殷濤

【摘要】 目的 探討缺血預(yù)處理（IP）與維生素C（Vit C）對(duì)大鼠肝缺血再灌注損傷的影響。方法 選擇80只健康雄性SD大鼠， 參照盲選法分成假手術(shù)組（S組）、行缺血再灌注組（IR組）、行缺血預(yù)處理組（IP組）、實(shí)施維生素C治療組（Vit C組）， 各20只。制作70%肝缺血再灌注模型， 測(cè)谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）及天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)氨酶（AST）含量；觀察大鼠肝臟組織結(jié)構(gòu)變化；檢測(cè)肝細(xì)胞凋亡指數(shù)（AI）。結(jié)果 IR組、Vit C組于各個(gè)灌注時(shí)間點(diǎn)血清中ALT、AST含量均明顯高于S組， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。在電子高倍顯微鏡下， 可發(fā)現(xiàn)S組細(xì)胞中線粒體按照一定規(guī)律進(jìn)行排列， 可極為清楚的看見細(xì)胞核的雙重核膜結(jié)構(gòu)， 且內(nèi)質(zhì)網(wǎng)未表現(xiàn)出異常擴(kuò)張， 以較為規(guī)則的方式進(jìn)行排布， 在嵴部未發(fā)現(xiàn)明顯腫脹。結(jié)論 IP及Vit C對(duì)肝臟缺血再灌注損傷有顯著的保護(hù)作用， 相比之下Vit C效果更好。

【關(guān)鍵詞】 再灌注損傷；缺血預(yù)處理；維生素C；大鼠

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2016.31.126

肝臟缺血再灌注損傷（HIRI）多出現(xiàn)在肝臟移植手術(shù)、常規(guī)肝臟手術(shù)以及其他創(chuàng)傷性較大手術(shù)而引發(fā)的缺血性休克， 同時(shí)因該癥狀的影響， 多數(shù)行肝臟類手術(shù)患者， 術(shù)后肝臟功能均會(huì)受到不停程度損傷， 嚴(yán)重時(shí)出現(xiàn)肝功能衰竭[1， 2]。本院主要針對(duì)維生素C的抗氧化作用對(duì)HIRI保護(hù)作用的實(shí)際效果進(jìn)行探索， 望能為臨床對(duì)于HIRI的治療與預(yù)防控制方案的完善發(fā)揮作用。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1. 1 材料 選擇健康雄性SD大鼠80只， 由赤峰學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供， 所有大鼠的喂養(yǎng)方式均相同， 體重200～250 g， 平均體重（231.12±10.38）g。實(shí)驗(yàn)中所用維生素C主要由陜西立眾制藥有限公司生產(chǎn)（國(guó)藥準(zhǔn)字H20046703）。脂質(zhì)氧化（MDA）檢測(cè)試劑盒、生化試劑SOD均來(lái)自南京生物工程研究院， 細(xì)胞凋亡試劑盒（POD）則主要從羅氏公司購(gòu)置。本次研究中所有試劑均符合衛(wèi)計(jì)委檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。依照盲選法， 隨機(jī)分成S組、IP組、Vit C組、IR組， 各20只， 每組在1、3、6、12 h時(shí)間段同時(shí)進(jìn)行再灌注。

1. 2 方法 運(yùn)用Pringles法實(shí)施肝臟缺血再灌注模型的建立， 對(duì)大鼠腹腔注射麻醉劑實(shí)施麻醉， 依照慣用方式對(duì)皮膚進(jìn)行消毒處理， 于大鼠劍突下方1 cm左右切開， 將肝臟進(jìn)行游離， 同時(shí)將肝動(dòng)、靜脈加以分離。隨即使用無(wú)創(chuàng)血管夾將主要供血?jiǎng)用}夾住30 min左右， 使得肝臟內(nèi)無(wú)血液供應(yīng)。然后采用再灌注的方式恢復(fù)肝臟內(nèi)血流。假手術(shù)組（即S組）單進(jìn)行麻醉連同肝臟血管分離操作， 不進(jìn)行血管夾住。行維生素C治療組（Vit C組）， 在使用血管夾夾住血管前5 min左右， 從大鼠尾部注射6 ml/kg維生素C。行缺血預(yù)處理組（IP組）則需要將肝臟左右動(dòng)脈以及門靜脈和膽總管同時(shí)夾住保持肝臟缺血約5 min， 之后保持血管暢通， 放血流大約5 min， 按照此種操作方式共同進(jìn)行3次， 后續(xù)操作與Vit C組基本相同。行缺血再灌注組（IR組）則在夾住血管前5 min后， 于背部注射生理鹽水6 ml/kg， 其他操作方式與Vit C組處理相同[3]。

