郝日禮 鄭佳佳 朱傳合

摘要 [目的]確定酒糟類黑精最佳超聲提取工藝參數(shù)。[方法]以酒糟為原料，采用單因素試驗(yàn)、Plackett-Burman設(shè)計(jì)、最陡爬坡試驗(yàn)及Box-Behnken設(shè)計(jì)進(jìn)行超聲輔助酒糟類黑精提取工藝研究。[結(jié)果]試驗(yàn)確定酒糟中類黑精的最佳條件為超聲時(shí)間23 min、超聲溫度55 ℃、pH 1.0、料液比1∶29（mg∶mL）、超聲功率540 W、顆粒直徑270 μm，該條件下酒糟中類黑精的提取率為66.92%。[結(jié)論]該研究可為類黑精的開發(fā)應(yīng)用提供參考。

關(guān)鍵詞 酒糟；類黑精；超聲輔助提取

中圖分類號(hào) TS261 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2017）06-0071-05

Optimization for Ultrasonic-assisted Extraction of Melanoidin from Vinasse

HAO Ri-li， ZHENG Jia-jia， ZHU Chuan-he*

（College of Food Science and Engineering， Shandong Agricultural University， Taian， Shandong 271018）

Abstract [Objective] The ultrasonic-assisted extraction technology of melanoidin from vinasse was optimized.[Method] With vinasse as raw material， single factor test， Plackett-Burman design（PB）， the steepest ascent method and Box-Behnken design （BB） was used to establish the optimal processing.[Result]The optimal conditions were as followed： ultrasonic treatment of 23 min， ultrasonic treatment temperature 55 ℃， pH 1.0， ratio of material and liquor 1∶29（mg∶mL）， ultrasound power 540 W and particle diameter 270 μm.The extraction rate is 66.92%.[Conclusion] The study can lay a foundation for development and application of melanoidin.

Key words Vinasse；Melanoidin；Ultrasonic-assisted extraction

酒糟作為谷物中蒸出酒精或酒精飲料后的殘?jiān)?，常被作為家畜的飼料。我?guó)白酒釀造行業(yè)每年產(chǎn)生大量酒糟，不僅利用率低而且?guī)碇T多環(huán)境問題。食品類黑精是指羰基化合物與帶有游離氨基的含氮化合物之間發(fā)生美拉德反應(yīng)時(shí)后期形成的棕褐色大分子量聚合產(chǎn)物[1]。研究表明，食品類黑精具有一定的抗氧化、抗誘變、降糖、結(jié)合風(fēng)味物質(zhì)的作用，另外還具有類似膳食纖維的功能[2]。傳統(tǒng)抗氧化劑因可能具致癌性被部分國(guó)家禁止使用，從天然產(chǎn)品中提取的類黑精可能成為安全替代品之一。白酒的高溫釀造過程中羰氨反應(yīng)下類黑精的生成，為酒糟類黑精的提取研究奠定了基礎(chǔ)。

目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者已對(duì)咖啡、李子干[3]、焙烤食品[4]、豆豉[5]、蜂蜜[6-7]、奶酪[8]、醬油[9-10]、甜葡萄酒[11]等真正褐色食品體系美拉德反應(yīng)類黑精及其中間體進(jìn)行了提取分離以及研究，但鮮有從酒糟中提取類黑精的技術(shù)研究。筆者以芝麻香型酒糟為原料，采用超聲輔助提取，通過測(cè)定清除羥基自由基的能力來確定酒糟類黑精的提取率，進(jìn)而確定工藝參數(shù)，為類黑精的應(yīng)用研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料及主要試劑。

芝麻香型酒糟由泰安生力源集團(tuán)提供，60 ℃烘干、粉碎后過篩備用；乙醇、硫酸亞鐵、水楊酸、雙氧水等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.2 主要儀器設(shè)備。

UV-2450紫外分光光度計(jì)，日本島津有限公司；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州市華普達(dá)教學(xué)儀器有限公司；TDZ5-WS臺(tái)式低速離心機(jī)，長(zhǎng)沙高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)湘儀離心機(jī)儀器有限公司；KQ-600DB型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 類黑精提取率的測(cè)定。

