楊富溶 沈建華

摘 要：本研究制備了低分子肝素（LMWH）軟膏劑并建立了制劑質量控制方法。按照不同處方和制備工藝制得軟膏劑基質，通過軟膏劑綜合評分法對所制得基質進行評價。將LMWH原料藥溶解，合并入基質水相組分，按照所確定的軟膏劑最佳處方和最優(yōu)工藝，制備LMWH軟膏劑。用羊血漿法分別測定原料藥和制劑中LMWH的效價。結果表明，按照處方1制備工藝3所制得的軟膏劑基質綜合評價得分最高。測得的軟膏劑中LMWH含量為147.03U/g，為標示量的91.89%。因此，本研究中LMWH軟膏劑的制備方法可行，制劑質量控制方法簡單快速，適合少量制備LMWH外用劑型。

關鍵詞：低分子肝素；軟膏劑；效價；羊血漿法

低分子肝素（LMWH）是肝素經降解得到的低分子量的肝素片段或經分級法得到的低分子量肝素組分，仍為多糖類物質，具有類似肝素的抗凝活性。研究表明，LMWH除了具有抗凝活性之外，還有諸如抗炎、抗過敏等其他藥理活性，可應用于相關疾病的治療[1]。軟膏劑為外用劑型之一，涂敷后于病變部位釋藥治療疾病，避免了口服給藥的胃腸道破壞與肝首過效應，可減少血藥濃度波動，是克服藥物副作用的有效用藥途徑之一[2]。本研究擬制備LMWH軟膏劑，并探究制劑中LMWH效價的測定方法以進行制劑質量控制。

1 實驗部分

1.1實驗試劑與儀器

LMWH原料藥系實驗室自制，LMWH標準品（效價60U/mg）從惠興生化試劑有限公司購買，綿羊血漿（標準條件下血漿半凝固度劑量Vl/2為180μL）從東營愛博科技助劑廠購買，其他試劑為分析純。

JM-L型膠體磨（蘇州明冠膠體磨廠）。

1.2 實驗方法

1.2.1軟膏劑基質處方

軟膏劑基質有油脂性、水溶性與乳劑型。基于此前的研究，本研究選用乳劑型基質[3]。

處方l：以100g為例，單硬脂酸甘油酯7g，白凡士林10g，硬脂酸10g，液狀石蠟10g，甘油14g，水48g，十二烷基硫酸鈉1g，羥苯乙酯0.1g。

處方2：以100g為例，單硬脂酸甘油酯6g，白凡士林11g，硬脂酸10g，液狀石蠟10g，甘油14g，水48g ，十二烷基硫酸鈉1g，羥苯乙酯0.1g。

處方3：以100g為例，單硬脂酸甘油酯5g，白凡士林10g，硬脂酸10g，液狀石蠟10g，甘油16g，水48g，十二烷基硫酸鈉1g，羥苯乙酯0.1g。

1.2.2軟膏劑基質制備工藝

本研究所使用的軟膏劑基質為O/W乳劑型基質。乳劑型基質中有3種組分，即水相、油相與乳化劑。制備時，可以兩相同時摻和，也可以將油相加入水相或將水相加入油相。乳化劑可以先加入水相或先加入油相，也可以水油兩相摻和后再后加。

工藝1：油水分相法。

按1.2.1項下所列各處方，將單硬脂酸甘油酯、硬脂酸、白凡士林、液狀石蠟置于燒杯中，水浴加熱至熔化作為油相，保溫于85℃。取甘油加入蒸餾水中，加入十二烷基硫酸鈉以及羥苯乙酯加熱溶解作為水相，并保溫于85℃。在攪拌下將水相緩慢加入油相中，攪拌至冷凝即得[4]。

工藝2：后加乳化劑法。

按1.2.1項下所列各處方，將除十二烷基硫酸鈉以外的所有組分置于燒杯中，水浴加熱至熔化，保溫于85℃。另將乳化劑十二烷基硫酸鈉用少量蒸餾水溶解，并保溫于85℃，在攪拌下將該乳化劑水溶液加入上述基質混合物中，攪拌至冷凝即得[4]。

