宋文韜 趙云

摘要 [目的]探究夾竹桃不同部位提取物對赤子愛勝蚯蚓的毒性效應(yīng)。[方法]采用索式提取法制備夾竹桃乙醇提取物，配制不同濃度提取物溶液通過不同方式處理蚯蚓，進行蚯蚓中毒反應(yīng)及死亡率研究。[結(jié)果]夾竹桃的莖皮和葉乙醇提取物對蚯蚓具有毒害作用，新鮮莖皮的毒力較葉強，干燥后毒力減弱。鮮莖皮乙醇提取物濃度≤2.0 mg/mL時，蚯蚓的死亡率較低，可正常生活。[結(jié)論]夾竹桃對蚯蚓的毒害作用主要集中在莖皮中，制作植物源農(nóng)藥時可以優(yōu)先選用。莖皮提取物濃度為1.0～2.0 mg/mL可起到殺蟲的效果。

關(guān)鍵詞 夾竹桃；蚯蚓；植物源農(nóng)藥；乙醇提取物

中圖分類號 X174 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2017）06-0043-05

The Toxicity Effects of Extracts of Nerium indicum Mill on Eisenia fetida

SONG Wen-tao1，ZHAO Yun2 （1.Sixth Middle School in Hefei，Hefei，Anhui 230000；2.School of Life Sciences，Hefei Normal University，Hefei，Anhui 230061）

Abstract [Objective]To study the toxicity effects of extracts of Nerium indicum Mill on earthworm Eisenia fetida. [Methods]Crude ethanol extract of different organs in Nerium indicum by the method of soxhlet extraction was used to study symptoms of poisoning and death situation for Eisenia fetida. [Result] Ethanol extracts of bark and leaves of Nerium indicum have toxic effects on Eisenia fetida. The toxity of fresh bark was stronger than that of leaves， with less toxity when it was dried. Chart draws that when concentration of the fresh barks ethanol extract was no higher than 2.0 mg/mL， death situation of Eisenia fetida was low and it can live a normal life. [Conclusion] The poisoning effects of Nerium indicum on Eisenia fetida mainly concentrates in the bark. So it was preferred in terms of the production of botanical pesticides. The extracts concentration of the bark which met the state requirements for production of pesticides was 1.0-2.0 mg/mL.

Key words Nerium indicum Mill；Eisenia fetida；Botanical pesticides；Ethanol extract

農(nóng)藥的大量使用必然會影響自然界的生物群落和生態(tài)體系。研究發(fā)現(xiàn)，使用農(nóng)藥會對土壤生物產(chǎn)生各種影響。隨著蚯蚓人工養(yǎng)殖業(yè)的開展及其在飼料、食品、藥物等行業(yè)的廣泛應(yīng)用，被國際經(jīng)濟與合作組織（OECD）選作環(huán)境監(jiān)測的指示動物。蚯蚓毒理學(xué)是蚯蚓生態(tài)學(xué)的重要分支，主要是利用蚯蚓作為測試生物對可能造成土壤環(huán)境損害的污染物進行測試，并根據(jù)這些污染物質(zhì)對蚯蚓的毒害程度，評價其可能對生態(tài)系統(tǒng)及其組分的危害程度。蚯蚓也是食物鏈中的重要環(huán)節(jié)，許多鳥類和哺乳動物以蚯蚓為食物，但土壤中的有些農(nóng)藥（如甲拌磷、克百威）可使蚯蚓大大減少，或者蚯蚓會富集農(nóng)藥使許多鳥類和哺乳動物中毒死亡[1-3]。

