李秀楠　吳玉梅　劉愛蕙

[摘要] 目的 探討miR-27b在雌激素受體（ER）陽性的乳腺癌細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及他莫昔芬耐藥中的調(diào)控機制。 方法 通過反轉(zhuǎn)錄實時定量PCR測定miR-27b的表達。用雙熒光素酶報告和蛋白質(zhì)印跡實驗驗證miR-27b對HMGB3的靶向調(diào)控作用。在他莫昔芬敏感（TamS）或耐藥（TamR）的MCF-7細胞中過表達miR-27b或敲減HMGB3后測定細胞活力，分析上皮和間質(zhì)標志物的表達，檢測細胞侵襲力。 結(jié)果 TamR MCF-7細胞中miR-27b的水平約為TamS MCF-7細胞的20%。過表達miR-27b增加了4-羥基他莫昔芬（4-OHT）對TamR MCF-7細胞的活力抑制。TamS與TamR細胞在miR-27b過表達后，穿膜細胞數(shù)目均明顯減少。在TamR MCF-7細胞中，轉(zhuǎn)染miR-27b mimics增加了約3倍的E-cadherin表達，同時也降低了約70%的N-cadherin表達。miR-27b可以結(jié)合預(yù)測的HMGB3 3′非翻譯區(qū)（UTR）結(jié)合位點并降低HMGB3在蛋白水平的表達。HMGB3敲減和miR-27b過表達具有類似的生物學功能。 結(jié)論 miR-27b可以通過抑制HMGB3的表達抑制乳腺癌細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化并增強乳腺癌細胞他莫昔芬敏感性。

[關(guān)鍵詞] 雌激素受體；乳腺癌；miR-27b；他莫昔芬；HMGB3

[中圖分類號] R737.9 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2016）12（c）-0058-05

[Abstract] Objective To investigate regulation mechanism of miR-27b in epithelial-to-mesenchymal transition and Tamoxifen sensitivity of ER positive breast cancer cells. Methods qRT-PCR was performed to detect miR-27b expression. Dual luciferase assay and Western blot assay were performed to detect the regulative effect of miR-27b on HMGB3 expression. Tamoxifen sensitive （TamS） and tamoxifen resistant （TamR） MCF-7 cells were transfected with miR-27b mimics or HMGB3 siRNA. Then cell viability， the expression of epithelial and mesenchymal markers and cell invasion were measured. Results TamR MCF-7 had approximately 20% of miR-27b expression compared to TamS MCF-7 cells. miR-27b overexpression significantly enhanced the suppressive effect of 4-hydroxytamoxifen on cell viability in TamR MCF-7 cells. miR-27b overexpression significantly inhibited cell invasion in both TamS and TamR cells. In TamR MCF-7 cells， transfection of miR-27b mimics resulted in approximately 3 folds increase of E-cadherin and 70% decrease of N-cadherin. miR-27b could bind to the predicted binding site in the 3′UTR of HMGB3 and decrease HMGB3 expression at protein level. Knockdown of HMGB3 phenocopied the effects of miR-27b. Conclusion miR-27b can inhibit epithelial-to-mesenchymal transition and sensitize ER positive breast cancer cells to tamoxifen via targeting HMGB3.

[Key words] ER； Breast cancer； miR-27b； Tamoxifen； HMGB3

他莫昔芬與雌二醇競爭結(jié)合雌激素受體（ER），廣泛應(yīng)用于ER陽性乳腺癌術(shù)后的輔助治療[1-2]。雖然他莫昔芬的臨床運用顯著提高了患者的生存期，但乳腺癌細胞通常會在一段時間治療后出現(xiàn)他莫昔芬耐藥，導致腫瘤復(fù)發(fā)和治療失敗[1，3]。

研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌細胞獲得性他莫昔芬耐藥通常伴隨多種miRNA的異常表達[4-6]。如4-羥基他莫昔芬（4-OHT）處理后，ER陽性的乳腺癌MCF-7細胞中miR-574-3p表達降低，導致了網(wǎng)格蛋白重鏈異常升高，從而參與了他莫昔芬耐藥[7]。乳腺癌細胞中miR-320的降低可以通過增加cAMP調(diào)控的磷酸蛋白（ARPP-19），雌激素相關(guān)受體γ及其下游效應(yīng)分子的表達，包括c-Myc和細胞周期蛋白D1，導致獲得性他莫昔芬耐藥[8]。有研究指出，miR-27b低表達也與乳腺癌細胞獲得性他莫昔芬耐藥密切相關(guān)[9]。但miR-27b在乳腺癌細胞中的下游調(diào)控機制還不是很清楚。本研究擬探討miR-27b/HMGB3調(diào)控軸對ER陽性乳腺癌細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和他莫昔芬敏感性的作用。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)

