韓楊瑩，王 峻，劉虎軍，孫長坡?

（國家糧食和物資儲備局科學研究院，北京 100037）

玉米赤霉烯酮（Zearalenone，ZEN）是世界上分布最廣泛的一種鐮刀霉菌素，在亞洲、歐洲和美洲等地的谷物及農(nóng)副產(chǎn)品中均有發(fā)生[1]。ZEN主要發(fā)生在富含淀粉的谷物類種子上，通過飼料、食品加工原料形式進入食物鏈，在人或動物體內(nèi)造成蓄積[2]。它在機體內(nèi)產(chǎn)生雌激素效應綜合癥狀，引起動物體雌激素過多，具有致癌性，對動物體腎臟、肝臟均能產(chǎn)生毒害作用[3]。ZEN化學名為 6-（10-羥基-6-氧基-反式-1-十一碳烯基）-β-二羥基苯酸內(nèi)酯（結構式見圖1），分子式為C18H22O5，分子量為318.369 0，是一種取代的2,4-二羥基苯甲酸內(nèi)酯，具有雌激素活性，在堿性條件下可以將內(nèi)酯打開，堿性下降可以將鍵恢復[4]。ZEN的純品為白色晶體，不溶于水、四氯化碳和二硫化碳，溶于堿性水溶液和甲醇、乙醇、乙腈、二氯甲烷、乙酸乙酯等有機溶劑[5]。ZEN性質(zhì)比較穩(wěn)定，在110 °C下加熱處理1 h后才會被完全破壞，其酮環(huán)結構在堿性條件下會發(fā)生水解反應[5-6]。

圖1 玉米赤霉烯酮結構式Fig.1 Structure of Zearalenone

近年來，通過物理[7-8]、化學[9-14]、生物[15-17]的方法進行ZEN脫毒處理已經(jīng)成為研究熱點，吸引了科學家們廣泛的興趣。但由于 ZEN價格昂貴，又有很強的毒性，為了降低實驗風險和成本，人們提出合成一種與ZEN結構、性質(zhì)、功能相似且毒性較小的化合物來替代ZEN進行研究。這種化合物由 2,4-二羥基苯甲酸和環(huán)十二醇通過內(nèi)酯化反應合成，命名為 2,4-二羥基苯甲酸環(huán)十二烷酯（CDHB）[18]，分子式為 C19H28O4，分子量320.429 0從其結構（見圖2）可看出有兩個酚羥基，且酚羥基的位置與ZEN的相同，表現(xiàn)出疏水性，可通過化學反應大量制備，制備成本低。但目前相關研究較少，已有報道中提到的方法存在成本高，不易操作，產(chǎn)率較低，純度不高等缺陷，尤其是純化過程受環(huán)境、試劑等非人為因素影響較大，較難控制。

圖2 CDHB結構式Fig.2 Structure of CDHB

2,4-二羥基苯甲酸和環(huán)十二醇的酯化反應需要在酸或堿條件下并加熱才能進行，且易發(fā)生逆反應，因此需要引入一種活化劑來促進反應。多篇研究[19-22]發(fā)現(xiàn)，N,N′-羰基二咪唑（CDI）極易與有羧酸官能團的化合物反應，生成具有一定反應活性的酰胺類中間體和咪唑、CO2副產(chǎn)物，其中CO2還可進一步促進反應。Baidya等[23]研究發(fā)現(xiàn)，1,8-二氮雜雙環(huán)[5.4.0]十一碳-7-烯（DBU）在反應中即可作為催化劑和堿質(zhì)子化，又同時作為親核試劑參與反應，而且堿性強于其他有機堿。Larrivee-Aboussafy等[24]也提出DBU可以有效催化CDI的酰胺化中間產(chǎn)物與有氨基官能團的有機物發(fā)生的親核取代反應。Bi[25]對反應溶劑進行篩選，發(fā)現(xiàn)同一反應中，只有催化劑為 DBU，溶劑為 N,N-二甲基甲酰胺（DMF）時，反應時間最短且產(chǎn)率最高。因此，在CDHB的合成反應中，選擇DMF為反應溶劑，先將CDI與2,4-二羥基苯甲酸反應生成具有活性的中間產(chǎn)物，考慮到環(huán)十二醇有羥基基團，也可作為親核試劑，嘗試引入 DBU作為催化劑促進中間產(chǎn)物和環(huán)十二醇的親核取代反應。反應過程如圖 3所示，此反應條件溫和，極易發(fā)生，且反應不可逆，產(chǎn)物得率也將得到提高。