工藝3：高剪切勻乳法。

按1.2.1項下所列各處方，將油相組分、水相組分分別置于燒杯中，水浴加熱，并保溫于85℃。將水相加入膠體磨中，再加入油相，持續(xù)攪拌5 min即得[4]。

1.2.3軟膏劑基質處方及制備工藝評價

（l）離心后考察。分別離心各組軟膏劑基質，轉速為4000 r/min，10 min后考察其是否出現粗粒。

（2）放置后考察。室溫下各組軟膏劑基質放置7d，考察其外觀性狀。以外觀性狀及穩(wěn)定性作為考察指標，采用綜合評分法對不同處方及制備工藝制得的基質進行評價[5]。

1.2.4 LMWH原料藥效價測定

（l）標準品溶液制備。稱取LMWH標準品（60U/mg）適量，用生理鹽水準確稀釋至8U/mL，最為標準品溶液。

（2）原料藥供試液制備。按原料藥估計效價（33U/mg），精確稱取約0.69LMWH原料藥置100 mL容量瓶中，用生理鹽水定容至刻度，充分混勻，作為儲備液。另精確吸取1.0mL至25mL容量瓶中，加生理鹽水至刻度，混勻，作為原料藥供試液[6]。

（3）效價測定。取冰凍血漿1瓶，融化，過濾。取14支試管，分為兩組，每組7支。一組加入1.2.4項下標準品溶液，另一組加入1.2.4項下原料藥供試品溶液，以180μL為中點，5μL為級差，依次加入對應體積的溶液，即165、170、175、180、185、190、195μL。向各管加入血漿1mL，再加入0.25%的氯化鈣溶液0.8mL。蓋好管塞，每管以同樣的方法倒轉3次，混勻內容物，并使整個管內壁潤濕。將所有試管垂直放置于37℃水浴中，并開始計時。1h后取出所有管，觀察并記錄血漿凝固程度，以血漿半凝固對應的待測液體積為準[6]。

分別測定準品與原料藥的血漿半凝固度劑量SVl/2與TVI/2。原料藥的效價按照如下公式計算：

原料藥的效價= SVl/2/ TVI/2X8X25×lOO/mr

公式中：mr為所取原料藥的毫克數，效價的單位為U/mg。

1.2.5 LMWH軟膏劑的制備

根據1.2.4項所測得的原料藥效價值，按照軟膏劑中LMWH的標示含量160U/g的要求，準確稱取LMWH原料藥，用適量水溶解LMWH原料藥（該部分水量從基質處方中扣除），將該藥液合并入基質的水相中。按照1.2.3項軟膏劑基質處方及制備工藝考察的結果，采用最佳處方與最優(yōu)工藝制備LMWH軟膏劑。

1.2.6軟膏劑中LMWH含量的測定

制劑中LMWH的效價測定是質量控制的關鍵。以軟膏劑中LMWH的標示含量為準，精密稱取LMWH軟膏劑約5g，置100 mL容量瓶中，加無水乙醇30mL，水浴加熱溶解后，加O.9%NaCI溶液定容，混勻，0～4℃放置過夜分層，棄上層油脂，取下層過濾，全部濾液轉移至置蒸發(fā)皿內，水浴加熱除乙醇至無乙醇嗅味，殘余溶液轉移至100mL容量瓶中，O.9%NaCI溶液定容，即得軟膏劑供試液[7]。測定軟膏劑供試液的血漿半凝固度劑量PVl/2，方法同1.2.4項。軟膏劑中LMWH的含量按照如下公式計算：

軟膏劑中LMWH的含量=SVI/2/PVl/2X8X100/mp

公式中：mp為所取軟膏劑的克數，含量的單位為u/g。

2結果與討論

2.1軟膏劑基質處方與制備工藝評價結果

離心后發(fā)現，處方3的不同制備工藝所制得的基質都出現粗粒；按照處方l與處方2制得的基質離心后未出現粗粒，結果如表1所示。

所有基質放置7d后，采用綜合評價法進行評價，結果見表1。處方中單硬脂酸甘油酯含量最高而白凡士林、甘油含量較低，即采用處方l時，所得軟膏外觀性狀最好，性質穩(wěn)定，綜合評價得分高于處方2與處方3，因此處方1為最佳處方。采用處方l時，油水分相法制備的軟膏劑基質在外觀性狀與穩(wěn)定性方面綜合評分最低，后加乳化劑法稍高，而高剪切勻乳法制備的軟膏劑基質外觀性狀與穩(wěn)定性方面評分最高，因此確定處方1為最佳處方，工藝3為最優(yōu)工藝。

