白體（圖1d）。花后13 d至花后18 d，細胞中淀粉體數(shù)量大幅增加，淀粉體體積仍在不斷增加；蛋白體數(shù)量增多，體積增大，主要分布在淀粉體之間和細胞壁附近（圖1e、f）。在花后18 d的高粱胚乳細胞中觀察到有些胚乳細胞中的淀粉體呈發(fā)射狀分布，淀粉體體積從發(fā)射中心向四周逐漸增大，將其命名為“淀粉體發(fā)生中心”，處于發(fā)生中心內部的淀粉體體積較小，處于發(fā)生中心外部的淀粉體體積較大（圖1f）。花后21 d，淀粉體逐漸增加至充滿整個胚乳細胞，此時淀粉體發(fā)生中心處的淀粉體分布較為松散，胚乳中的蛋白體明顯增多，蛋白體聚集在一起，體積較大（圖1g）。在高粱胚乳細胞中可以觀察到一個細胞中含有多個淀粉體發(fā)生中心（圖1h），圍繞在淀粉體發(fā)生中心周圍的淀粉體按各自的中心由內向外逐漸增大。發(fā)育后期，由于胚乳細胞中充實了較多的淀粉體，處于發(fā)生中心處的淀粉體相互擠壓呈不規(guī)則形（圖1i），細胞中的蛋白體相互融合形成蛋白質基質，主要分布在淀粉體之間以及淀粉體和細胞壁的間隙中。

采用透射電子顯微鏡進一步觀察發(fā)現(xiàn)，花后7 d，高粱胚乳細胞中開始有淀粉體出現(xiàn)，淀粉體主要通過原質體發(fā)育形成，呈球形，其周圍有大量內質網(wǎng)、蛋白體和高爾基體（圖2a、b）。觀察發(fā)現(xiàn)有的淀粉體中只含1個淀粉粒（圖2c），為單粒淀粉，有的含2個甚至多個淀粉粒，為復粒淀粉，淀粉粒周圍還有膜結構存在（圖2d、e、f），這些膜結構和淀粉粒的形成有關。

花后9 d，胚乳細胞中有淀粉體發(fā)生中心出現(xiàn)，發(fā)生中心處有大量豐富的質體，質體的大小和形狀各不相同。質體中有豐富的環(huán)狀膜結構，有的大環(huán)狀膜結構中還有小的環(huán)狀膜結構，淀粉粒在環(huán)狀膜的附近形成（圖3a、b、c）。花后11 d，淀粉體發(fā)生中心處有大量的質體管處于發(fā)生中心處的質體內部有豐富的環(huán)狀膜結構，有的質體管內只含有1個環(huán)狀膜結構，有的含有多個獨立的環(huán)狀膜結構，且環(huán)狀膜的大小各不相同（圖3d、e、f）?；ê?5 d，處于同一淀粉體發(fā)生中心處的質體有的已經(jīng)有淀粉粒形成，有的才剛開始形成環(huán)狀膜結構（圖3g、h），并且同一淀粉體內的淀粉粒的發(fā)育程度也各不相同，有的已經(jīng)形成大的淀粉粒，有的淀粉粒才剛剛開始形成（圖3i）。

對淀粉體發(fā)生中心進一步觀察發(fā)現(xiàn)，淀粉粒通常在環(huán)狀膜附近形成，隨后逐漸增大，充滿整個質體，形成單粒淀粉（圖4a、b、c）。含2個或多個環(huán)狀膜結構的質體可以積累2個或多個淀粉粒，并且同一淀粉體中的不同淀粉粒的發(fā)育程度和大小也各不相同（圖4d、e、f）。隨著細胞的不斷發(fā)育，有的淀粉體中的不同淀粉粒最終相互融合形成一個大的淀粉粒，為半復粒淀粉（圖4g、h、i、j）。在高粱胚乳中仍有少部分淀粉體最終含2個或多個淀粉粒，為復粒淀粉（圖4k、l）。

3結論與討論

GA-OsO4雙重固定制樣對蛋白質、脂類和多糖保存效果較好，細胞結構清晰，但細胞中內膜性結構不夠清晰，而高錳酸鉀固定制樣則能較好地顯示出細胞中的膜性結構，但是對多糖和蛋白質的呈色效果較差[10-13]。因此，采用GA-OsO4和高錳酸鉀固定相結合的方法，以求最大限度地觀察到樣品的真實狀況。

淀粉體中的淀粉粒從發(fā)生發(fā)育角度可分為3種類型：單粒淀粉（或單粒淀粉粒），即1個淀粉體中只積累1個淀粉粒，該淀粉粒只有1個發(fā)生中心（臍點）；復粒淀粉（或復粒淀粉粒），即1個淀粉體內積累多個淀粉粒，每個淀粉粒只有1個發(fā)生中心（臍點）；半復粒淀粉（或半復粒淀粉粒），即1個淀粉體內積累1個淀粉粒，但該淀粉粒有2個或2個以上的發(fā)生中心（臍點）[14-17]。國內學者一般認為高粱胚乳淀粉為單粒淀粉[5-6]，而筆者觀察發(fā)現(xiàn)，高粱胚乳淀粉主要為單粒淀粉和半復粒淀粉，也有少部分為復粒淀粉，這與其所處的發(fā)育階段相關。在發(fā)育初期，高粱胚乳淀粉體呈圓球狀，主要通過原質體發(fā)育而來，分布在細胞核和細胞壁附近，主要為單粒淀粉，也有部分為復粒淀粉。在胚乳發(fā)育中后期，細胞中有淀粉體發(fā)生中心出現(xiàn)，發(fā)生中心處有許多質體，這些質體以先形成環(huán)狀膜結構、后積累淀粉的方式形成淀粉體。此時，胚乳細胞中的淀粉主要為單粒淀粉和半復粒淀粉，也有少部分為復粒淀粉。在淀粉體積累淀粉的過程中，其膜結構起著至關重要的作用[18]。處在同一淀粉體發(fā)生中心處的質體的大小形狀以及發(fā)育程度各不相同，同一質體內的環(huán)狀膜結構的大小和發(fā)育程度也各不相同，同一淀粉體內淀粉粒的大小形狀、發(fā)育程度也各不相同，這就為高粱胚乳淀粉體的發(fā)生和發(fā)育提供了多樣性。

參考文獻

[1]

王海蓮，管延安，張華文，等.高梁基因組學研究進展[J].基因組學與應用生物學，2009，28（3）：549- 556.

[2] 王紅育，李穎.高粱營養(yǎng)價值及資源的開發(fā)利用[J].食品研究與開發(fā)，2006，27（2）：91-93.

[3] ZHENG Y K，WANG Z.Structural character of sorghum endosperm transfer cells and their relationship with embryo and endosperm[J].International journal of plant biology，2010，1：74-77.

[4] WANG H H，WANG Z，WANG F，et al.Development of basal endosperm transfer cells in Sorghum bicolor（L.） Moench and its relationship with caryops is growth[J].Protoplasma，2012，249（2）：309-321.

[5] 王忠，顧蘊潔，王慧慧，等.關于高粱胚乳細胞發(fā)育的研究[J/OL].中國科技論文在線，2013，6（5）：476-497[2007-08-11].http：//www.doc88.com/p-4983079986450.html.