楊水蓮　聶健　莫美華　崔淑蓮　李巖　鄧華明

摘要[目的]明確不同出菇處理方法對巨大口蘑菌絲體相關(guān)酶活性的影響。[方法]以巨大口蘑菌絲體為試驗材料，研究幾種不同出菇處理方法對其在不同時間內(nèi)3種酶活性的影響。[結(jié)果]能形成原基的3個處理組從菌絲恢復(fù)期到原基形成、現(xiàn)蕾階段，酪氨酸酶活性相對比較穩(wěn)定，不能形成原基的2個處理組酪氨酸酶先上升后下降，在第9天達(dá)到最大值，顯著高于其他3個處理組，說明酪氨酸酶過高反而抑制了原基形成；蛋白酶、淀粉酶活性在原基形成前都得到有效的激活作用，酶活性顯著高于不能形成原基的2個處理組。[結(jié)論]試驗結(jié)果為實現(xiàn)巨大口蘑從傳統(tǒng)的袋子覆土栽培向瓶子無土栽培出菇的轉(zhuǎn)變，了解巨大口蘑形成原基的相關(guān)機(jī)理提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞巨大口蘑；菌絲；原基形成；酶活性

中圖分類號S646文獻(xiàn)標(biāo)識碼A文章編號0517-6611（2017）33-0012-03

Effect of Different Mushroom Treatment Methods on Correlation Enzyme Activity of Giant Mushroom Mycelium

YANG Shuilian1， NIE Jian1， MO Meihua2 et al

（1.Lingnan Institute of Technology， Guangzhou， Guangdong 510663；2.South China Agricultural University， Guangzhou， Guangdong 510642）

Abstract[Objective] The aim was to clear effect of different mushroom treatment methods on correlation enzyme activity of giant mushroom mycelium. [Method] The giant mushroom was taken as tested materials， and the effect of different mushroom treatment methods on activity of three kinds of enzymes of its mycelium was studied. [Result] The tyrosinase activity of three treatments which could form primordium was relatively stable from the mycelial recovery period to primordium formation and budding stage；the tyrosinase activity of two treatments which could not form primordium firstly increased and then decreased， reached the maximum value on the 9th day， and was significantly higher than that of the other three treatments， which indicated that the higher tyrosinase could inhibit primordium formation. The activities of protease and amylase could be activated effectively before primordium formation， and was significantly higher than that of the other two treatments which could not form primordium. [Conclusion] The results provide theoretical basis for the transformation of giant mushroom from traditional bag soilcover culture to bottle soilless culture and understanding the relevant mechanism of primordium formation of giant mushroom.

Key wordsGiant mushroom；Mycelium；Primordium formation；Enzyme activity

巨大口蘑（Tricholoma giganteum）屬于擔(dān)子菌亞門層菌綱傘菌目口蘑科口蘑屬，又名大白口蘑、洛巴伊口蘑，商品名有金鞭口蘑、金福菇等，是一種珍稀的食藥用大型真菌[1]。多年來，巨大口蘑的生產(chǎn)方式都是覆土出菇[2-3]。筆者在此基礎(chǔ)上，參考杏鮑菇等食用菌的栽培方法[4]，用瓶子裝料接種，即待菌絲長滿瓶子并出現(xiàn)生理黃水后，搔菌，然后往瓶子內(nèi)注水，再把瓶子在適宜環(huán)境條件下倒扣放置培養(yǎng)7 d便能形成原基。而在實際生產(chǎn)過程中，用瓶子無土栽培巨大口蘑出現(xiàn)了出菇不整齊、出菇時間長等問題。食用菌原基的形成是出菇的基礎(chǔ)，而原基的形成除了基本營養(yǎng)和適合的環(huán)境條件外，還與相關(guān)酶活性的大小密切相關(guān)[5]。這些酶大多是誘導(dǎo)酶，它們的活性在時間上的表達(dá)順序與協(xié)同作用是食用菌內(nèi)源生化代謝的重要內(nèi)容。通過在基質(zhì)中添加一些有利于這些酶合成或表達(dá)的物質(zhì)，促進(jìn)誘導(dǎo)，加快代謝，提高酶活性的表達(dá)水平，或者通過在基質(zhì)中添加一些抑制劑，降低酶活性的表達(dá)，控制子實體的發(fā)生，提高產(chǎn)量，從生長代謝角度上研究子實體發(fā)生與發(fā)育[6-8]。通過不同的出菇處理方法，研究巨大口蘑從菌絲長滿后到子實體形成階段的菌絲酶活性，找出與原基的形成有關(guān)的酶，對于了解巨大口蘑在覆土栽培與無土栽培過程中各階段的營養(yǎng)需要，確定其利用規(guī)律具有重要的指導(dǎo)意義。為此，筆者研究了不同出菇處理方法對巨大口蘑菌絲體相關(guān)酶活性的影響。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1供試菌種。巨大口蘑。

