曾宇　夏秀忠　農(nóng)保選　張宗瓊　楊行?！∴噰弧㈤_強　黃志　李丹婷

摘要：[目的]鑒定廣西地方香稻品種的香味及其香味基因型，為開發(fā)和利用廣西香稻地方種質資源及選育優(yōu)質特色香稻品種提供理論依據(jù)。[方法]將傳統(tǒng)香味鑒定方法（KOH浸泡法和籽粒咀嚼法）與分子標記技術結合，對179份廣西地方香稻種質資源的香味及其香味基因型進行鑒定。[結果]179份供試材料中，KOH浸泡法檢測到具有香味的材料167份，籽粒咀嚼法檢測到具有香味的材料124份。籽粒咀嚼法鑒定為香稻的品種中97.58%能用KOH浸泡法鑒定出香味，但KOH浸泡法鑒定為香稻的品種中僅72.46%能用籽粒咀嚼法鑒定出香味。利用分子標記法能檢測到等位基因的有7l份，占供試材料總數(shù)的39.66%，主要以InDe17和InDel4-5等位基因為主，其中僅1份檢測到InDel2等位基因，40份檢測到InDel7等位基因，37份檢測到InDel4-5等位基因，未檢測到InDel13等位基因，但有7份同時檢測到In-Del7等位基因和InDel4-5等位基因。7l份能檢測到等位基因的材料中有69份被籽粒咀嚼法和/或KOH浸泡法鑒定為香稻品種，正確率達97.18%。在籽粒咀嚼法和KOH浸泡法均鑒定為香稻的121個品種中，香味表型明確，但僅有55個品種能檢測到等位基因，檢出率為45.45%。來自百色市的供試材料中能檢測到等位基因的品種占該市香稻品種總數(shù)的53.19%，含有InDel2、InDe17和InDel4-5等位基因型，但以Inde17等位基因型為主；來自河池市的供試材料中能檢測到等位基因品種占該市香稻品種總數(shù)的比例最高，達64.10%，但只檢測到2種基因型，以Indel4-5等位基因型為主；柳州市及其他市能檢測到等位基因的比例遠低于百色市和河池市。[結論]廣西香稻地方品種具有較強的地域特色，不同地區(qū)的香稻香味等位基因存在明顯差異，且可能存在已報道的等位基因之外的香味基因或香味等位基因，僅用4個已報道的等位基因不足以檢測出全部的香稻品種，應將分子標記法與傳統(tǒng)鑒定方法相結合，才可更準確鑒定出香稻品種。

