趙玉巧 徐娜 杜云建

摘要[目的] 優(yōu)化產(chǎn)殼聚糖酶菌株的培養(yǎng)條件。[方法] 對(duì)一株從海洋中篩選的假單胞菌XK-3菌株產(chǎn)殼聚糖酶條件進(jìn)行優(yōu)化。[結(jié)果]培養(yǎng)基最佳組成：葡萄糖30.0 g/L，牛肉膏為15.0 g/L，（NH4）2SO4 15.0 g/L，K2HPO4 2.0 g/L，KH2PO4 2.0 g/L，NaCl 5.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L。搖瓶培養(yǎng)最佳條件：培養(yǎng)初始pH 6.0，培養(yǎng)溫度28 ℃，裝液量20%。Mg2+、Ca2+ 、Mn2+對(duì)殼聚糖酶活力有一定的促進(jìn)作用，F(xiàn)e3+、Cu2+和Zn2+對(duì)殼聚糖酶活力有一定的抑制作用。搖瓶培養(yǎng)條件優(yōu)化后得到的殼聚糖酶活力為3 430 U/L，優(yōu)化前殼聚糖酶活力為1 072 U/L，優(yōu)化后是優(yōu)化前的3.2倍。搖瓶培養(yǎng)得到菌體的最適生長(zhǎng)時(shí)間為24 h，發(fā)酵于64 h后結(jié)束。[結(jié)論] 優(yōu)化后的培養(yǎng)條件提高了殼聚糖酶產(chǎn)量，使該菌株的工業(yè)應(yīng)用成為可能。

關(guān)鍵詞殼聚糖酶；假單胞菌；培養(yǎng)基；優(yōu)化

中圖分類(lèi)號(hào)S18文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼

A文章編號(hào)0517-6611（2017）08-0007-03

Optimization of Culture Conditions of the Strain that Produced Chitosanase

ZHAO Yuqiao， XU Na， DU Yunjian

（Jiangsu Key Laboratory of Marine Biotechnology， Huaihai Institute of Technology， Lianyungang，Jiangsu 222005）

Abstract[Objective] To optimize culture conditions of the strain that produced chitosanase. [Method]The culture conditions of Rhodotorula sp.strain were optimized for the production of trehalose. [Result]The optimum medium consisted of 30.0 g/L sucrose， 15.0 g/L beef extract， 15.0 g/L（NH4）2SO4，2.0 g/L K2HPO4，2.0 g/L KH2PO4 ，5.0 g/L NaCl ，0.5 g/L MgSO4·7H2O . The optimum culture conditions were determined as follows： initial pH 6， temperature 28 ℃，fluid volume 20%.Mg2+， Ca2+ and Mn2+ had a certain promoting effect on the activity of enzyme， Fe3+， Cu2+ and Zn2+ had a certain inhibitory effect on the activity of the enzyme. The yield of the chitosan enzyme was 3 430 U/L through optimized shaking flask culture conditions， the yield of chitosan enzyme was 1 072 U/L before optimization， the optimized result was 3.2 times of that of the former.The optimum growth time was 24 h， and the fermentation time was 64 h. [Conclusion] The culture conditions that were optimized improve the chitosan enzyme production， and make the industrial application of the strains possible.

Key wordsChitosanase；Pseudomonas sp.；Medium；Optimization

殼聚糖是由D-氨基葡萄糖通過(guò)β-1，4-氨基糖苷鍵連接而成[1]，其基本不溶于水，影響了其應(yīng)用范圍。殼聚糖酶可使殼聚糖水解為不同分子量的水解物，這些水解物大多數(shù)水溶性好，從而使其廣泛應(yīng)用。Harish Prashanth等[2]研究發(fā)現(xiàn)，殼寡糖能抑制腫瘤血管生成并促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡。

殼聚糖酶主要來(lái)自于細(xì)菌、放線菌、真菌等生物群中[3]，由于一般的殼聚糖酶產(chǎn)生菌產(chǎn)酶活力都較低，為了得到活力較高的殼聚糖酶，需要對(duì)產(chǎn)殼聚糖酶菌株發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。涂紹勇等[4]對(duì)從土樣中分離到的一株產(chǎn)殼聚糖酶菌株的產(chǎn)酶條件進(jìn)行了優(yōu)化，發(fā)酵液中酶活力可達(dá)2.16 U/mL。孫菲等[5]對(duì)從土樣中分離到的JH01菌株進(jìn)行產(chǎn)酶條件優(yōu)化，發(fā)酵液中殼聚糖酶活力可達(dá)26.03 U/mL。筆者對(duì)一株從海洋中篩選的假單胞菌XK-3菌株進(jìn)行培養(yǎng)條件優(yōu)化，以提高殼聚糖酶的產(chǎn)量，使該菌株的工業(yè)應(yīng)用成為可能。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種。從海水中篩選的假單胞菌。