夾竹桃（Nerium indicum Mill）為夾竹桃科夾竹桃屬植物，原產(chǎn)印度、伊朗和阿富汗，在我國栽培歷史悠久，我國各省區(qū)均有栽培。夾竹桃莖皮纖維為優(yōu)良混紡原料，又可提制強心劑；根及樹皮含有強心甙和酞類結(jié)晶物質(zhì)及少量精油；莖葉可制殺蟲劑[4-8]，其莖、葉、花朵均有毒，研究表明，全株或其根、莖、葉、花提取物對棉花害蟲[棉鈴蟲（Helicoverpa armigera Hubner）]、水稻害蟲[二化螟（Chilo suppressalis）、褐飛虱（Nilaparvata lugens）、白背飛虱（Sogatella furcifera）和灰飛虱（Laodelphax striatellus）]、蔬菜害蟲（菜青蟲、蚜蟲）及儲糧害蟲[米象（Sitophilus oryzae Linne ）、綠豆象（Callosobruchus chinensis）、四紋豆象（Callosobruchus maculatus）]等多種害蟲具有胃毒、觸殺、拒食、抑制生長發(fā)育的作用[4-8]。夾竹桃提取液還有抑菌、殺線蟲和殺釘螺的作用[9-12]。夾竹桃葉乙醇提取物對福壽螺（Pomacea canaliculata）也有顯著的毒殺作用[12-14]。然而，目前對土壤動物蚯蚓的毒性研究卻鮮見報道。

由于蚯蚓能促進土壤有機質(zhì)的分解，并對重金屬具有富集作用，已廣泛應(yīng)用于有機廢棄物處理及環(huán)境凈化。然而，農(nóng)藥的廣泛使用，必將對蚯蚓的生存、生長、繁殖產(chǎn)生不利影響[2]。因此，研究植物源農(nóng)藥對蚯蚓的毒性作用是評價農(nóng)藥對生態(tài)環(huán)境安全性的重要指標。為了更進一步了解夾竹桃毒物，筆者通過研究夾竹桃不同部位提取液的毒性來評價這些物質(zhì)對環(huán)境安全的影響，旨在為準確評價夾竹桃對土壤動物的安全性及開發(fā)以夾竹桃為原料的殺蟲劑提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試蚯蚓品種為0.32 g左右的健康具有環(huán)帶的赤子愛勝蚯蚓，購于安徽省合肥市裕豐花市漁具市場。

夾竹桃采于合肥市環(huán)城公園，為夾竹桃科植物白花夾竹桃。70%乙醇為現(xiàn)配現(xiàn)用，化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 乙醇提取物的制備

稱取夾竹桃鮮葉、鮮莖皮及干葉和干莖皮各50 g，加入質(zhì)量分數(shù)為70%乙醇 250 mL，在25 ℃下采用索氏提取法提取8 h，得乙醇提取液。

將得到的不同部位提取物進一步用循環(huán)水式多用真空泵濃縮抽濾得到濃度更純的乙醇提取物。再將該溶液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)出酒精得到提取物浸膏，放冰箱保存，需要時配制成供試藥液的濃度。提取到黏稠的膏狀物較難收集，提取率很低，僅2%～10%。試驗時先配制成1.0、2.0、4.0 mg/mL，用于預(yù)測蚯蚓死亡率0～100%的濃度梯度。再配制成0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0 mg/mL用于試驗。每次滴加1 mL 夾竹桃乙醇提取液觀察現(xiàn)象，最終在0.5 h之內(nèi)每瓶加入10 mL。

1.3 自然土壤法試驗

（1）準備。在合肥師范學(xué)院校園內(nèi)（樟樹林）挖取適量適宜蚯蚓生活的自然土壤。

（2）處理。將0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0 mg/mL夾竹桃乙醇提取物與250 g自然土壤混勻，加入蒸餾水使土壤含水量為 35%左右。

將上述含不同濃度夾竹桃乙醇提取物的自然土壤放入 250 mL玻璃標準瓶中，再向玻璃標準瓶中放入 10 條在未經(jīng)農(nóng)藥處理的人工土壤中馴養(yǎng) 1 d的蚯蚓。以蒸餾水培養(yǎng)為空白對照組。

（3）培養(yǎng)。用塑料薄膜封住玻璃標準瓶瓶口，再用解剖針把塑料薄膜扎孔后置于（20±2） ℃、濕度為（80±5）%的恒溫箱中連續(xù)光照培養(yǎng)（光照強度為 800～1 000 lx，光暗交替（12 h∶12 h）。