圖3 CDHB合成反應示意圖Fig.3 Schematic representation of CDHB synthesis

由于CDHB有疏水性且極性小，純化過程一般采用柱層析法，洗脫劑選用乙酸乙酯石油醚或者乙酸乙酯正己烷體系，收集過程用薄層色譜法（TLC）實時監(jiān)控[26-27]。但這種監(jiān)控比較粗放，一些與 CDHB極性特別相近的副產(chǎn)物容易被忽略，因此本文用HPLC法輔助監(jiān)控，有效提高了CDHB的純度，之后又利用制備液相色譜和高速逆流色譜（HSCCC）分別制備CDHB，并比較了3種方法的優(yōu)劣。得到干燥產(chǎn)物后，分別用高效液相色譜（HPLC）、高效液相色譜-四級桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-QTOF）、紫外-可見光譜（UV-vis）、傅里葉變換紅外光譜（FTIR）和核磁共振譜儀（NMR）對產(chǎn)物進行定性定量分析。

目前關于CDHB應用的研究中，多將其用于制備 ZEN的分子印跡材料（MIP）。分子印跡聚合物是模板分子與功能單體通過分子間作用力結合，然后在交聯(lián)劑作用下聚合，利用溶劑將模板分子洗脫后形成具有特定空穴的聚合物[18]。該聚合物可特異性對模板分子進行吸附，對于ZEN的分子印跡聚合物，為避免模板泄漏和節(jié)約成本，通常用CDHB充當ZEN的模板分子。Urraca,J.L.等[27-31]多篇報道提到用CDHB制備分子印跡聚合物，F(xiàn)ang等[26]用 CDHB制備分子印跡光量子材料，并在實驗中用CDHB替代ZEN進行吸附實驗。本文在這些應用的基礎上，在分子印跡過程中引入石墨烯，得到石墨烯表面分子印跡聚合物（RGO-MIP），與MIP相比提高了對ZEN的吸附性能，為之后的應用研究提供了方法和思路。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

N,N′-羰基二咪唑（CDI,≥90%）、1,8-二氮雜雙環(huán)[5.4.0]十一碳-7-烯（DBU,≥99%）、1-烯丙基哌嗪（1-ALPP，96%）：sigma；三羥甲基丙烷三丙烯酸酯（TRIM，試劑級，75%）、2,4-二羥基苯甲酸（＞98%）和環(huán)十二醇（＞98%）：TCI；N-乙烯基咔唑（98%）和偶氮二異丁腈（AIBN，99%）：百靈威。

1.2 儀器制備

Thermo Nanodrop 2000c紫外-可見分光光度計：美國熱電公司；600 M核磁共振譜儀（氘代乙腈為溶劑，TMS為內(nèi)標）：日本電子株式會社；Bruker VERTEX 70傅里葉變換紅外光譜儀（KBr壓片）：德國布魯克公司；Agilent高效液相色譜-四級桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜（1290-6510 Q-TOF，ESI源）、Agilent 1260高效液相色譜儀：安捷倫科技有限公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：鞏義市予華儀器有限責任公司；BUCHI R-215旋轉蒸發(fā)儀：瑞士步琪公司；DZF-6050真空干燥箱：上海精宏實驗設備有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 CDHB的制備

稱取一定量的CDI和2,4-二羥基苯甲酸置于圓底燒瓶中，加入無水DMF將其溶解后，在40 °C水浴鍋中磁力攪拌1 h。之后將環(huán)十二醇和DBU加入到上述溶液中，繼續(xù)攪拌22 h，上述原料物質(zhì)的量比為1∶1∶1∶1。反應完成后加入相同體積的水和二氯甲烷與溶液充分混合，靜置分層后取下層有機相，再依次用鹽酸、水和飽和碳酸氫鈉溶液分別重復多次洗滌有機相，在得到的油相產(chǎn)物中加入無水硫酸鈉干燥過夜。離心后旋蒸除去二氯甲烷等溶劑，得到淡黃色固體狀態(tài)的粗產(chǎn)物。

1.3.2 CDHB的純化

1.3.2.1 硅膠柱層析法 展開劑為石油醚∶乙酸乙酯=16～32∶1（v/v），洗脫劑為石油醚∶乙酸乙酯=16～32∶1（v/v）

1.3.2.2 HSCCC分離純化 選用V（正己烷）∶V（乙酸乙酯）∶V（甲醇）∶V（水）=1∶0.2～0.8∶1∶0.2～0.8為溶劑體系，上相為HSCCC流動相，下相為固定相，流動相速度為2 mL/min，轉速為800 r/min，檢測波長254 nm。以20 mL/min的流速向分離管中注入上相，以2 mL/min的流速注入下相，根據(jù)色譜圖上的目標峰接收目標物。