關鍵詞：香稻；香味；Badh2基因；等位基因；分子標記

0引言

[研究意義]香稻是一種具有獨特香味的功能稻和特種稻，其食味佳且藥效顯著，在我國古代就享有“貢米”之稱，國際市場價格是非香稻和優(yōu)質稻的2-3倍（胡培松等，2006）。近年來，隨著人們生活水平的提高，香稻市場需求量日益增大，迫切需要選育出更多優(yōu)質香稻新品種，但鑒定其香味性狀，明確香味產(chǎn)生的原因是發(fā)掘香味基因資源的首要工作，對選育優(yōu)質特色香稻品種具有重要意義。[前人研究進展]自Ahn等（1992）采用分子標記技術將香稻的香味基因定位于第8染色體上以來，隨著基因組學的發(fā)展，成功克隆香稻第8染色體上的香味基因（Bradbury et al.，2005），并發(fā)現(xiàn)香稻的香味主要受第8染色體上的甜菜堿醛脫氫酶（BADH2）基因Badh2控制（Chenet al.，2008），且其整個基因序列的引物也已設計完成（Shi et al.，2008），為深入研究香味基因打下基礎。近年來，關于水稻香味基因的研究較多。Bradbury等（2005）研究發(fā)現(xiàn)，香稻香味的產(chǎn)生是由于第8染色體上的Badh2基因序列編碼區(qū)第7外顯子8 bp的缺失和3 bp突變造成編碼蛋白的提前終止，產(chǎn)生無功能的截短BADH2蛋白，香味物質2-乙酰-1-吡咯啉（2-AP）不斷積累，致使香稻的葉片和籽粒產(chǎn)生香味。Shi等（2008）研究發(fā)現(xiàn)，與非香稻品種相比，香稻的香味基因Badh2具有新等位基因，即第7個外顯子正常而第2個外顯子存在7 bp的缺失。王軍等（2008）將Badh2基因第2個外顯子的7 bp缺失和第7個外顯子的8 bp缺失設計成lnDel功能性分子標記，分別命名為InDel-E2和InDel-E7，是最先應用于香稻基因缺失類型鑒定的功能性分子標記。Shao等（2011）研究發(fā)現(xiàn)，廣西的香稻品種妙香糯第4、5外顯子803 bp缺失。Myint等（2012）研究表明，緬甸的香稻品種Pathein Nyunt和Yangon Saba Badh2基因第13外顯子中插入3 bp，導致稻米產(chǎn)生香味，是一種新的等位基因型，由此開發(fā)了相應功能性分子標記In-Del-E5和InDel-E13。這些InDel功能性分子標記的開發(fā)，為香稻種質資源的鑒定篩選及多樣化研究提供了便利，使更多香稻的香味基因型得以鑒定（Fitzgerald et al.，2008；劉化龍等，2014；閆影等，2015）。目前，已將香味基因功能性分子標記應用到香稻定向選育，以提高選育效率和準確性。杜雪樹等（2009）利用香味基因功能性分子標記成功選育出香稻恢復系C349和c354。董華林等（2015）利用香味基因功能性分子標記定向選擇親本，選育出可媲美泰國香稻的優(yōu)質香稻Y43。趙志鵬等（2015）利用香味基因功能性分子標記輔助選育優(yōu)質、高產(chǎn)香型粳稻種質純合株系香粳1305。[本研究切入點]廣西獨特的氣候條件和區(qū)位優(yōu)勢，造就了豐富的稻種資源，存在一些以香、糯、大、軟、白為特點的特色香稻地方品種，具代表性的有靖西香糯、上思香糯、都安板升香糯等，在我國享有盛名，是非常寶貴的地方稻種資源，但有關廣西香稻種質資源的香味性狀及香味基因研究鮮見報道。[擬解決的關鍵問題]將分子標記技術與傳統(tǒng)鑒定方法相結合，對廣西不同地方香稻品種的香味性狀進行鑒定，明確其香味基因型及存在的多樣化信息，為挖掘新香味基因資源，發(fā)揮廣西香稻優(yōu)勢，培育優(yōu)質特色水稻品種打下基礎，同時為開展廣西區(qū)稻種資源的原位保護提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1供試材料

供試的179份香稻材料分別來自廣西不同地區(qū)（表1），收集于20世紀70-90年代，保存于廣西農(nóng)業(yè)科學院中期庫，原記錄信息為香稻。其中，糯稻175份，粘稻4份；粳稻176份，秈稻3份；水稻176份，陸稻3份。所有供試材料均種植于廣西農(nóng)業(yè)科學院水稻研究所試驗田，于2013年7月25日播種，8月5日移栽，9月中旬分蘗，11月中旬收獲。

1.2試驗方法

1.2.1傳統(tǒng)方法鑒定香稻香味 采用2種傳統(tǒng)方法進行香味鑒定。（1）KOH浸泡法：在水稻分蘗期，取每份材料的單株葉片2 g，剪碎后放人50 mL離心管中，加入10 mL 1.7%KOH溶液，加蓋密封后于30℃放置10 min，然后逐一打開蓋子，立即聞其氣味，評價有無香味。為避免嗅覺差異引起偏差，每次檢測均設香稻材料和非香稻材料為對照。采用3人分別評定的方法，并對有爭議的材料進行重復鑒定（Sood and Siddiq，1978）。（2）籽粒咀嚼法：稻米成熟后分別收集每份材料的單株谷粒，自然曬干后每株隨機選取一個穗子的16粒谷粒，剝殼逐粒咀嚼糙米，鑒定其香味。若16粒均不香，表明該植株種子無香味，鑒定為非香稻品種；若連續(xù)5粒谷粒均有香味，鑒定為香稻品種。采用3人分別評定的方法，并對有爭議的材料進行重復鑒定（Bemer and Hoff，1986）。

1.2.2分子標記法鑒定香稻香味基因型

1.2.2.1引物設計 目前已報道的Badh2基因有4個等位基因，其中InDel2等位基因為第2外顯子7 bp缺失，InDel7等位基因為第7外顯子8 bp缺失和3 bp突變，lnDel4-5等位基因為第4-5外顯子803 bp缺失，lnDell3等位基因為第13外顯子3 bp插入。4個等位基因引物見表2，由廣州英韋創(chuàng)建生物科技有限公司合成。4個等位基因的非香型對照均為日本晴，其中，lnDel2、InDel7和InDel4-5的香型對照品種分別為武香粳9號、廣陵香糯和花香糯，InDell3無香型對照品種。