（4）觀察。試驗第7天和第14天各計數(shù)1次，記錄蚯蚓死亡率、體重變化及中毒癥狀，以蚯蚓前尾部對機械刺激（針刺）無反應(yīng)視為死亡。

1.4 濾紙接觸法試驗

（1）清腸。取若干個燒杯，在底部鋪 1 層濾紙，加入少量蒸餾水，以恰浸沒濾紙為宜。挑選具有環(huán)帶的健壯蚯蚓，放在濾紙上，用塑料薄膜封口，并用鑷子扎孔，將燒杯置于溫度為（20±2） ℃、濕度為80%的人工培養(yǎng)箱內(nèi)，清腸1 d。

（2）處理。在直徑 10 cm 的培養(yǎng)皿底鋪襯濾紙，以恰好遮住器皿底為宜。取0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0 mg/mL的夾竹桃乙醇提取液倒入培養(yǎng)皿中，以恰好濕潤浸沒濾紙為宜。以蒸餾水培養(yǎng)為空白對照組。每處理3次重復(fù)。

（3）放入蚯蚓。將清腸后的蚯蚓沖洗干凈，并用濾紙吸干蚯蚓體表水分，放入培養(yǎng)皿中。每處理放入同等生活條件的蚯蚓10 條。用塑料薄膜封口，并用鑷子扎孔，使蚯蚓能正常呼吸。

（4）培養(yǎng)。將培養(yǎng)皿放入人工氣候箱中培養(yǎng)，箱中為標準試驗條件：溫度為（20±2） ℃，濕度為（80 ± 5）%，光照強度為800～1 000 lx，光暗交替（12 h∶12 h）。

（5）觀察。24、48 h 各計數(shù) 1 次，記錄蚯蚓死亡率、體重變化及中毒癥狀，以蚯蚓前尾部對機械刺激（針刺）無反應(yīng)為死亡，48 h 后結(jié)束試驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 夾竹桃鮮葉乙醇提取物對自然土壤法試驗中蚯蚓生活的影響

由表1可知，隨著夾竹桃鮮葉乙醇提取物濃度的增大，蚯蚓死亡率呈上升趨勢。提取物濃度為0.5 mg/mL時，對蚯蚓幾乎沒有影響；濃度≥1.0 mg/mL有致死作用；濃度在1.0～2.0 mg/mL雖有毒害作用，但死亡率較低，均≤50%。

由表2可知，隨著夾竹桃鮮葉乙醇提取物濃度的增大，蚯蚓的體重呈先增長后下降的趨勢。這表明隨著蚯蚓體內(nèi)毒素的積累，蚯蚓出現(xiàn)消瘦狀態(tài)。CK也表現(xiàn)出相同規(guī)律，表明在正常情況下也會出現(xiàn)體重先增后減，且與試驗組相比體重變化不明顯。

2.2 夾竹桃干葉乙醇提取物對自然土壤法試驗中蚯蚓生活的影響

由表3可知，隨著夾竹桃干葉乙醇提取物濃度的增大，蚯蚓死亡率呈上升趨勢。夾竹桃干葉乙醇提取物濃度為0.5 mg/mL時，對蚯蚓幾乎沒有影響；濃度≥1.0 mg/mL有致死作用；濃度在1.0～3.0 mg/mL時，有毒害作用，但死亡率較低，均≤50%。

由表4可知，隨著夾竹桃干葉乙醇提取物濃度的增大，蚯蚓體重減少明顯，表現(xiàn)出負相關(guān)關(guān)系。在7 d內(nèi)，提取物濃度在0.5～1.0 mg/mL對蚯蚓體重幾乎沒有影響，但濃度在1.5 mg/mL時表現(xiàn)出明顯的中毒癥狀；到第14天時所有濃度夾竹桃乙醇提取物均對蚯蚓體重表現(xiàn)出明顯的抑制性。

2.3 夾竹桃鮮莖皮乙醇提取物對自然土壤法試驗中蚯蚓生活的影響

由表5可知，隨著夾竹桃鮮莖皮乙醇提取物濃度的增大，蚯蚓死亡率呈上升趨勢。提取物濃度為0.5 mg/mL時，隨著時間的推移蚯蚓有死亡的現(xiàn)象，但是很少；濃度≥0.5 mg/mL有致死作用；濃度在0.5～1.5 mg/mL有毒害作用，但死亡率較低，均≤50%。