1.3.2.3 制備液相純化 Agela Technologies反相色譜柱（21.2 mm×250 mm,5 μm），流動相A為水，流動相B為乙腈，梯度洗脫（0～30 min,60%～90%B; 30～40 min,90%～100%B）流速 20 mL/min，檢測波長254 nm。純化后收集含目標物溶液，旋蒸除去溶劑得到白色固體，真空干燥后得到產(chǎn)物。

1.3.3 石墨烯表面分子印跡聚合物的制備

先將20.0 mg RGO超聲分散到20 mL DMF中，混合均勻后再加入CDHB、1-ALPP和10 mL乙腈，將此混合溶液保持15 min后，加入TRIM和 AIBN，混合均勻后向體系中通氮，將密封的反應容器置于紫外光（λ=254 nm）下照射，得到灰黑色硬狀分子印跡聚合物，其中反應物物質(zhì)的量比為CDHB∶1-ALPP∶TRIM=1∶4∶20。將聚合物在研缽中研磨均勻后，以 V(甲醇)∶V(乙酸)=96∶4的混合溶液為洗脫液，多次回流除去CDHB后，再用 V(甲醇)∶V(水)=80∶20多次洗滌，最后在烘箱中 40 ℃干燥過夜，得到RGO-MIP。作為對照，同樣的方法制備不加CDHB的非印跡聚合物（NIP）和不加RGO溶液的MIP作為對照組。

1.3.4 性能測試

準確稱取10 mg RGO-MIP、MIP和NIP，加入100 mL 10 mg/LZEN溶液，超聲0.5 h使吸附劑分散均勻，再磁力攪拌5 h，每間隔1 h取樣，過0.22 μm尼龍膜，用HPLC檢測吸附結果。聚合物對 ZEN的吸附能力用 qe表示。qe根據(jù)以下公式計算：

qe=(C0–Ct)V/m

其中C0和Ct分別代表ZEN的起始濃度和某一時刻吸附平衡的濃度（mg/L），V代表溶液體積（L），m代表吸附劑的質(zhì)量（g）[32]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用OriginPro 8.0軟件處理和分析實驗數(shù)據(jù)。

2 結果與分析

2.1 CDHB的制備研究

2.1.1 柱層析條件優(yōu)化

選擇石油醚/乙酸乙酯作為展開劑，考察不同比例展開劑對目標物純化的影響，并結合 HPLC手段來驗證。結果顯示，當展開劑為石油醚∶乙酸乙酯=16∶1（v/v）時，可有效分離純化CDHB。HPLC檢測CDHB粗產(chǎn)物-甲醇溶液得到的色譜圖與薄層層析結果一致：色譜圖上最后一個峰的峰面積最大，硅膠板中最上面的點顯色后顏色最深，且目標物極性小，所以初步判斷色譜圖中最后一個峰和硅膠板上最上面的點即為 CDHB。再通過HPLC收集最后一個峰，濃縮后用 HPLC-QTOF檢測，負離子模式下m/z=319.196 7，CDHB分子量為320.429 0，進一步確認了硅膠板最前端的點和色譜圖上最后一個峰即為目標物。因此，過柱純化CDHB時收集最先被洗脫出來的條帶。

收集目標產(chǎn)物洗脫液時，為了保證產(chǎn)物的純度，每收集5 mL左右點板監(jiān)測，每收集100 mL用HPLC-FLD監(jiān)測，監(jiān)測過程如圖4所示，每次可得到 360 mL左右含有純目標物的洗脫液，這些洗脫液合并旋蒸溶劑并干燥后得到的產(chǎn)物有1.2 g左右，計算得產(chǎn)率＞70%。

2.1.2 HSCCC條件優(yōu)化

高速逆流色譜的溶劑體系是根據(jù)目標化合物在兩相溶液中的分配系數(shù)（KD）選擇的，合適的KD范圍是0.5～2.0。實驗測定了目標化合物在不同比例的正己烷/乙酸乙酯/甲醇/水體系中的 KD值。結果表明，目標物可以在正己烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶水（1∶0.2∶1∶0.2，v/v/v/v）體系中達到與雜質(zhì)的有效分離。