1.2.2.2總DNA提取 參照Murray和Thompson（1980）的CTAB法提取每份材料單株葉片的總DNA。

1.2.2.3 PCR擴增及基因型鑒定 PCR擴增參照Shao等（2011）的方法。PCR產(chǎn)物用8%垂直板聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，經(jīng)0.2%硝酸銀快速染色并觀察拍照。根據(jù)PCR產(chǎn)物長度判斷香稻材料的香味基因型，純合香味基因型記為1，雜合香味基因型記為2，非香基因型記為0，并統(tǒng)計各基因型數(shù)量。

2結果與分析

2.1香稻香味的鑒定結果

179份供試材料的品種信息中顯示為香稻，但部分僅是資源收集時的簡單記錄，未經(jīng)過嚴格的香味鑒定。本研究利用籽粒咀嚼法和KOH浸泡法驗證這批材料是否具有香味。籽粒咀嚼法和KOH浸泡法均可快速鑒別香稻的香味，但檢測結果存在差異（表3）。KOH浸泡法檢測到具有香味的材料167份，占供試材料總數(shù)的93.30%；籽粒咀嚼法檢測到具有香味的材料124份，占供試材料總數(shù)的69.27%，兩種方法均能檢測到香味的材料121份，占供試材料總數(shù)的67.60%，兩種方法（籽粒咀嚼法和/或KOH浸泡法）共檢測到有香味的材料共170份。綜上所述，籽粒咀嚼法鑒定為香稻的品種中97.58%能用KOH浸泡法鑒定出香味，但KOH浸泡法鑒定為香稻的品種中僅72.46%能用籽粒咀嚼法鑒定出香味，表明KOH浸泡法能鑒定出較多的香味品種。

2.2香味基因型鑒定結果

利用分子標記法鑒定廣西香稻地方品種香味基因型，結果如表4所示，有71個品種能檢測到香味等位基因，占供試材料總數(shù)的39.66%，其中僅1個品種檢測到InDel2等位基因，40個品種檢測到InDel7等位基因，37個品種檢測到InDel4-5等位基因，但有7個品種同時檢測到InDel7等位基因和InDel4-5等位基因，即純InDel7等位基因型的香稻品種33個、純InDel4-5等位基因型的香稻品種30個；供試的179個香稻地方品種均未檢測到InDell3等位基因。部分供試香稻材料的分子標記檢測結果如圖1所示。糯稻尾為InDel2等位基因型，號石蛇和香糯為InDel7等位基因型，冷水糯、后糯八谷和黑米糯為InDel4-5等位基因型，八月糯為InDel7和InDel4-5等位基因型，但在黑皮糯谷、谷對實、后十亮列、禾糯大坡和靖西香谷中4個等位基因均未檢測到。

綜上所述，供試的179份地方水稻材料中，主要1）.2InDel7等位基因型和InDel4-5等位基因型為主，分別占71份檢測到已知等位基因品種數(shù)的46.48%和42.25%，分別占兩種傳統(tǒng)方法（籽粒咀嚼法和/或KOH浸泡法）鑒定為香稻品種數(shù)（170份）的19.41%和17.65%。如表3所示，KOH浸泡法鑒定為香稻的167個品種中能檢測到等位基因的有67個，占40.12%。籽粒咀嚼法鑒定為香稻的124個品種中能檢測到等位基因的有57個，占45.97%。KOH浸泡法和籽粒咀嚼法均鑒定為香稻的121個品種中能檢測到等位基因的有55份，占45.45%。表明利用分子標記法能檢測到等位基因的71個品種中，有69個被籽粒咀嚼法和/或KOH浸泡法鑒定為香稻品種，正確率達97.18%。但僅用4個已知的等位基因不足以檢測出全部的香稻品種，在籽粒咀嚼法和KOH浸泡法均鑒定為香稻的121個品種中，香味表型很明確，但僅有55個品種能檢測到等位基因，檢出率為45.45%。由此推測，供試的香稻品種中含有其他未知的香味基因或香味等位基因。

2.3香味等位基因地域分布分析

廣西的香稻品種以粳糯稻為主，主要分布于百色、河池和柳州等市的山區(qū)。本研究供試香稻品種中有140個來自于這3個市，占供試材料總數(shù)的78.21%，其余21.79%的供試材料分別來自于崇左、來賓、桂林、防城港、南寧和欽州6個市（表1）。各市的香稻品種香味基因型存在明顯差異（表5）。來自百色市的供試材料中被鑒定為香稻的品種數(shù)量（籽粒咀嚼法和/或KOH浸泡法）占供試材料總數(shù)的比例最低，為87.04%，其中能檢測到等位基因的品種有25個，占該市香稻品種總數(shù)的53.19%，具有本研究能檢測到的全部等位基因型即InDel2、InDel7和InDel4-5，基因型豐富，但以Indel7等位基因型為主，占該市能檢測到等位基因品種數(shù)的60.00%。來自河池市的供試材料中，能檢測到等位基因的品種數(shù)占該市香稻品種總數(shù)比例最高，達64.10%，但僅檢測到2種等位基因，以Indel4-5等位基因為主，占該市能檢測到等位基因品種數(shù)的64.00%。柳州市及其他市全部供試品種均鑒定為香稻品種，但能檢測到等位基因的比例卻遠低于百色市和河池市。

