王玉柱，明英姿

[1.鄭州大學(xué)人民醫(yī)院（河南省人民醫(yī)院）肝膽胰腺外科,河南鄭州450003；2.中南大學(xué)湘雅移植醫(yī)學(xué)研究院，湖南長沙410013]

前列腺素E1后處理對大鼠移植肝缺血再灌注損傷的保護作用*

王玉柱1，明英姿2

[1.鄭州大學(xué)人民醫(yī)院（河南省人民醫(yī)院）肝膽胰腺外科,河南鄭州450003；2.中南大學(xué)湘雅移植醫(yī)學(xué)研究院，湖南長沙410013]

目的探討前列腺素E1（PGE1）后處理對大鼠移植肝缺血再灌注損傷（IRI）的保護作用及其機制。方法建立SD大鼠肝移植模型，隨機分為3組：IRI組、PGE1后處理組（PGE1組）及假手術(shù)組（S組）。檢測各組血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、超氧化物岐化酶（SOD）及丙二醛（MDA）的含量；采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）方法檢測移植肝組織內(nèi)腫瘤壞死因子（TNF-α）信使核糖核酸（mRNA）的表達(dá)水平；蘇木精-伊紅染色（HE）觀察移植肝病理形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果供肝再灌注后2及6 h，PGE1組的大鼠血清ALT、AST和MDA水平及TNF-α mRNA的表達(dá)低于IRI組（P＜0.05），血清SOD水平高于IRI組（P＜0.05），光鏡下PGE1組肝組織損傷較IRI組輕。結(jié)論PGE1后處理可通過提高肝組織的抗氧化能力，降低TNF-α來減輕大鼠移植肝IRI。

肝移植；缺血再灌注損傷；藥物后處理；前列腺素E1

肝臟缺血再灌注損傷（ischemia-reperfusion injury，IRI）是肝移植術(shù)中常見的一種病理生理過程，可導(dǎo)致10%移植肝原發(fā)性無功能，還可增加術(shù)后急、慢性排斥反應(yīng)的發(fā)生率，如何減輕移植肝IRI一直是肝膽外科的研究熱點[1]。隨著缺血后處理[2]概念的提出，其良好的臨床可控性和可靠的保護效應(yīng)引起人們的廣泛關(guān)注。但目前尚未見藥物后處理用于移植肝IRI的研究報道。在本研究中，筆者采用前列腺素E1（Prostaglandin E1，PGE1）后處理作用于缺血再灌注損傷的大鼠肝移植模型，觀察其對腫瘤壞死因子（tumour necrosis factor-α，TNF-α）、氧化指數(shù)超氧化物岐化酶（superoxide dismutase，SOD）及丙二醛（Malondialdehyde，MDA）的影響，闡明其對于移植肝IRI可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

健康雄性SD大鼠60只（購自于河南省實驗動物中心）。體重200～250 g，術(shù)前12 h禁食，自由飲水。PGE1注射液（北京泰德制藥有限公司），SOD、MDA試劑盒（江蘇省南京建成生物工程研究所），TNF-α正向引物：5'-CTTCTCATTCCTGCTCGTGG-3'，反向引物：5'-CCTCTGCTTGGTGGTTTGCT-3'，擴增產(chǎn)物大小為203 bp；β-actin正向引物：5'-GCGC GGCTACAGCTTCA-3'，反向引物：5'-CTTAATGTCA CGCACGAT-3'，擴增產(chǎn)物大小為68 bp。引物均由上海生工生物工程有限公司合成，其他試劑均為進口或國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 動物模型及分組

參照“二袖套法”復(fù)制肝移植模型[3]，移植肝熱缺血時間為0～1 min，冷缺血時間約90 min，受體無肝期為（20±3）min。將60只健康雄性SD大鼠隨機分為3組：假手術(shù)（S）組12只，IRI組和藥物后處理（PGE1）組各24只。S組：進腹后僅分離肝周韌帶，不阻斷肝門血管；IRI組：移植肝植入后立即完全開放門靜脈，不予任何處理；PGE1組：移植肝復(fù)灌時經(jīng)門靜脈建立微輸液泵通道，將PGE1注射液以0.02 μg/（kg·min）速度持續(xù)性泵入60 min。