由表6可知，不同濃度的夾竹桃鮮莖皮乙醇提取物在不同時間的處理下，蚯蚓中毒反應(yīng)存在差異。其規(guī)律是隨著處理濃度的增大，蚯蚓的體重明顯受到抑制。與CK相比，所有濃度夾竹桃鮮莖皮乙醇提取物均對蚯蚓的體重產(chǎn)生抑制，隨著時間的增加，蚯蚓體重明顯下降。

2.4 夾竹桃干莖皮乙醇提取物對自然土壤法試驗中蚯蚓生活的影響

由表7可知，隨著夾竹桃干莖皮乙醇提取物濃度的增大，蚯蚓死亡率呈上升趨勢。濃度為0.5 mg/mL 時，對蚯蚓幾乎沒有影響；濃度≥1.0 mg/mL對蚯蚓有致死作用；濃度在 1.0～3.0 mg/mL 對蚯蚓有毒害作用但死亡率較低，均≤50%。

由表8可知，0～14 d，隨著夾竹桃干莖皮乙醇提取物濃度的增大，蚯蚓的體重呈先增長后下降的趨勢，且隨著處理濃度的增大，表現(xiàn)越明顯。這表明隨著蚯蚓體內(nèi)毒素的積累，蚯蚓出現(xiàn)消瘦狀態(tài)。CK也表現(xiàn)出相同規(guī)律，表明在正常情況下也會出現(xiàn)體重先增后減，且與試驗組相比，體重變化不明顯。

2.5 夾竹桃鮮葉乙醇提取物對濾紙接觸法試驗中蚯蚓生活的影響

由表9可知，隨著夾竹桃鮮葉乙醇提取物濃度的增大，蚯蚓死亡率呈上升趨勢。該方法中蚯蚓死亡率普遍較高，明顯比土壤培養(yǎng)的毒害作用大。濃度≥0.5 mg/mL就有致死作用，而濃度在0.5～1.0 mg/mL死亡率較低，均≤50%。

2.6 夾竹桃干葉乙醇取物對濾紙接觸法試驗中蚯蚓生活的影響

由表10可知，隨著夾竹桃干葉乙醇提取物濃度的增大，蚯蚓死亡率呈上升趨勢。該方法中蚯蚓死亡率普遍較高，明顯比土壤培養(yǎng)的毒害作用大。濃度≥1.0 mg/mL，對蚯蚓致死作用比較明顯；濃度在0.5～1.0 mg/mL死亡率較低，均≤50%。

2.7 夾竹桃鮮莖皮乙醇提取物對濾紙接觸法試驗中蚯蚓生活的影響

由表11可知，隨著夾竹桃鮮莖皮乙醇提取物濃度的增大，蚯蚓死亡率呈上升趨勢。該方法中蚯蚓死亡率普遍較高，明顯比土壤培養(yǎng)的毒害作用大。濃度≥0.5 mg/mL時，對蚯蚓的致死作用較明顯，且死亡率很高。

2.8 夾竹桃干莖皮乙醇提取物對濾紙接觸法試驗中蚯蚓生活的影響

由表12可知，隨著夾竹桃干莖皮乙醇提取物濃

度的增大，蚯蚓死亡率呈上升趨勢。該方法中蚯蚓死亡率普遍較高，明顯比土壤培養(yǎng)的毒害作用大。濃度≥0.5 mg/mL時，對蚯蚓的致死作用較明顯；濃度為0.5～1.0 mg/mL時，死亡率較低，均低于50%。

3 討論

3.1 在自然土壤法中夾竹桃不同部位乙醇提取物對蚯蚓的毒害作用比較

3.1.1 夾竹桃鮮莖皮乙醇提取物對蚯蚓的毒害作用大于鮮葉乙醇提取物。

夾竹桃鮮莖皮乙醇提取物的濃度在0.5～1.5 mg/mL時對蚯蚓的毒害作用較小，在前7 d死亡率均低于50%，后7 d死亡率逐漸上升，且隨著時間的推移和濃度的增加，濃度為4.0 mg/mL時全部死亡。隨著濃度的增大和時間的延長，蚯蚓體內(nèi)毒素的積累逐漸呈現(xiàn)出消瘦病態(tài)。與CK相比可知，在正常情況下蚯蚓會出現(xiàn)自然的體重變化，只是變化不明顯。