3討論

已有研究表明，KOH浸泡法和籽粒咀嚼法是常用的傳統(tǒng)香味鑒定方法，僅用其一即可鑒定出香稻品種（葉興鋒等，2013）。但本研究發(fā)現(xiàn)，用葉片KOH浸泡法比籽粒咀嚼法能鑒定出更多的香稻品種，在籽粒咀嚼法鑒定為香稻的品種中，97.58%同樣被KOH浸泡法鑒定為香稻品種；在KOH浸泡法鑒定為香稻的品種中，僅72.46%被籽粒咀嚼法鑒定為香稻品種。由于香稻籽粒是最主要的目標，故可用籽粒咀嚼法進一步驗證KOH浸泡法。結合兩種方法進行香味鑒定，可獲得更準確的香稻品種鑒定結果。隨著分子標記技術的發(fā)展，根據(jù)水稻Badh2基因的等位基因設計InDel分子標記用于鑒定香稻品種，具有準確性高、實用性強和操作簡單等特點（徐小龍等，2011；張江麗等，2015），是定向選育香稻品種的有效、快捷途徑（董華林等，2015；趙志鵬等，2015）。本研究還發(fā)現(xiàn)，利用已報道的Badh2基因4個等位基因（InDel2、InDel7、InDel4-5和InDell3）來鑒定香稻品種的準確率高達97.18%，但僅用4個等位基因不足以檢測出所有香稻品種，在籽粒咀嚼法和KOH浸泡法均鑒定為香稻的品種中，僅45.45%的香稻品種能檢測到等位基因，說明在供試香稻材料中含有其他香味基因或香味等位基因，可通過對香味基因Badh2進行測序、基因定位和基因克隆等研究進一步挖掘。

本研究的179份供試香稻材料中有香味材料170份（籽粒咀嚼法和/或KOH浸泡法），19.41%為InDel7等位基因型，17.65%為InDel4—5等位基因型，僅0.59%為InDel2等位基因型，無InDell3等位基因型，其中7個香稻品種同時存在2個香味等位基因（InDel7和InDel4-5等位基因型），表明其Badh2基因既存在第7外顯子8 bp缺失和3 bp突變又存在第4-5外顯子803 bp缺失，屬疊加型的缺失類型。這與Shao等（2011）、Myint等（2012）、姜達等（2015）研究證實，香稻香味僅受Badh2基因單一缺失或突變型控制的結論相矛盾，其原因可能是在種植過程品種發(fā)生自然或人工雜交，聚合了2個香稻品種的等位基因，也有可能是品種在進化過程中，Badh2基因多個位置同時發(fā)生突變。

廣西香稻地方品種具有較強的地域特色，不同地區(qū)的香稻香味等位基因存在明顯差異。本研究供試香稻地方品種中78.21%來自百色、河池和柳州等3個市。這3個市分別位于廣西的西北部和中北部，有較多少數(shù)民族聚居的山區(qū)，當?shù)厝讼彩撑疵?，香糯稻是重要的飲食和宗教材料，因此香糯稻地方品種非常豐富，是香稻寶貴的基因資源。由于山區(qū)的香糯稻品種部分種于山坡或丘陵地，抗旱和耐貧瘠能力強，因此，這些地方品種在優(yōu)異基因挖掘及香稻和糯稻新品種選育中具有重要的應用價值。此外，粳糯在廣西又稱大糯，米粒圓潤，粘性好，做粽子、糍粑等商品性好，如三江大糯、大順糯米等，深受消費者喜愛，但當前一些粳糯稻老品種綜合性狀差、產(chǎn)量低，可利用本研究鑒定篩選出的香型粳糯稻進行遺傳改良，選育出高產(chǎn)、綜合性狀好、適應性廣的粳型香糯。

4結論

廣西香稻地方品種可能存在已報道的香味等位基因之外的香味基因或香味等位基因，且不同地區(qū)的香稻其香味等位基因存在明顯差異，可進一步挖掘廣西特色香味基因型，并應用于育種研究。