對軟膏劑基質處方和制備工藝考察結果表明，處方中各組分的不同配比影響膏體的稠度，當單硬脂酸甘油酯含量高，而甘油、白凡士林含量適中時，所得基質稠度適中，不過度稠厚也不顯稀薄。而當單硬脂酸甘油酯含量降低，甘油含量升高時，基質稠度降低，稍??；白凡士林含量升高時，基質稠厚，涂展性差。在基質制備工藝中，攪拌速度越快，剪切力越大，所制得的乳化體系越穩(wěn)定。因而，高剪切勻乳法所制得的基質穩(wěn)定性最好，離心及久置不出現粗粒，也沒有油水分層現象。乳化劑的加入順序也會影響軟膏的性狀以及穩(wěn)定性。后加乳化劑法因油相與水相組分在乳化劑加入之前，已經攪拌混合成分散體系，加乳化劑后因乳化作用進一步分散，故其穩(wěn)定性稍好于油水分相法。

2.2 LMWH原料藥效價

經測定，LMWH標準品的SVl/2為170μL，原料藥的TVI/2為190μL。計算得LMWH原料藥的效價為29.82U/mg。

2.3 LMWH軟膏劑的制備

按照所測得的LMWH原料藥的效價并結合軟膏劑中LMWH的標示含量，精密稱取0.5366g原料藥，按照1.2.1項下處方l，用48mL水溶解，，加入甘油、十二烷基硫酸鈉及羥苯乙酯加熱溶解作為水相，保溫于85℃。另照1.2.1項下處方1將油相組分單硬脂酸甘油酯、硬脂酸、白凡士林、液狀石蠟水浴加熱至熔化，保溫于85℃。按照1.2.2項下工藝3將水相加入膠體磨中高速攪拌，將油相加入上述水相中，攪拌5min即得LMWH軟膏劑。

LMWH作為生物活性物質，其在制劑中的化學含量（原料藥質量/制劑質量）并不高。本研究中所制得的LMWH軟膏劑，其化學含量僅為0.5366g/lOOg軟膏劑。正是因為其在制劑中的化學含量小，不到1%，其對于軟膏劑基質的影響可以忽略。將本研究中所制得的LMWH軟膏劑進行離心實驗，未出現粗粒，所得制劑與軟膏劑基質的綜合評分的結果一樣。

2.4軟膏劑中LMWH含量

經測定，LMWH標準品的SVI/2為170μL，軟膏劑供試品的PVI/2為185μL。計算得軟膏劑中LMWH含量為147.03U/g，為標示含量的91.89%。

LMWH為酸性多糖，結構中含有硫酸基團，可溶于水，作為具有一定分子量的生物分子，其發(fā)揮作用時要求保持特定的空間結構，所以僅有LMWH的化學實體并不能保證其具有藥理活性，因而，該藥物的含量必須用效價（活性單位數∕制劑質量）進行標示。LMWH以用天青A法進行測定。該方法測得的為化學含量，其數值與LMWH的生物活性之間沒有良好的線性關系。如要使用該法，則每次測定需建立其與生物檢定法間符合線性關系的濃度范圍，步驟繁瑣，且結果會因每批LMWH的來源、生物活性差異而出現波動。因此，中國藥典以及美國藥典都要求采用生物檢定法進行檢定。中國藥典規(guī)定用兔血漿法，而美國藥典采用羊血漿法，本研究采用羊血漿法進行測定。

用羊血漿法進行測定時，關鍵數據為實驗條件下實際的血漿半凝固度劑量。本研究中所購的羊血漿半凝固度劑量標示為180μL（標準條件下），因此即以待測液體積180μL作為中位值，5μL為級差，分別測得SVI/2、TVI/2、 PVl/2，簡單快速，縮短了效價測定的時間。

本研究中，LMWH軟膏劑的標示含量為160U/g，而實際測得的含量為147.03U/g，為標示含量的91.89%。原因可能是在制備軟膏劑供試品溶液的過程中造成了LMWH生物活性的部分損失。但測得值在標示量的±10%以內，仍然符合制劑中含量檢測的要求，可以作為制劑中藥物含量的檢測方法。當然，制劑中含量測定還需要進一步進行精密度、回收率實驗，確保含量檢測方法的系統(tǒng)適應性。

3結語

總之，本研究所制備的LMWH軟膏劑符合制劑的要求，并且建立了簡單快速測定原料藥LMWH效價與制劑中LMWH含量的方法，進而能夠對LMWH軟膏劑進行質量控制，可供少量制備LMWH外用劑型參考。

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