1.1.2培養(yǎng)基。①斜面培養(yǎng)基：牛肉膏3.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，瓊脂15.0～20.0 g，補(bǔ)煮沸過(guò)濾陳海水至1 000 mL，pH 7.0～7.2。②種子培養(yǎng)基：葡萄糖5.0 g，蛋白胨5.0 g，酵母提取物5.0 g，K2HPO4 2.0 g，KH2PO4 2.0 g，NaCl 5.0 g，Mg SO4·7H2O 0.5 g，補(bǔ)煮沸過(guò)濾陳海水至1 000 mL，pH 7.0。③ 基礎(chǔ)培養(yǎng)基：粉末殼聚糖10.0 g，葡萄糖1.0 g，硫酸銨5.0 g，酵母提取物3.0 g，K2HPO4 2.0 g，KH2PO4 2.0 g，NaCl 5.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，補(bǔ)煮沸過(guò)濾陳海水至1 000 mL，pH 6.5。

種子培養(yǎng)條件：250 mL三角瓶裝75 mL培養(yǎng)基，搖床轉(zhuǎn)速150 r/min，28 ℃培養(yǎng)12 h。搖瓶培養(yǎng)條件：接種量2%，培養(yǎng)時(shí)間72 h，其余條件與種子培養(yǎng)相同。

1.2方法

1.2.1培養(yǎng)基優(yōu)化。①碳源的選擇。碳源為淀粉、糊精、殼聚糖水解物（分子量50 000）、葡萄糖、殼寡糖、膠體殼聚糖、羧甲基纖維素鈉，加入量均為10 g/L，其他成分及條件相同。②氮源的選擇。以葡萄糖作為碳源，氮源為酵母膏、蛋白胨、牛肉膏、硫酸銨、硝酸鉀、尿素、豆餅粉，濃度均為8 g/L，其他成分及條件都相同。③碳氮比的選擇。以葡萄糖為碳源，牛肉膏和硫酸銨為氮源，2種氮源的比例為1∶1，采用的碳氮比例及加入量分別為2∶1（10∶5、20∶10、30∶15）、1∶1（10∶10、20∶20、30∶30）、1∶2（5∶10、10∶20、15∶30）及1∶3（5∶15、7.5∶22.5、10∶30） （括號(hào)中為碳、氮源的加入量之比，單位為 g/L），其他成分及條件相同。④金屬離子對(duì)殼聚糖酶合成的影響。選擇Mn2+、Zn2+、Cu2+、Mg2+、Ca2+、Fe3+共6種離子，其鹽加入量均為0.5 g/L，用2.5%的氯化鈉溶于蒸餾水替代海水。

1.2.2培養(yǎng)條件優(yōu)化。①初始 pH。采用優(yōu)化后的最佳培養(yǎng)基，初始pH分別為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5，其他培養(yǎng)條件：培養(yǎng)溫度28 ℃，裝液量為250 mL三角瓶裝75 mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)時(shí)間72 h。② 培養(yǎng)溫度：培養(yǎng)溫度選擇25、28、30、32、35 ℃，初始pH 6.0，其余條件同 ①。③ 裝液量。在250 mL三角瓶中裝液量分別選擇37.5（15%）、50.0（20%）、62.5（25%）、75.0（30%）、87.5（35%）、100.0 mL（40%），培養(yǎng)溫度28 ℃，其余條件同②。④ 菌體生長(zhǎng)及殼聚糖酶產(chǎn)生過(guò)程。在250 mL三角瓶裝50 mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度28 ℃，pH 6.0，培養(yǎng)時(shí)間84 h，考察細(xì)胞生長(zhǎng)量和殼聚糖酶產(chǎn)量，以此來(lái)考察參數(shù)之間的關(guān)聯(lián)。

1.3測(cè)定項(xiàng)目與方法采用細(xì)胞干重法測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)量；采用DNS顯色法測(cè)定殼聚糖酶活力[6]。

2結(jié)果與分析

2.1碳源對(duì)殼聚糖酶活力的影響

由圖1可知，菌株利用分子量大的多糖產(chǎn)酶能力低。以葡萄糖為碳源有利于該菌株產(chǎn)酶，菌體產(chǎn)酶活力最高，達(dá)1 253 U/L，糊精和殼寡糖次之，故選擇葡萄糖作為碳源。

2.2氮源對(duì)殼聚糖酶活力的影響

由圖2可知，在含有尿素的發(fā)酵液中，該菌株的產(chǎn)酶能力最低，僅679 U/L；采用牛肉膏和硫酸銨作為氮源，菌株的產(chǎn)酶活力分別為2 104和2 029 U/L，故選擇牛肉膏和硫酸銨作為氮源。