夾竹桃鮮葉乙醇提取物濃度為0.5～2.0 mg/mL時，對蚯蚓的毒害作用較小，第7天死亡率均低于50%，在第14天死亡率有所增加，但是均低于100%。隨著夾竹桃鮮葉乙醇提取物濃度的增大和時間的延長，蚯蚓的死亡率呈上升趨勢。在濃度為4.0 mg/mL、第14天時，死亡率為90%。通過觀察體重，得出的結(jié)論與鮮皮的作用效果相差不大，體重也出現(xiàn)了類似的變化，只是變化沒有夾竹桃新鮮莖皮乙醇提取物明顯。

通過觀察蚯蚓的中毒癥狀可知，土壤培養(yǎng)過程中CK的蚯蚓生活狀態(tài)良好。試驗組表現(xiàn)有所不同，蚯蚓對鮮莖皮乙醇提取物的中毒癥狀較鮮葉乙醇提取物的明顯，致死率高，在同等濃度和時間內(nèi)，蚯蚓表現(xiàn)出強烈的反抗行為，急躁亂蹦，最終身體僵硬流出液體且針扎無反應(yīng)死亡。

3.1.2 夾竹桃鮮葉乙醇提取物對蚯蚓的毒害作用大于干葉乙醇提取物。

夾竹桃鮮葉乙醇提取物濃度為0.5～2.0 mg/mL時，對蚯蚓的毒害作用較小，前7 d死亡率均低于50%，在第14天觀察發(fā)現(xiàn)死亡率有所增加，但是均低于100%。在一定范圍內(nèi)，隨著夾竹桃乙醇提取物濃度的增大和時間的延長，蚯蚓的死亡率呈上升趨勢。通過觀察體重可知，蚯蚓的生活狀態(tài)在前7 d呈增長趨勢。隨著濃度的增大和時間的延長，體內(nèi)毒素積累，蚯蚓逐漸呈現(xiàn)出消瘦病態(tài)。與CK對比可知，在正常情況下蚯蚓會出現(xiàn)自然的體重變化，只是變化不明顯。

夾竹桃干葉乙醇提取物濃度為0.5～3.0 mg/mL時，對蚯蚓的毒害作用較小，在前7 d死亡率均低于50%，后7 d死亡率逐漸上升，隨著時間的推延和濃度的增大，最終并沒有全部死亡。在第14天濃度為4.0 mg/mL時，死亡率達到80%。通過觀察體重可知，蚯蚓的生活狀態(tài)在前7 d呈現(xiàn)增長趨勢。通過觀察體重可知，與鮮葉乙醇提取物的作用效果相差不大，體重也出現(xiàn)了類似的變化，只是變化沒有鮮葉乙醇提取物明顯。

通過觀察蚯蚓的中毒癥狀，土壤培養(yǎng)時CK的蚯蚓生活狀態(tài)良好，試驗組表現(xiàn)有所不同，蚯蚓對夾竹桃鮮葉乙醇提取物表現(xiàn)出的中毒癥狀比干葉乙醇提取物明顯，致死率高，在同等濃度和時間內(nèi)，蚯蚓表現(xiàn)出強烈的反抗行為，急躁亂蹦，最終身體僵硬流出液體且針扎無反應(yīng)死亡。

3.1.3 夾竹桃干葉乙醇提取物對蚯蚓的毒害作用大于干莖皮乙醇提取物。

夾竹桃干葉乙醇提取物濃度為0.5～3.0 mg/mL時，對蚯蚓的毒害作用較小，在前7 d死亡率均低于50%，后7 d死亡率逐漸上升，隨著時間的推延和濃度的增大，最終并沒有全部死亡。第14天濃度為4.0 mg/mL時，死亡率達到80%。通過觀察體重，得出蚯蚓的生活狀態(tài)在前7 d呈增長趨勢。隨著濃度的增大和時間的延長，體內(nèi)毒素的積累，蚯蚓逐漸呈現(xiàn)出消瘦病態(tài)。與CK相比，得知在正常情況下蚯蚓會出現(xiàn)自然的體重變化，只是變化不是很明顯。