ER陽性且他莫昔芬敏感（TamS）的乳腺癌細胞MCF-7購自美國ATCC細胞庫。采用低劑量逐步加量法誘導他莫昔芬耐藥的（TamR）MCF-7細胞。腫瘤細胞用RMPI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，添加10% FBS，2 mmol/L谷氨酰胺，100 U青霉素/mL和100 μg鏈霉素/mL。

1.2 細胞轉(zhuǎn)染

miR-27b模擬物（mimics），HMGB3si-RNA（si-HMGB3）和對應(yīng)的陰性對照購自銳博生物。參考轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamie 2000（Invitrogen）說明書進行轉(zhuǎn)染。

1.3 生物信息學預(yù)測

使用Target Scan 7.1預(yù)測miR-27b和HMGB3的結(jié)合位點。

1.4 RNA提取及實時熒光定量

按照TRIzol RNA提取試劑盒說明書提取細胞總RNA。應(yīng)用TaqMan miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Applied Biosystems）將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。用TaqMan miRNA分析試劑盒檢測miR-27b的表達。所有qRT-PCR實驗均使用Applied Biosystems 7500實時定量PCR儀進行。RNA的相對表達量使用2-ΔΔCT法計算。

1.5 細胞活力檢測

取轉(zhuǎn)染miR-27b mimics或HMGB3 siRNA后24 h的TamS或TamR MCF-7細胞，接種于96孔板（3×103個細胞/孔），繼續(xù)培養(yǎng)24 h。之后，將培養(yǎng)基換為5 μmol/L的4-OHT培養(yǎng)基。細胞繼續(xù)培養(yǎng)72 h后進行CCK-8檢測細胞活力。

1.6 Transwell侵襲實驗

將基質(zhì)膠鋪于小室底部，小室下層加入含10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液500 μL，上層加入無血清的RPMI 1640培養(yǎng)液100 μL。轉(zhuǎn)染48 h后，制備細胞懸液，小室上層鋪500 μL的細胞懸液（含1×105個細胞），繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，4%甲醛固定、0.1%結(jié)晶紫染色后在顯微鏡下（100×）隨機挑取10個視野計數(shù)穿膜的細胞計算其均數(shù)和標準差。

1.7 蛋白質(zhì)印跡分析

細胞樣品應(yīng)用蛋白質(zhì)提取試劑盒提取總蛋白，BCA法測定蛋白質(zhì)濃度。蛋白樣品按30 μg/孔在10% SDS-PAGE進行電泳分離，轉(zhuǎn)膜，封閉。后用相應(yīng)一抗于4℃孵育過夜，洗滌。加二抗孵育，洗滌。加入增強型化學發(fā)光試劑，X線曝光、顯影和定影。以目的蛋白質(zhì)條帶的灰度值與內(nèi)參β-actin蛋白條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對表達水平。

1.8 雙熒光素酶報告實驗

將含預(yù)測的野生型miR-27b結(jié)合位點的HMGB3 3′UTR序列片段和含突變型miR-27b結(jié)合位點的HMGB3 3′UTR序列片段分別插入熒光素酶報告質(zhì)粒pmirGLO（Promega）的Xhol和Xbal位點之間。重組質(zhì)粒分別命名為pGLO-HMGB3-WT和pGLO-HMGB3-MT。將miR-27b mimics、mimics對照分別與內(nèi)參對照和熒光素酶報告載體共轉(zhuǎn)染入MCF-7細胞中。轉(zhuǎn)染24 h后，采用Promega公司的Dual-Luciferase Reporter Assay System進行樣品Luciferase活性檢測。

1.9 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析和處理，計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩組間比較采用t檢驗，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-27b對ER陽性乳腺癌他莫昔芬敏感性和侵襲力的調(diào)控

TamR MCF-7細胞中miR-27b的水平約為TamS MCF-7細胞的20%（圖1A）。5 μmol/L的4-OHT處理并不能抑制TamR MCF-7細胞的活力；但在TamR MCF-7細胞中過表達miR-27b后，5 μmol/L的4-OHT處理則導致約15%的細胞活力抑制（圖1B）。TamS MCF-7與TamR MCF-7細胞在miR-27b過表達后，穿膜細胞數(shù)目均明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義（P = 0.028、0.006）（圖1C、圖1D）。

