范才文，唐娟，黃輝，李璐，羅琴，易世江，向秋

（1.桂林醫(yī)學院科學實驗中心，廣西桂林541004；2.桂林醫(yī)學院附屬醫(yī)院，廣西桂林541001）

抑制核轉錄因子κBp65對鼻咽癌C N E2細胞的生物學影響

范才文1，唐娟2，黃輝2，李璐1，羅琴1，易世江2，向秋1

（1.桂林醫(yī)學院科學實驗中心，廣西桂林541004；2.桂林醫(yī)學院附屬醫(yī)院，廣西桂林541001）

目的探討核轉錄因子κBp65（NF-κBp65）沉默對鼻咽癌的生物學作用。方法構建NF-κBp65特異性小干擾核糖核酸（siRNA）質粒表達載體（pGPU6/RFP/Neo-NF-κBp65）和陰性對照質粒表達載體（pGPU6/RFP/Neo-NC）。采用非脂質體脂類轉染劑將重組質粒表達載體轉入人鼻咽癌CNE2細胞，建立NF-κ Bp65沉默的穩(wěn)定轉染CNE2細胞株（NF-κBp65沉默組）和陰性對照細胞株（陰性對照組）；蛋白質印跡法（Western blot）分析癌細胞中NF-κBp65基因的表達水平，MTT實驗及流式細胞術分析癌細胞的增殖能力和細胞周期變化；復制裸鼠移植瘤模型，分析沉默NF-κBp65對癌細胞成瘤性的影響。結果成功獲得穩(wěn)定轉染CNE2細胞株，NF-κBp65沉默組細胞中NF-κBp65蛋白表達水平降低；NF-κBp65沉默后，CNE2細胞周期阻滯于S期，增殖速度減慢；NF-κBp65沉默組裸鼠移植瘤生長慢，重量輕，與陰性對照組和空白對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=14.386，P＜0.05）。結論NF-κBp65沉默能降低鼻咽癌CNE2細胞的惡性生物學行為。

鼻咽癌；核轉錄因子-κBp65；小干擾核糖核酸

鼻咽癌起源于鼻咽黏膜上皮，在我國南方和東南亞地區(qū)高發(fā)，由于其發(fā)病部位隱匿，早期癥狀不明顯，確診時多數(shù)患者已達中晚期，因此，治療效果差，5年生存率低，主要原因是局部復發(fā)和遠處轉移[1]。核轉錄因子-κB（nuclear transcription factor-κB，NF-κB）是一個核轉錄因子家族，靜息狀態(tài)下，以同源或異源二聚復合體的形式與κB的抑制因子（IκB）結合，存在于細胞質內，其中，p50/p65二聚體幾乎存在于所有細胞中，p65有調節(jié)基因轉錄起始的結構域，并能促進p50與DNA結合[2]。當細胞受到刺激時，p50/p65復合體與其抑制因子解離，即所謂的NF-κB活化，暴露核定位信號（nuclear localization sequence，NLS）并進入細胞核內與靶基因結合，參與炎癥、免疫反應和腫瘤生成等相關基因的表達與調控[3]。鼻咽癌中NF-κBp65高表達，在晚期鼻咽癌中尤為明顯[4-5]。因此，NF-κBp65可能是鼻咽癌發(fā)生、發(fā)展和惡性生物學表型轉化的關鍵因素，也可能是鼻咽癌治療的潛在分子靶點。本研究擬采用小干擾核糖核酸（small interfering ribonucleic acid，siRNA）技術構建NF-κBp65沉默的鼻咽癌細胞株，探討NF-κBp65沉默對鼻咽癌CNE2細胞的生物學表型影響，為鼻咽癌的分子靶點治療提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與試劑