清除羥基自由基的測(cè)定采用Fenton反應(yīng)水楊酸法[12]，略有改動(dòng)。

分別配制0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 mg/mL抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)溶液，測(cè)定其羥基自由基清除率，以羥基自由基清除率（Y）為縱坐標(biāo)，抗壞血酸濃度（X）為橫坐標(biāo)，得標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程：Y=384.06 x-5.471（R2=0.996 7）。

準(zhǔn)確稱取酒糟干粉1.000 g，置于250 mL三角瓶中，加入溶劑混勻，在不同條件下提取，3 500 r/min離心15 min，取上清液定容待測(cè)。測(cè)定樣品液的羥自由基清除率，根據(jù)抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程，計(jì)算酒糟類黑精的提取率。

酒糟類黑精提取率（%）=C×V×100/m式中，C為按照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出的類黑精的抗壞血酸質(zhì)量濃度（mg/mL）；V為樣液體積（mL）；m為1 g酒糟完全提取時(shí)抗壞血酸的質(zhì)量（g）。

1.2.2 酒糟類黑精提取工藝參數(shù)的優(yōu)化。

以乙醇濃度、超聲時(shí)間、超聲功率、超聲溫度、料液比（mg∶mL）、顆粒度、pH為考察對(duì)象，采用單因素試驗(yàn)、Plackett-Burman（PB）試驗(yàn)、最陡爬坡試驗(yàn)及Box-Behnken（BB）試驗(yàn)，獲取最適工藝參數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 乙醇濃度對(duì)類黑精提取率的影響。

在料液比1∶20、超聲功率300 W、超聲時(shí)間30 min、超聲溫度30 ℃、顆粒直徑380 μm的條件下，考察不同濃度乙醇對(duì)類黑精提取率的影響。由圖1可見，提取率隨著乙醇濃度的增大明顯減小，當(dāng)采用無水乙醇提取時(shí)提取率小于5%，這可能是該物質(zhì)醇溶性較低導(dǎo)致。因此，選擇水作為提取溶劑。

2.1.2 超聲時(shí)間對(duì)類黑精提取率的影響。

當(dāng)料液比為1∶20、超聲功率300 W、超聲溫度30 ℃、顆粒直徑380 μm時(shí)，考察不同超聲時(shí)間處理對(duì)類黑精提取率的影響。由圖2可知，隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，提取率呈現(xiàn)出上升的趨勢(shì)，并且在30 min時(shí)間范圍內(nèi)迅速升高，在30 min后增幅變緩，趨于穩(wěn)定。由此，確定超聲時(shí)間為30 min。

2.1.3 料液比對(duì)類黑精提取率的影響。

在超聲時(shí)間30 min、超聲功率300 W、超聲溫度30 ℃、顆粒直徑380 μm條件下，考察不同料液比對(duì)類黑精提取率的影響。由圖3可知，類黑精提取率隨料液比中溶劑用量的增大呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，但1∶25后上升趨勢(shì)不明顯。本著經(jīng)濟(jì)的原則，選擇1∶25為進(jìn)一步試驗(yàn)條件。

2.1.4 顆粒度對(duì)類黑精提取率的影響。

在料液比1∶25、超聲溫度30 ℃、超聲時(shí)間30 min、超聲功率300 W的條件下，研究不同顆粒直徑（380、270、250、212、160 μm即40、50、60、70、90目）對(duì)類黑精提取率的影響。由圖4可以看出，當(dāng)顆粒直徑小于270 μm，其對(duì)酒糟類黑精提取率的影響不顯著（P<0.05），故選取顆粒直徑270 μm進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.1.5 超聲功率對(duì)類黑精提取率的影響。