1.3 檢測項目及方法

各組在結(jié)束無肝期移植肝再灌注后第2及6小時分別處死6只大鼠，自下腔靜脈采血3 ml，采用多功能生化分析儀測定肝功能[血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT），谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate transaminase，AST）]；用可見光分光光度計測其吸光度來計算血清SOD及MDA含量。切取部分新鮮肝組織置入-80℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆?，采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）方法檢測肝組織內(nèi)TNF-α信使核糖核酸（messenger ribonucleic acid，mRNA）的表達(dá)水平。部分肝組織用體積分?jǐn)?shù)為10.0%福爾馬林溶液固定，蘇木精-伊紅染色（hematoxylin-eosin staining，HE）觀察移植肝病理形態(tài)學(xué)變化。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多個樣本均數(shù)間比較用單因素方差分析，多個均數(shù)間的兩兩比較用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肝移植后各時間點血清ALT、AST水平

各組大鼠肝移植后第2及6小時血清ALT、AST水平較S組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），IRI組和PGE1組值相較于S組升高，但PGE1組比IRI組降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（見表1）。

2.2 各組大鼠肝移植后各時間點血清SO D，M D A含量

各組大鼠肝移植后第2及6小時血清SOD，MDA含量的變化差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。相較于S組，IRI組和PGE1組值均升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（見表2）。

2.3 各組大鼠肝移植后移植肝組織中TN F-α m R N A的表達(dá)

移植后2 h時S組移植肝組織中TNF-α mR-NA僅少量表達(dá)（0.02±0.01），IRI組（0.34±0.09）及PGE1組（0.23±0.06）的表達(dá)含量升高（t=2.491，P= 0.032）。再灌注6 h時，PGE1組（0.31±0.05）肝組織TNF-α mRNA的表達(dá)低于IRI組（0.44±0.11）（t= 2.635，P=0.025）（見圖1）。

表1 各組大鼠肝移植后各時間點血清ALT、AST水平的變化（n=6，u/L±s）

表1 各組大鼠肝移植后各時間點血清ALT、AST水平的變化（n=6，u/L±s）

注：與IRI組比較，1）P=0.0001；2）P=0.0004；3）P=0.0001；4）P= 0.0082

A L T A S T組別6 h S組5 6 . 7 ± 7 . 3 6 4 . 4 ± 7 . 5 1 4 4 . 5 ± 2 4 . 1 1 6 4 . 6 ± 2 8 . 8 I R I組1 0 8 3 . 5 ± 1 5 2 . 2 1 5 1 0 . 3 ± 2 0 6 . 2 1 2 6 2 . 2 ± 1 5 3 . 4 1 6 1 7 . 2 ± 2 1 8 . 3 P G E 1組5 1 6 . 6 ± 1 5 3 . 41）1 0 1 4 . 4 ± 1 0 6 . 52）5 8 3 . 2 ± 1 3 4 . 33）1 2 2 4 . 4 ± 1 9 4 . 84）F值1 0 1 . 9 1 8 0 . 2 1 3 5 . 4 1 1 7 . 6P值0 . 0 0 0 0 . 0 0 0 0 . 0 0 0 0 . 0 0 0 2 h 6 h 2 h

表2 各組大鼠肝移植后各時間點血清SO D、M D A含量的變化（n=6±s）

表2 各組大鼠肝移植后各時間點血清SO D、M D A含量的變化（n=6±s）

注：與IRI組比較，1）P=0.0001；2）P=0.0001；3）P=0.0015；4）P= 0.0029

組別S O D /（u / m l）M D A /（n m o l / L）6 h S組2 0 4 . 3 ± 8 . 2 2 1 1 . 6 ± 9 . 1 7 . 5 ± 1 . 2 7 . 6 ± 1 . 5 I R I組1 0 3 . 3 ± 6 . 2 9 6 . 5 ± 6 . 0 2 3 . 1 ± 3 . 9 2 5 . 8 ± 4 . 2 P G E 1組1 4 9 . 4 ± 7 . 21）1 3 2 . 1 ± 7 . 12）1 5 . 2 ± 2 . 23）1 7 . 9 ± 2 . 64）F值2 9 2 . 2 3 6 9 . 4 5 0 . 9 5 6 . 3P值0 . 0 0 0 0 . 0 0 0 0 . 0 0 0 0 . 0 0 0 2 h 6 h 2 h

圖13 組復(fù)灌后各時間點TN F-α m R N A表達(dá)結(jié)果

2.4 各組大鼠肝移植后肝組織的病理組織學(xué)改變

光鏡下觀察見S組大鼠肝組織結(jié)構(gòu)未見明顯異常改變，在再灌注第6 h時，IRI組肝細(xì)胞可見不同程度的濁腫變性和空泡樣變性，呈氣球樣改變，并可見灶狀壞死及炎癥細(xì)胞聚集、浸潤；PGE1組肝小葉結(jié)構(gòu)損害較輕，可見散在肝細(xì)胞核濃縮、空泡變性，偶見單個肝細(xì)胞壞死（見圖2）。