2.1.3 純化方法的對比研究

比較柱層析法、HSCCC和制備液相法：制備液相法得到的產(chǎn)品純度高（≥98%），但樣品上載量比較小，費溶劑，且CDHB粗產(chǎn)物粘性比較大，容易滯留在柱子上影響目標物的收集；因為目標物極性較小，也可用硅膠柱層析，柱層析法溶劑用量少，操作方便，但分離效果受環(huán)境溫度和濕度影響較大，純化過程中需要控制好溫度和濕度；高速逆流色譜法分離效果穩(wěn)定，得到的產(chǎn)品純度可達到90%左右，與柱層析法均能實現(xiàn)目標物較大產(chǎn)量的制備。總之，3種方式均可用于 CDHB的分離純化過程，在實際生產(chǎn)中，可根據(jù)目標物純度、成本等需求選用合適的制備方式。

2.2 CDHB表征

2.2.1 高效液相色譜

參照文獻[27]中的檢測條件，用HPLC-FLD檢測了純化前后的產(chǎn)物和ZEN，從色譜圖（圖5(a)）中看出產(chǎn)物呈單一狹窄對稱峰，說明該產(chǎn)物純度高，再與同樣條件下ZEN色譜圖（圖5(b)）對照，發(fā)現(xiàn)二者的保留時間幾乎一致，說明 CDHB與ZEN的極性相似，可作為ZEN的替代物被研究。

以甲醇作為有機相，水為水相優(yōu)化流動相比例，分別設置有機相比例為50%、52%、60%、65%，根據(jù)保留時間與分離效果選擇65%的有機相，在有機相中加入15%的乙腈和15 mmol/L的乙酸銨出峰會更好。當選用紫外檢測器時，色譜圖上會出很多雜質(zhì)峰，影響判斷，因此最終選用熒光檢測器。

2.2.2 質(zhì)譜

文獻報道[18]中CDHB的結構含有酚羥基，在電噴霧電離下容易失去一個質(zhì)子而帶有負電荷，因此在負電離模式下對CDHB進行表征。質(zhì)譜圖如圖 6所示，m/z=319.196 7 ([M-H]–1)，CDHB 分子量的理論值為320.429 0，在失去一個質(zhì)子后，分子量減去一個氫離子的質(zhì)量，其質(zhì)量數(shù)與質(zhì)譜圖中的荷質(zhì)比一致，由此可初步判斷合成了CDHB。

2.2.3 紫外可見光譜

由CDHB的紫外可見光譜圖（圖7）可知，其在258 nm波長處的吸收強度較大，在295 nm波長處的吸收強度中等，可判斷至少有3～5個共軛生色團和助色團，由于CDHB結構中有苯環(huán)，是大共軛體系，可產(chǎn)生π→π*躍遷，苯環(huán)上有羥基，含有n電子，與苯環(huán)相連時能使吸收波長向長波方向移動，吸收強度增強，此外苯環(huán)上連有C=O，含有不飽和鍵，也能吸收紫外-可見光產(chǎn)生 π→π*躍遷，并且C=O與苯環(huán)共軛，使吸收強度增加，且向長波方向移動。

圖7 CDHB的紫外-可見光譜圖Fig.7 UV-vis spectra of CDHB

2.2.4 紅外光譜

CDHB分子式為 C19H28O4，不飽和度為 6。由CDHB的紅外光譜圖（圖8）可知，2 945 cm–1處的峰可歸屬為烷基上C-H的伸縮振動吸收峰，1 643 cm–1、1 518 cm–1、1 469 cm–1處的峰可歸屬為苯環(huán)上C==C的骨架振動吸收峰，850 cm–1、775 cm–1處的峰可歸屬為苯環(huán)上 C-H的面外彎曲振動吸收峰，且取代基位置為苯環(huán)上的1,2,4位。1 359 cm–1處的峰可歸屬為苯環(huán)上 O-H的面內(nèi)彎曲振動吸收峰，在1 253 cm–1處的峰可歸屬為C—O—C的不對稱伸縮振動吸收峰，初步確定產(chǎn)物結構中的官能團有苯環(huán)、酚羥基、C—O—C，結合不飽和度估計產(chǎn)物結構還可能存在飽和環(huán)結構和酯基。

圖8 CDHB傅里葉紅外光譜圖Fig.8 FTIR spectra of CDHB

2.2.5 核磁

CDHB核磁共振氫譜的峰值模式：d（doublet，雙峰），dd（double of doublets，雙重雙峰），m（multiplet，多重峰），bs（broad singlet，寬峰）。