無特定病原體級（specific pathogen free，SPF）BALB/c雄性裸鼠（湖南省長沙斯萊克景達實驗動物有限公司），鼻咽癌CNE2細胞系（中南大學湘雅醫(yī)院細胞中心），轉染試劑（德國Qiagen公司），RPMI 1640培養(yǎng)液、MTT和G418（美國Gibco公司），胎牛血清（浙江省杭州四季青生物工程材料有限公司），兔抗人NF-κBp65一抗（美國Cell Signaling Technology公司），ECL發(fā)光液、HPR山羊IgG二抗和鼠抗人β-actin一抗（北京中杉金橋生物技術有限公司），碘化丙啶（propidium iodide，PI）染料、RNase A（美國Sigma公司），蛋白裂解液、BCA蛋白定量試劑盒（北京博奧森生物技術有限公司）。

1.2 NF-κBsiRNA質粒表達載體構建

從Genbank數(shù)據(jù)庫中獲得人NF-κBp65信使核糖核酸（messenger ribonucleic acid，mRNA）序列，設計NF-κBp65基因沉默的siRNA序列，并由江蘇省蘇州吉瑪基因股份有限公司合成。篩選抑制NF-κBp65基因表達效果明顯的siRNA序列5'-GGAC ATATGAGACCTTCAAGA-3'進行后續(xù)實驗，同時設陰性對照序列5'-GTTCTCCGAACGTGTCACGT-3'。將抑制NF-κBp65基因表達的siRNA序列亞克隆于pGPU6/RFP/Neo質粒表達載體，命名為pGPU6/ RFP/Neo-NF-κBp65，即NF-κBp65沉默的質粒表達載體（NF-κBp65沉默組）。同時構建陰性質粒表達載體（陰性對照組），命名為pGPU6/RFP/Neo-NC。

1.3 細胞轉染

CNE2細胞用含10%胎牛血清、100 u/ml青霉素和100 mg/L鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為置37℃、5%二氧化碳CO2及濕度飽和的培養(yǎng)箱。用含乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）的胰酶消化細胞，調整細胞密度后，接種于6孔板，細胞融合達70%時，將構建的質粒表達載體轉入CNE2細胞（按轉染試劑說明書進行操作），G418篩選14 d左右有單克隆細胞形成，在倒置熒光顯微鏡下觀察，挑選呈紅色的單克隆細胞轉入24孔板中培養(yǎng)，獲得穩(wěn)定轉染的CNE2細胞株。

1.4 穩(wěn)定轉染的CNE2細胞株鑒定

穩(wěn)定轉染的CNE2細胞株傳代培養(yǎng)48h后，收集細胞，加入蛋白提取液裂解細胞20 min，分離提取細胞總蛋白，二辛可酸（bicinchoninic acid，BCA）法分析蛋白濃度。蛋白樣品與上樣緩沖液混合，煮沸變性后，采用12%的分離膠，5%的濃縮膠進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。首先用80 V電壓電泳，待樣品條帶遷移至分離膠上緣時，電壓調為120V至電泳結束。蛋白轉至聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）采用恒流260 mA，時間為1.5 h。然后，采用5%脫脂奶粉封閉蛋白印跡PVDF膜1h，棄去封閉液，分別加入一抗NF-κBp65（1∶500）和內參β-actin（1∶1 000）；一抗4℃孵育過夜，TBST洗膜4次，每次5 min，加入二抗（1∶10 000），室溫孵育2 h，TBST洗膜4次，每次5 min，采用ECL化學發(fā)光法進行蛋白檢測。實驗設置：NF-κBp65沉默組（轉染pGPU6/RFP/Neo-NF-κBp65的CNE2細胞）和NC-陰性對照組（轉染pGPU6/RFP/Neo-NC的CNE2細胞），同時設空白對照組（未轉染載體的CNE2細胞）。

1.5 細胞增殖分析

胰酶消化對數(shù)生長期CNE2細胞，然后制備成單個細胞懸液，細胞懸液接種于96孔板，每組設3個復孔，每孔3 000個細胞。培養(yǎng)24、48和72 h后，每孔分別加入20 μl MTT（5 g/L），再培養(yǎng)4 h。棄上清液，每孔分別加入200 μl二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO），置96孔板于搖床輕輕振蕩10 min后，用酶標儀測定吸光度值，波長為490 nm。然后，計算細胞生長抑制率=（1-實驗組OD值/對照組OD值）×100%。