在料液比1∶25、超聲溫度30 ℃、超聲時(shí)間30 min、顆粒直徑270 μm條件下，研究不同超聲功率對(duì)類黑精提取率的影響。

由圖5可以看出，當(dāng)功率增加時(shí)，類黑精的提取率相應(yīng)增加，當(dāng)功率達(dá)到540 W時(shí)出現(xiàn)最高值，而后有所下降。分析原因，低功率超聲的空化作用對(duì)類黑精的提取有利，高功率則對(duì)其結(jié)構(gòu)造成破壞。同時(shí)，比較超聲處理和未超聲處理（0 W）的提取率發(fā)現(xiàn)，浸泡提取率僅為28.2%，超聲輔助提取極大地提高了類黑精提取率。

2.1.6 超聲溫度對(duì)類黑精提取率的影響。

在料液比1∶25、超聲時(shí)間30 min、超聲功率540 W、顆粒直徑270 μm的條件下，研究不同超聲溫度對(duì)類黑精提取率的影響。由圖6可見，類黑精的提取率隨著浸提溫度的增加有所提高，在60 ℃時(shí)達(dá)到最大值，故選取60 ℃作為進(jìn)一步提取溫度。

2.1.7 pH對(duì)類黑精提取率的影響。

在料液比1∶25、超聲時(shí)間30 min、超聲功率540 W、超聲溫度60 ℃、顆粒直徑270 μm的條件下，考察不同pH對(duì)類黑精提取率的影響。由圖7可知，隨著pH的提高，類黑精的提取率呈現(xiàn)先降低后增加的趨勢(shì)?？紤]到堿性環(huán)境對(duì)類黑精易造成破壞，故選擇pH 2.0作為提取條件。

2.2 PB試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選用n=12，中心點(diǎn)數(shù)為3的PB設(shè)計(jì)，對(duì)超聲時(shí)間（X1）、超聲溫度（X2）、pH（X3）、料液比（X4）及顆粒度（X5）5個(gè)因素進(jìn)行考察，試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1，結(jié)果見表2。

采用Minitab15軟件對(duì)表2中試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)，回歸模型的P<0.001（P<0.05），決定系數(shù)R2為87.75%，說明回歸方程擬合良好，其顯著性分析結(jié)果見表3。

表3中顯著性分析表明超聲時(shí)間、超聲溫度、pH、料液比P值均小于0.05，為影響酒糟類黑精提取率的顯著因子，作為進(jìn)一步考察因素；而顆粒度為不顯著因子。影響顯著的因素中，按其影響由大到小分別為超聲時(shí)間、超聲溫度、pH、料液比；其中超聲時(shí)間、超聲溫度和pH系數(shù)為負(fù)數(shù)，說明在該試驗(yàn)所選擇的范圍內(nèi)響應(yīng)值隨其增大而減小；料液比系數(shù)為正值，表明料液比處于高水平時(shí)響應(yīng)值相對(duì)較大。

2.3 最陡爬坡試驗(yàn)

以PB試驗(yàn)確定的顯著因素為爬坡試驗(yàn)的因素，用各顯著因素的正負(fù)效應(yīng)確定最陡爬坡試驗(yàn)的路徑（包括變化方向和變化步長(zhǎng)），進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表4。

由表4可知，在3號(hào)試驗(yàn)處達(dá)到最高點(diǎn)，該點(diǎn)對(duì)應(yīng)的條件值為超聲時(shí)間21 min、超聲溫度54 ℃、pH 1.1、料液比1∶28。

2.4 BB試驗(yàn)

根據(jù)最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果，采用響應(yīng)面設(shè)計(jì)，運(yùn)用BB中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理[13]，選擇對(duì)酒糟類黑精提取率影響顯著的4個(gè)因素，超聲時(shí)間（X1）、超聲溫度（X2）、pH（X3）和料液比（X4）為自變量，以類黑精提取率（Y）為因變量，做4因素3水平BB試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表5，結(jié)果見表6。

2.4.1 參數(shù)分析。

利用SAS 8.0軟件對(duì)表6中BB試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果進(jìn)行回歸分析，并對(duì)模型系數(shù)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果得出，