2.3碳氮比對(duì)殼聚糖酶活力的影響

由表1可知，當(dāng)培養(yǎng)基中碳氮比為1∶1時(shí)，殼聚糖酶活力最高，且碳氮源的加入量越高其酶活力也越高，當(dāng)碳源與氮源加入量均為30.0 g/ L時(shí)，酶活力達(dá)3 960 U/L，即葡萄糖加入量為30.0 g/ L，牛肉膏和硫酸銨加入量均為15.0 g/ L。

2.4無(wú)機(jī)離子對(duì)殼聚糖酶活力的影響

由圖3可知，不同離子對(duì)殼聚糖酶的影響不同，Mg2+、Ca2+ 、Mn2+對(duì)菌株產(chǎn)酶有明顯促進(jìn)作用，加入Mg2+菌株所產(chǎn)殼聚糖酶活力達(dá)3 744 U/L，Ca2+、Mn2+對(duì)酶活力也有一定的促進(jìn)作用，而Fe3+、Cu2+和Zn2+對(duì)殼聚糖酶活力有一定的抑制作用。

2.5初始pH對(duì)殼聚糖酶活力的影響

由圖4可知，當(dāng)pH小于6.0時(shí)培養(yǎng)基初始pH對(duì)酶活力的影響較大；pH在5.0～6.0時(shí)酶活力呈上升趨勢(shì)；當(dāng)pH 6.0～7.5時(shí)，酶活力呈下降趨勢(shì)；pH為6.0時(shí)酶活力最高，為3 848 U/L。故選擇培養(yǎng)基最佳初始pH為6.0。

2.6裝液量對(duì)殼聚糖酶活力的影響

由圖5可知，裝液量對(duì)假單胞菌XK-3菌株產(chǎn)殼聚糖酶有一定的影響，20%的裝液量（250 mL三角瓶裝液量為50 mL）酶活力最高，達(dá)3 076 U/L。隨著裝液量的增加，殼聚糖酶活力逐漸下降。因此，確定最佳裝液量為20%（250 mL三角瓶裝液量為50 mL）。

2.7培養(yǎng)溫度對(duì)殼聚糖酶活力的影響

由圖6可知，假單胞菌XK-3菌株在25～28 ℃培養(yǎng)時(shí)，酶活力增長(zhǎng)較快，培養(yǎng)溫度為28 ℃時(shí)，發(fā)酵液中酶活力最高，達(dá)3 704 U/L。溫度高于28 ℃時(shí)，發(fā)酵液中酶活力下降較快，30～35 ℃時(shí)，酶活力下降緩慢。菌株XK-3產(chǎn)酶溫度較低與菌株來(lái)自于海洋有一定關(guān)系。

2.8菌株XK-3的生長(zhǎng)及產(chǎn)酶情況

由圖7可知，0～32 h菌體生長(zhǎng)速度較快，32 h后生長(zhǎng)趨于平緩。酶活力呈逐漸增長(zhǎng)的

倍。該菌株產(chǎn)酶量逐漸增加可能與所產(chǎn)酶為胞外酶有關(guān)，雖然菌體生長(zhǎng)量在34 h后已不再增加，但胞內(nèi)的酶逐漸透出細(xì)胞及細(xì)胞的自溶仍逐漸增加。結(jié)合菌株XK-3的生長(zhǎng)及產(chǎn)酶曲線，確定培養(yǎng)結(jié)束時(shí)間為64 h。

3結(jié)論與討論

該研究結(jié)果表明，菌株XK-3搖瓶培養(yǎng)最佳培養(yǎng)基：葡萄糖30.0 g/L，牛肉膏15.0 g/L，（NH4）2SO4 15.0 g/L，K2HPO4 2.0 g/L，KH2PO4 2.0 g/L，NaCl 5.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L。當(dāng)培養(yǎng)基中碳氮比為1∶1時(shí)，殼聚糖酶活力最高，且碳氮源的加入量越高其酶活力也越高，但碳氮源含量過(guò)高會(huì)使原料利用率降低，并對(duì)環(huán)境造成污染， 故生產(chǎn)中可采取中間補(bǔ)料的方法。Ca2+ 、Mg2+ 和Mn2+對(duì)酶活力有一定的促進(jìn)作用，而Cu2+、Fe3+和Zn2+對(duì)殼聚糖酶活力有一定的抑制作用，其他離子對(duì)酶活力無(wú)明顯作用，而海水中Fe3+、Cu2+和Zn2+含量很低，說(shuō)明用海水配制培養(yǎng)基對(duì)該菌株的產(chǎn)酶量無(wú)影響。

該菌株殼聚糖酶的產(chǎn)生均對(duì)初始pH、溶氧及培養(yǎng)溫度敏感，特別是培養(yǎng)溫度，低于或高于28 ℃酶活力均明顯下降，這就要求生產(chǎn)過(guò)程中對(duì)溫度的控制要盡量準(zhǔn)確。

45卷8期趙玉巧等一株產(chǎn)殼聚糖酶菌株的培養(yǎng)條件優(yōu)化

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