夾竹桃干莖皮乙醇提取物濃度在0.5～3.0 mg/mL時，對蚯蚓的毒害作用較小，在前7 d死亡率均低于40%，后7 d死亡率逐漸上升，隨著時間的推延和濃度的增大，死亡率變化不大，均≤50%。通過觀察體重，得出的結(jié)論與夾竹桃干葉乙醇提取物的作用相差不大，體重呈現(xiàn)了類似的變化，只是變化沒有干葉乙醇提取物明顯。

通過觀察蚯蚓的中毒癥狀，土壤培養(yǎng)時CK的蚯蚓生活狀態(tài)良好，試驗組表現(xiàn)有所不同，蚯蚓對夾竹桃干葉乙醇提取物表現(xiàn)的中毒癥狀比對干莖皮乙醇提取物的明顯，致死率高，在同等濃度和時間內(nèi)，蚯蚓表現(xiàn)出強烈的反抗行為，急躁亂蹦，最終身體僵硬流出液體用針扎無反應(yīng)死亡。

3.2 在濾紙接觸法中夾竹桃不同部位乙醇提取物對蚯蚓的毒害作用比較

3.2.1 夾竹桃鮮莖皮乙醇提取物對蚯蚓的毒害作用大于鮮葉乙醇提取物。

在濾紙接觸處理方式下，對蚯蚓的毒害作用均較大。夾竹桃鮮莖皮乙醇提取物濃度為0.5 mg/mL以上時表現(xiàn)出劇烈的毒害致死作用。濃度為2.0 mg/mL時24 h死亡率達到90%，48 h死亡率達到100%。夾竹桃鮮葉乙醇提取物濃度為0.5～1.0 mg/mL時，24 h死亡率≤50%；濃度為2.0 mg/mL時，48 h死亡率90%；濃度為3.0 mg/mL時，24 h全部死亡。

3.2.2 夾竹桃鮮葉乙醇提取物對蚯蚓的毒害作用大于干葉乙醇提取物。

鮮葉乙醇提取物濃度為0.5～1.0 mg/mL時，24 h死亡率≤50%；濃度為3.0 mg/mL時，24 h全部死亡。

夾竹桃干葉乙醇提取物濃度為0.5～1.0 mg/mL時，死亡率≤50%；在1.0 mg/mL以上，毒害作用大；濃度為3.0 mg/mL時，24 h致死率達90%，48 h死亡率為100%。

3.2.3 夾竹桃干葉乙醇提取物對蚯蚓的毒害作用大于干莖皮乙醇提取物。

夾竹桃干葉乙醇提取物濃度在0.5～1.0 mg/mL時，蚯蚓死亡率≤ 50%；濃度在1.0 mg/mL以上毒害作用大；濃度為2.0 mg/mL時，24 h死亡率為80%，48 h死亡率為90%；在3.0 mg/mL時，48 h全部死亡。

夾竹桃干莖皮乙醇提取物濃度在0.5～1.0 mg/mL時，死亡率低于50%；濃度為2.0 mg/mL時，24 h死亡率為70%，48 h死亡率為80%；濃度為3.0 mg/mL時，48 h全部死亡。

4 結(jié)論

該研究結(jié)果表明，夾竹桃不同部位乙醇提取物對蚯蚓的毒害作用有差異。其中以夾竹桃鮮莖皮的毒性最強，在制作農(nóng)藥時應(yīng)優(yōu)先選用。當鮮莖皮乙醇提取物濃度≤2.0 mg/mL時，土壤動物蚯蚓的死亡率較低。作為植物源農(nóng)藥首先要求對蚯蚓的致死率≤50%，且以達到殺蟲為目的。參考國家制作農(nóng)藥規(guī)定，應(yīng)選用濃度為1.0～2.0 mg/mL夾竹桃鮮莖皮乙醇提取物作為植物源農(nóng)藥，該濃度下既達到了殺蟲效果，又保證了蚯蚓的正常生活。

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