1.1.2試劑。磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、L-酪氨酸、三氯醋酸、酪蛋白、福林試劑、鹽酸、3，5-二硝基水楊酸、淀粉、麥芽糖。

1.1.3主要儀器。生化培養(yǎng)箱、高速冷凍離心機(jī)、紫外可見分光光度計、恒溫水浴鍋、微量移液器。

1.2方法

1.2.1菌絲培養(yǎng)和出菇處理。

待菌絲長滿袋子并出現(xiàn)生理黃水后，打開袋子，覆上一層厚3 cm的菜園土[9]。同時，待菌絲長滿瓶子并出現(xiàn)生理黃水后，開蓋搔菌，再往瓶子內(nèi)注水，然后分別把瓶子倒扣處理和正放處理。此后每天以相同的方式對幾種不同出菇處理方法進(jìn)行管理，并保持菇房的溫度為28～30 ℃，濕度為85%～95%[10]。

1.2.2酪氨酸酶活性測定。

參照魏要武等[11]的方法，并加以修改。取1 g新鮮菌絲的培養(yǎng)料，放入研缽中，加入5.00 mL 預(yù)冷的0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 6.8），冰浴研磨成勻漿，4 ℃、5 000 r/min離心20 min，上清液作為酶提取液。在比色皿中分別加入3.95 mL含1 mmol/L L-酪氨酸的磷酸鹽緩沖液（pH 6.8），然后加入0.05 mL酶液并迅速混勻，立即用紫外可見分光光度計在317 nm波長處測定吸光值的變化，連續(xù)測定10 min。以吸光率增加的最初直線段斜率來計算酶活力。酶活力單位（U）定義為：測定條件（20 ℃）下1 min引起OD值變化0.1為1個酶活力單位。

1.2.3蛋白酶活性測定。

取1 g新鮮菌絲的培養(yǎng)料，放入研缽中，加入5 mL 0.02 mol/L磷酸緩沖溶液（pH 7.4），充分磨勻后，4 ℃、10 000 r/min離心10 min，上清液即為菌絲的粗酶液。蛋白酶活力的測定按黃卓烈[12]的方法。規(guī)定：在一定的反應(yīng)條件下，1 min水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸的酶量為1個酶活力單位。

1.2.4淀粉酶活性測定。

取1 g新鮮菌絲的培養(yǎng)料，放入研缽中，加入5 mL 0.05 mol/L磷酸緩沖液（pH 6.8），充分磨勻后，4 ℃、10 000 r/min離心10 min，上清液即為菌絲的粗酶液。酶活力的測定按黃卓烈[12]的方法。規(guī)定：在一定的反應(yīng)條件下，淀粉酶1 min催化淀粉水解生成1 μmol麥芽糖的酶量定義為1個酶活力單位。

1.3數(shù)據(jù)分析

采用DPSv 9.50數(shù)理統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2結(jié)果與分析

2.1不同出菇處理方法對巨大口蘑菌絲體內(nèi)酪氨酸酶的影響

由圖1可知，5種不同處理的菌絲體內(nèi)酪氨酸酶活性都呈先上升后下降的趨勢，覆土、瓶子搔菌后正放1和倒扣1的酪氨酸酶活性在整個過程都比較低，而瓶子搔菌后正放2和倒扣2的酪氨酸酶活性在第6天后急劇上升，在第9天出現(xiàn)最高峰，分別達(dá)55.663 3和88.280 3 U/g，之后下降。第18天5種不同處理的菌絲體內(nèi)酪氨酸酶活性接近。

2.2不同出菇處理方法對巨大口蘑菌絲體內(nèi)蛋白酶的影響

由圖2可知，覆土處理、瓶子搔菌后正放1和倒扣1的蛋白酶活性不斷上升，在第21天（現(xiàn)蕾期）達(dá)到最大值，分別為582.075 0、664.697 5和677.579 3 U/g，顯著高于正放2和倒扣2的蛋白酶活性。正放2和倒扣2的蛋白酶活性未被有效激活，整個過程蛋白酶活性變化不明顯，一直處于較低水平。