FX1=25.110 01，PX1=0.000 304；

FX2=20.986 23，PX2=0.000 631；

FX3=0.002 434，PX3=0.961 464；

FX4=45.586 76，PX4=0.000 1；

FX21=29.577 89，PX21=0.000 15；

FX1X2=2.254 442，PX1X2=0.159 079；

FX1X3=5.493 276，PX1X3=0.037 13；

FX1X4=4.408 449，PX1X4=0.057 583；

FX22=34.108 88，PX22=0.000 1；

FX2X3=0.838 207，PX2X3=0.377 941；

FX2X4=0.005 365，PX2X4=0.942 82；

FX23=23.763 01，PX23=0.000 382；

FX3X4=5.379 429，PX3X4=0.038 812；

FX24=11.958 61，PX24=0.004 734；

F模型=11.644 47，P模型=0.000 1；

F線性=22.921 36，P線性=0.000 1；

F二次項(xiàng)=13.239 49，P二次項(xiàng)=0.000 234；

F交叉乘積=3.063 195，P交叉乘積=0.046 786；

F失擬項(xiàng)=15.992 16，P失擬項(xiàng)=0.060 251。

由此表明二次多項(xiàng)式具有高度的顯著性；失擬項(xiàng)P=0.060 251>0.05，不顯著；CV=0.631 825<10；同時(shí)，模型的R2=93.14%，表明試驗(yàn)數(shù)據(jù)與回歸數(shù)學(xué)模型擬合性良好[14]，上述模型可較好地預(yù)測(cè)各指標(biāo)實(shí)際值。

根據(jù)P值檢驗(yàn)各模型系數(shù)的顯著性，同時(shí)也可反映變量之間交互作用大小，P值越小越顯著。表明，一次項(xiàng)和二次項(xiàng)對(duì)提取率的影響極顯著（P<0.01），交互項(xiàng)顯著（P<0.05）。超聲時(shí)間（X1）、超聲溫度（X2）和料液比（X4）對(duì)酒糟類黑精的線性效應(yīng)皆極顯著，pH（X3）不顯著；各因素影響由大到小分別是：料液比（X4）、超聲時(shí)間（X1）、超聲溫度（X2）、pH（X3）。交互項(xiàng)中X1X3、X3X4影響顯著（P<0.05），X1X2、X1X4、X2X3、X2X4均不顯著。

2.4.2 參數(shù)優(yōu)化。

在對(duì)類黑精提取率回歸模型的建立及檢驗(yàn)對(duì)各因素回歸擬合后，得到回歸方程：

Y=66.373 33+0.592 5X1+0.541 667X2-0.005 833X3+0.798 333X4-0.964 583X21-0.307 5X1X2-0.48X1X3+0.43X1X4-1.035 833X22-0.187 5X2X3+0.015X2X4-0.864 583X23-0.475X3X4-0.613 333X24。

利用該回歸方程確定，編碼值為x1=0.633 587，x2=0.220 084，x3=-0.496 450，x4=1.067 846；此時(shí)響應(yīng)值達(dá)到最大穩(wěn)定預(yù)測(cè)值67.048 34。將上述編碼值進(jìn)行轉(zhuǎn)化，并結(jié)合情況確定酒糟類黑精最佳提取工藝：超聲時(shí)間23 min、超聲溫度55 ℃、pH 1.0、料液比1∶29（mg∶mL）。在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，3次平行試驗(yàn)類黑精提取率為（66.92±0.226）%，與預(yù)測(cè)值較為接近，說明回歸方程能夠比較真實(shí)地反映各因素對(duì)類黑精提取率的影響，得到的酒糟類黑精提取條件具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

3 結(jié)論

該試驗(yàn)通過未超聲和超聲輔助提取的類黑精提取率比較，結(jié)果顯示，超聲輔助提取能夠顯著提高酒糟類黑精提取率。在BB試驗(yàn)選擇范圍內(nèi)，pH、超聲時(shí)間、超聲溫度和料液比為影響超聲輔助酒糟類黑精提取率的顯著因素，其影響由大到小分別是：料液比、超聲溫度、超聲時(shí)間及pH。超聲輔助酒糟類黑精最佳提取工藝：超聲時(shí)間23 min、超聲溫度55 ℃、pH 1.0、料液比1∶29（mg∶mL）、超聲功率540 W、顆粒直徑270 μm。

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