1. 3 觀察指標(biāo) 取各組處理后大鼠使用全自動(dòng)生化分析儀對(duì)血清中ALT、AST含量進(jìn)行檢測(cè)。在電鏡協(xié)助下， 將使用戊二醛固定的肝臟細(xì)胞組織取出， 隨即進(jìn)行脫水、浸透、包埋等處理， 然后進(jìn)行觀察。針對(duì)原位細(xì)胞凋亡情況， 則主要使用TUNEL法加以檢測(cè)， 在電子顯微鏡下， 若細(xì)胞核中部分部位表現(xiàn)為紫黑色， 則為陽(yáng)性細(xì)胞， 觀察組需在200倍視野下依照隨機(jī)原則， 選取5塊區(qū)域進(jìn)行觀察。AI=陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1. 4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ x-±s）表示， 采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率（%）表示， 采用χ2 檢驗(yàn)。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2. 1 肝臟生化酶學(xué)的檢測(cè)情況 Vit C組1、3、6、12 h的ALT、AST分別為（287.14±1.45）、（315.54±1.64）、（315.47± 1.64）、（308.15±1.68）IU/L和（624.25±1.67）、（674.15±1.71）、（684.25±1.67）、（698.15±1.26）IU/L， IR組分別為（675.14± 1.44）、（824.11±1.67）、（814.34±1.64）、（810.57±1.57）IU/L和

（958.54±1.34）、（962.14±1.24）、（976.28±1.24）、（1011.47±

1.57）IU/L， S組分別為（79.54±1.94）、（82.74±1.25）、（86.45± 1.64）、（79.55±1.29）IU/L和（241.64±1.64）、（243.25±1.26）、（286.18±1.57）、（284.15±1.24）IU/L， IR組、Vit C組各灌注時(shí)間點(diǎn)血清中ALT、AST含量均明顯高于S組， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2. 2 電鏡觀察肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化 在電子高倍顯微鏡下， 可發(fā)現(xiàn)S組細(xì)胞中線粒體按照一定規(guī)律進(jìn)行排列， 可極為清楚的看見細(xì)胞核的雙重核膜結(jié)構(gòu)， 且內(nèi)質(zhì)網(wǎng)未表現(xiàn)出異常擴(kuò)張， 以較為規(guī)則的方式進(jìn)行排布， 在嵴部未發(fā)現(xiàn)明顯腫脹。IR組細(xì)胞核膜基本消失， 無(wú)法對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的擴(kuò)張情況進(jìn)行清楚觀察， 且線粒體表現(xiàn)為嚴(yán)重腫脹擴(kuò)張， 可發(fā)現(xiàn)部分空泡存在明顯變性。

2. 3 肝細(xì)胞凋亡情況 S組在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行灌注時(shí)， 僅少數(shù)細(xì)胞出現(xiàn)凋亡， 但其他三組灌注時(shí)， 細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯高于S組（P<0.05）。同時(shí)各組AI伴隨灌注時(shí)間的增加， 其含量也呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)。

3 討論

HIRI的發(fā)生機(jī)制十分復(fù)雜， 結(jié)合臨床有關(guān)研究可發(fā)現(xiàn)， 細(xì)胞凋亡也可歸屬到肝臟缺血且在灌注期間出現(xiàn)細(xì)胞死亡的范圍內(nèi)。在本次研究中， 大鼠肝表現(xiàn)為ALT明顯升高， 同時(shí)肝細(xì)胞內(nèi)的超微結(jié)構(gòu)也都有明顯損傷。

多細(xì)胞生物體多采用細(xì)胞凋亡的方式來(lái)維持自身組織以及細(xì)胞之間增殖與死亡的相互平衡， 因此細(xì)胞凋亡為自身基因掌控的自主細(xì)胞死亡。近幾年， 有關(guān)學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)， 體內(nèi)氧自由基含量超過(guò)正常水平時(shí)， 將增加細(xì)胞凋亡。在本次研究中IR組、IP組、Vit C 組， 細(xì)胞凋亡數(shù)明顯較S組高， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）， 同時(shí)各組AI伴隨灌注時(shí)間的增加， 其含量也呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)。

維生素C是細(xì)胞外液中最有效的水溶性抗氧化劑， 在人體內(nèi)可起到降低脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)強(qiáng)度的作用。本次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)， 使用維生素C可有效抑制缺血在灌注過(guò)程中氧自由基的產(chǎn)生， 將對(duì)肝臟組織的損傷降至最小， 其總體效果優(yōu)于行缺血預(yù)處理。

參考文獻(xiàn)

[1] 王安生， 劉學(xué)剛， 王康武， 等. bFGF、MMP-2在肺血減少型先天性心臟病幼豬動(dòng)物模型遠(yuǎn)端肺血管發(fā)育中的作用. 中華解剖與臨床雜志， 2011， 16（5）：404-408.

[2] 周克斌， 趙留存， 楊勇， 等. 放療對(duì)前尿道狹窄模型兔iNOs和MMP-2的影響. 現(xiàn)代泌尿外科雜志， 2012， 17（1）：32-35.

[3] 徐振宇， 高建平， 孫穎浩， 等. 非甾體類抗炎藥對(duì)前列腺癌動(dòng)物模型中RECK基因表達(dá)的調(diào)控. 江蘇醫(yī)藥， 2010， 36（22）：2666-2668.

[收稿日期：2016-10-25]