2.2 miR-27過表達對乳腺癌細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響

蛋白質(zhì)印跡分析結(jié)果證明，TamR MCF-7細胞中，miR-27b過表達增加了約3倍的E-cadherin表達，降低了約70%的N-cadherin表達（圖2）。

2.3 miR-27b對HMGB3在乳腺癌細胞中表達的影響

生物信息學結(jié)果顯示，在HMGB3 3′非翻譯區(qū)有一個可能的miR-27b結(jié)合位點（圖3A）。在TamS和TamR MCF-7細胞中，過表達miR-27b可以降低HMGB3蛋白表達（圖3B）。為了進一步驗證miR-27b是否與預(yù)測的HMGB3 3′UTR結(jié)合位點有直接結(jié)合作用，將野生型和突變型的HMGB3 3′UTR片段插入pmirGLO熒光素酶表達載體后進行miR-27b結(jié)合實驗。結(jié)果顯示，miR-27b可以顯著抑制pGLO-HMGB3-WT的熒光素酶在TamS和TamR MCF-7細胞中的表達，但是并不能抑制pGLO-HMGB3-MT的熒光素酶表達（圖3C、圖3D），說明miR-27b可以結(jié)合預(yù)測HMGB3 3′UTR結(jié)合位點。

2.4 HMGB3敲減對乳腺癌細胞的影響

HMGB3 siRNA顯著抑制了HMGB3的表達（圖4A）。TamR MCF-7細胞在抑制HMGB3后，5 μmol/L的4-OHT處理導致了約20%的細胞活力抑制（圖4B）。抑制HMGB3也顯著減少了TamS和TamR MCF-7細胞穿膜細胞數(shù)目（P = 0.009、0.004）（圖4D）。HMGB3 siRNA顯著增加了E-cadherin表達，同時也明顯降低了N-cadherin表達（圖4C）。

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，多個miRNA在TamR乳腺癌細胞中表達顯著下降，包括miR-497，miR-221/222，miR-195和miR-27b[10]。miR-27b可以參與多項乳腺癌病理發(fā)展過程。如miR-27b表達下降與ErbB2依賴的乳腺上皮細胞癌變和侵襲力增強密切相關(guān)[11]。miR-27b表達降低也導致了ENPP1激活，從而參與了乳腺癌腫瘤干細胞的發(fā)生[9]。在多種腫瘤細胞中，miR-27b低表達也與癌細胞的化療敏感性相關(guān)。如miR-27b過表達可以在胃癌細胞中激活p53依賴的細胞程序性死亡，減少CYP1B1調(diào)控的藥物減毒作用，從而增加腫瘤細胞對多種化療藥物的敏感性[12]。在乳腺癌細胞中，miR-27b過表達可以通過減少側(cè)群細胞的形成，從而降低獲得性的藥物耐藥[9]。

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化不僅是腫瘤細胞獲得更強侵襲力的重要機制之一[13]，也是獲得性他莫昔芬耐藥的重要機制之一[14-15]。如果在他莫昔芬耐藥的乳腺癌細胞中恢復(fù)一些下調(diào)的miRNA的表達，如miR-375和miR-200，可以部分逆轉(zhuǎn)乳腺癌細胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，并增加他莫昔芬的敏感性[14-16]。本研究發(fā)現(xiàn)，在他莫昔芬耐藥的MCF-7細胞中恢復(fù)miR-27b的表達，可以顯著增加他莫昔芬對細胞活力的抑制，減弱腫瘤細胞的侵襲力，同時也部分逆轉(zhuǎn)了腫瘤細胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。

人高遷移率族蛋白（HMG-box）在腫瘤細胞的DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、重組和修復(fù)中有重要的生理功能[17-18]。在乳腺癌中，HMGB3是一個原癌基因，并且可以調(diào)控腫瘤細胞的增殖、轉(zhuǎn)移和耐藥性[19-20]。本研究證實，miR-27b可以結(jié)合預(yù)測HMGB3的3′UTR結(jié)合位點，降低HMGB3的表達。HMGB3敲減具有類似miR-27b過表達的生物學功能，可以減弱乳腺癌細胞的他莫昔芬耐藥性，減弱細胞侵襲力，也部分逆轉(zhuǎn)了癌細胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。因此，HMGB3很有可能是miR-27b在乳腺癌細胞中的重要下游靶點。

本研究只用了一種他莫昔芬耐藥的乳腺癌細胞，這是本研究的局限性。后續(xù)研究擬用多種乳腺癌腫瘤細胞系和基于裸鼠的體外腫瘤模型對miR-27b和HMGB3的作用機制及參與的信號調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進行深入研究。

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（收稿日期：2016-09-18 本文編輯：李亞聰）