圖2 各組大鼠肝移植后肝組織的病理組織學(xué)（HE染色×200）

3 討論

IRI普遍存在于機體各組織器官中[4-6]，目前常用的預(yù)防IRI的方法是缺血或藥物預(yù)處理。但對于已遭受缺血性打擊的器官來說，預(yù)處理應(yīng)用較局限。缺血后處理主要針對已缺血的器官，在再灌注開始時給予一系列短暫重復(fù)的機械性阻斷再灌注血流，可最大程度地減輕器官的IRI[2]。由于其良好的臨床可控性和可靠的保護效應(yīng)引起人們的廣泛關(guān)注。為更加適用于臨床，有研究者將該種機械調(diào)控轉(zhuǎn)變?yōu)樗幬锔深A(yù)，既藥物后處理（pharmacological postconditioning，PPC），并在心臟IRI中取得預(yù)期的效果[7-8]。近來研究認(rèn)為，缺血后處理可通過開放線粒體KATP通道（mitochondrial channel KATP）來保護肝臟的缺血再灌注損傷[9]。本研究將PGE1應(yīng)用于大鼠移植肝，觀察其是否能起到相似的保護作用。

肝臟IRI是移植術(shù)后肝臟損傷的重要因素。研究表明，IRI發(fā)生可能與鈣超載、氧自由基及其引發(fā)的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)等多種因素有關(guān)[5]。氧自由基的大量釋放被認(rèn)為是IRI的一個重要組成部分，缺血可使內(nèi)源性抗氧化劑如SOD失活或者耗盡，氧自由基清除減少。該氧自由基可以直接氧化核酸、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等生物大分子，造成其結(jié)構(gòu)的損毀、功能喪失；還能與生物膜上的不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，形成MDA。TNF-α主要由單核巨噬細(xì)胞（Kupf fer）產(chǎn)生，是肝臟缺血再灌注損傷的重要細(xì)胞因子，可通過多種途徑誘導(dǎo)炎性介質(zhì)活化和細(xì)胞浸潤，造成肝細(xì)胞損傷、壞死與凋亡[10]。因此提高體內(nèi)血清SOD的水平，降低肝組織TNF-α mRNA的表達(dá)有助于減輕移植肝IRI。

在本研究中，PGE1后處理明顯降低大鼠血清MDA的含量及肝組織TNF-α mRNA的表達(dá)，提高SOD的水平，同時可減輕肝移植術(shù)后肝功能的損害。光鏡下HE染色病理形態(tài)變化亦與上述各項變化規(guī)律相符。以上結(jié)果表明，PGE1后處理可通過減少再灌注后氧自由基的產(chǎn)生、減輕脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，并降低細(xì)胞因子TNF-α的表達(dá)，來減輕移植肝IRI。此結(jié)果可能為臨床移植肝IRI的防治提供新思路，為今后進一步研究打下基礎(chǔ)。

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Protection effect of post-processing prostagandin E1 in rat liver transplantation ischemia-reperfusion injury*

Yu-zhu Wang1,Ying-zi Ming2[1.Department of Hepatobiliary Pancreatic Surgery,People's Hospital of Zhengzhou University
(Henan Provincial People's Hospital),Zhengzhou,Henan 450003,China;2.Xiangya Transplant Institute of Medicine,Central South University,Changsha,Hunan 410013,China)

ObjectiveTo study the protective effects and mechanisms of prostaglandin E1(PGE1)postconditioning in liver graft ischemia-reperfusion injury.MethodsThe liver transplantation rat model was used as ischemia-reperfusion injury animal model.The rats were randomly divided into three groups:ischemic reperfusion injury group(IRI),postconditional PGE1 treated group(PGE1)and sham operated group(S).The liver functional tests,SOD,MDA,TNF-α expression level and the histology were checked at 2 h and 6 h after reperfusion.ResultsThe ALT,AST,MDA in serum and TNF-α expression level in liver were significantly lower in PGE1 group than in IRI group(P＜0.05),the SOD was higher in the PGE1 group(P＜0.05).The tissue damage was significantly decreased in PGE1 group.ConclusionsProstaglandin E1 postconditioning has significant protective effect in ischemia-reperfusion injury,and part of those benefit effects dependent on decreased TNF-α expression level and increased SOD production.

livertransplantation;ischemicreperfusioninjury;pharmacologicalpostconditioning; prostaglandin E1

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.08.004

1005-8982（2017）08-0017-04

2017-02-28

河南省科技攻關(guān)計劃資助項目（No：162102310303）