根據(jù)CDHB的核磁共振氫譜圖（圖9 (a)）和文獻[26-27,33]解析可知：在6.29（1H,d,J=2.4 Hz）、6.35（1H,dd,J=2.4 Hz; 8.8 Hz）、7.65（1H,d,J=8.8 Hz）處的3個峰分別為苯環(huán)上的3個取代H的化學位移，在 1.32（18H,bs）、1.59（2H,bs）、1.78（2H,bs）、5.18（1H,m）處的4個峰分別為十二元環(huán)上CH2-和CH的化學位移。參考文獻[34]可知，1.92處為氘代乙腈的溶劑峰。與文獻相比，苯環(huán)上 1和3位置上 OH-的活潑氫信號缺失，可能是溶劑、水等因素的影響[35]。

由CDHB的核磁共振碳譜圖（圖9 (b)）和文獻解析可得[26-27,33]：在 20.64、20.96、22.98、23.18、23.23、23.32、23.68、23.92、24.10、28.85、32.14、73.09處的峰為十二元環(huán)上12個C的化學位移，在 102.47、105.22、107.98、131.69、163.60、163.82處的峰為苯環(huán)上6個C的化學位移，在169.74處的峰為與苯環(huán)相連的—C==O—的化學位移。綜上所述，可推測化合物的結構與CDHB結構相同。

圖9 CDHB的核磁共振譜圖Fig.9 NMR spectrum of CDHB

2.3 RGO-MIP吸附性能

ZEN的吸附動力學實驗結果顯示，吸附 5 h后，RGO-MIP、MIP和NIP對ZEN的吸附率分別為72.36%、67.15%和59.90%。圖10為不同吸附時間下，3種聚合物對ZEN吸附性能的比較。

圖10 3種聚合物對ZEN吸附性能的比較Fig.10 Comparison of adsorption of ZEN by three polymers

從結果看，RGO-MIP和 MIP的吸附性能均優(yōu)于 NIP，根據(jù)分子印跡聚合物的形成原理，可推斷加入CDHB后，CDHB與功能單體在氫鍵作用下結合，再在交聯(lián)劑和引發(fā)劑的作用下，借助紫外光形成聚合物，當CDHB在溶液中被洗脫出聚合物時，聚合物表面就形成與ZEN結構相似的空穴位點，使 ZEN能有效與聚合物表面空穴結合；而 RGO-MIP的吸附性能優(yōu)于 MIP，說明引入的石墨烯發(fā)揮了作用，根據(jù)石墨烯自身的網(wǎng)狀結構[36]，當CDHB和石墨烯溶液混合時，CDHB被引入到石墨烯基底上，同時氫鍵作用與功能單體結合，進一步在石墨烯表面形成聚合物，這種結構使聚合物更多地鋪展在載體表面，洗脫模板后，更多的空穴位點也暴露出來，使得同等條件下，RGO-MIP能吸附更多的ZEN分子。而且根據(jù)Bai等[37]的研究，石墨烯本身對ZEN也有一定的吸附作用，因此RGO-MIP對ZEN的吸附效果大大提高。如圖11所示，RGO-MIP的吸附符合偽二級動力學模型。

圖11 RGO-MIP的吸附動力學模型Fig.11 Dynamic adsorption model of RGO-MIP

對于CDHB來說，作為與ZEN結構性質(zhì)相似的化合物，充當ZEN模板分子的作用已被充分驗證，利用其制備的各種分子印跡聚合物，通過不同手段的調(diào)控提高分子印跡聚合物的吸附率和選擇性將會被越來越多的人所研究，再結合固相萃取、電化學檢測等手段，制備固相萃取柱和電化學傳感器可將其應用到谷物及其農(nóng)副產(chǎn)品的毒素檢測和脫毒上。

3 結論

本文將有機合成和多種純化手段聯(lián)用制備出一種與ZEN結構、大小、極性、性能相近的化合物CDHB，對CDHB的制備條件進行了優(yōu)化，通過各種表征手段確定了該物質(zhì)的結構。這種方法過程簡單、安全、穩(wěn)定、可重復，一定程度上提高了產(chǎn)物的產(chǎn)率和純度。

應用方面，以MIP為例，CDHB作為模板分子可避免模板泄漏問題。本文將CDHB引入到石墨烯載體上，制備的石墨烯表面分子印跡聚合物，不僅在特異選擇性上優(yōu)于活性炭、硅鋁酸鹽、蒙脫石、膨潤土等這類吸附劑，而且對比 MIP，吸附性能也得到明顯的提高，是MIP的1.2倍，從側面驗證了CDHB的純度。除此之外，CDHB以其高產(chǎn)、低毒、易制備等優(yōu)勢還可用作ZEN的替代物，降低ZEN的研究成本。該化合物的制備也為其他ZEN類似物的合成提供了研究基礎。