2.3不同出菇處理方法對巨大口蘑菌絲體內(nèi)淀粉酶的影響

由圖3可知，第0～9天5種不同處理方法的淀粉酶活性差異不顯著，均處于較低水平。第9天起，覆土處理、正放1和倒扣1的淀粉酶活性快速上升，顯著高于其他2組處理。正放2和倒扣2在后期淀粉酶活性有所上升，但變化不明顯。

圖2不同出菇處理方法對巨大口蘑菌絲體內(nèi)蛋白酶活性的影響

Fig.2Effect of different mushroom treatment methods on protease activity of giant mushroom mycelium

3結(jié)論與討論

試驗通過對巨大口蘑覆土后和瓶子搔菌后不同處理其菌絲體內(nèi)3種酶活性的變化規(guī)律進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)3種酶在不同階段活性變化具有顯著差異。覆土處理、瓶子搔菌后正放1和倒扣1在第18天均能形成原基，在第21天均能長出小菇蕾，而瓶子搔菌后正放2和倒扣2在測定的整個過程中未能形成原基。由此可見，巨大口蘑從菌絲恢復(fù)期到原基形成、現(xiàn)蕾階段，不需要很高的酪氨酸酶活性，較高的酪氨酸酶活性抑制了菌絲扭結(jié)形成原基；而蛋白酶、淀粉酶活性在原基形成前都需要得到有效的激活作用，酶活性顯著高于不能形成原基的處理組。

酪氨酸酶是一類廣泛存在于植物體中含 Cu 的結(jié)合酶，一起參與呼吸末端氧化還原反應(yīng)[13]。該研究發(fā)現(xiàn)，能形成原基的處理組在第6天酪氨酸酶活性有所升高，之后趨于平緩，與不能形成原基的處理組相比處于較低水平，可能是這個過程菌絲體內(nèi)產(chǎn)生了酪氨酸酶的有效抑制劑[14]。而瓶子搔菌后正放2和倒扣2的酪氨酸酶活性呈現(xiàn)先上升后下降的過程，在第9天達(dá)到最高峰，顯著高于其他3個處理。可能是因為菌絲體的呼吸作用受阻，激發(fā)了酪氨酸酶的活性，酶活性很高，菌絲營養(yǎng)生長沒有結(jié)束，不能扭結(jié)形成原基，未具備產(chǎn)實的內(nèi)在條件，即使有合適的外界環(huán)境，也不能出菇。具體原因還有待進(jìn)一步研究。

該研究結(jié)果顯示，能形成原基的處理組蛋白酶活性都呈現(xiàn)不斷上升的趨勢，與前人的描述一致[15]。蛋白酶活性的升高為新物質(zhì)的合成積累氮源，當(dāng)積累到一定程度時，誘導(dǎo)原基發(fā)生。而不能形成原基的處理組蛋白酶活性無明顯變化，一直處于較低水平，說明該處理缺乏誘導(dǎo)蛋白酶應(yīng)答反應(yīng)的條件，缺乏物質(zhì)的轉(zhuǎn)換和積累，菌絲徒長，一直維持在營養(yǎng)生長階段，因而難以形成原基，這與張樂[16]的研究結(jié)果一致。

研究表明，淀粉酶在食用菌菌絲生長階段高，在子實體期降低[17]，說明在栽培前期大部分淀粉類物質(zhì)被分解利用，在栽培后期則利用較少。該研究發(fā)現(xiàn)，5種處理的淀粉酶在前期階段活性較低，從第9天起能形成原基的處理組淀粉酶活性快速上升。這可能是因為培養(yǎng)料中的不需要用到淀粉酶起分解作用的小分子物質(zhì)在菌絲恢復(fù)期營養(yǎng)生長階段被消化完后，需要進(jìn)一步分解淀粉類大分子物質(zhì)以滿足菌絲體不斷成長、扭結(jié)和形成原基的營養(yǎng)需求。而瓶子搔菌后正放2和倒扣2淀粉酶活性在整個階段變化不明顯，推測其在第21天未能形成原基可能與淀粉酶活性較低有密切關(guān)系。而趙亞東[17]對秀珍菇胞外酶的研究表明，胞外淀粉酶活性的高低與秀珍菇現(xiàn)蕾的早晚不相關(guān)。

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