1.6 細胞周期檢測

細胞培養(yǎng)48 h后，胰酶消化收集細胞，低速離心棄上清液，PBS重懸洗滌細胞2次，4℃預冷70%的乙醇固定細胞≥12 h，1 000 r/min室溫離心5 min，磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）重懸細胞，洗滌2次，加入終濃度為100μg/ml的核糖核酸酶A（Ribonuclease A，RNase A），置37℃水浴1 h；加入終濃度為50μg/ml的PI染液，避光反應30 min后，濾網(wǎng)過濾，流式細胞儀檢測細胞周期。

1.7 裸鼠移植瘤實驗

6周齡雄性SPF級免疫缺陷BALB/c裸鼠12只，隨機分成3組，每組4只。右前肢皮下接種0.2 ml鼻咽癌CNE2細胞懸液（含1×107個細胞）。每天觀察動物的活動、進食情況，并檢查接種部位是否有移植瘤長出。接種鼻咽癌細胞大約10 d后，肉眼可見有鼻咽癌移植瘤長出，接種40 d后，采用麻醉法處死實驗小鼠，分離、摘除移植瘤并稱重。

1.8 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，兩組間比較用t檢驗，多組間比較用方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 鼻咽癌C N E2細胞系

pGPU6/RFP/Neo質粒表達載體攜帶紅色熒光蛋白基因，因此，熒光顯微鏡下觀察，轉入質粒表達載體的鼻咽癌CNE2細胞發(fā)紅色熒光，經(jīng)G418篩選獲得穩(wěn)定轉染的CNE2細胞株（見圖1）。

2.2 pG PU 6/R FP/N eo-N F-κBp65轉染對N F-κBp65表達的抑制作用

將pGPU6/RFP/Neo-NF-κBp65質粒表達載體轉染CNE2細胞，采用Western blot分析細胞中NF-κBp65基因的表達水平，結果顯示：與空白對照組和陰性對照組比較，NF-κBp65沉默組NF-κBp65蛋白表達下調（見圖2）。

2.3 N F-κBp65沉默對C N E2細胞增殖的抑制作用

采用MTT法分析NF-κBp65沉默組與陰性對照組和空白對照組細胞增殖的差異。本實驗以空白對照組細胞的增殖無抑制，即增殖抑制率為0作參考標準，細胞分別培養(yǎng)24、48和72 h后，NF-κBp65沉默組與陰性對照組比較，細胞增殖抑制率增高，生長受阻，經(jīng)t檢驗，沉默組與陰性對照比較，差異有統(tǒng)計學意義（見表1）。

2.4 N F-κBp65沉默對C N E2細胞周期的阻滯作用

圖1 pG PU 6/R FP/N eo-N F-κB p65轉染的C N E2細胞（熒光顯微鏡×100）

圖2 蛋白印跡分析N F-κB p65的蛋白表達

表1 N F-κB p65沉默對C N E2細胞增殖抑制率的影響（%±s）

表1 N F-κB p65沉默對C N E2細胞增殖抑制率的影響（%±s）

組別7 2 h陰性對照組-2 . 9 6 7 ± 5 . 2 8 6 5 . 0 9 4 ± 0 . 9 4 1 -0 . 3 6 1 ± 2 . 7 8 8 N F -κ B p 6 5沉默組3 0 . 3 7 1 ± 4 . 5 5 4 2 2 . 0 5 8 ± 5 . 4 8 8 2 1 . 9 0 2 ± 2 . 0 4 1t值-8 . 2 7 6 -5 . 2 7 7 -1 1 . 1 6 0P值0 . 0 0 1 0 . 0 0 6 0 . 0 0 0 2 4 h 4 8 h

采用流式細胞術分析NF-κB p65沉默組與陰性對照組和空白對照組的細胞周期差異。結果顯示，細胞培養(yǎng)48 h，NF-κB p65沉默組S期細胞為（29.790±0.832）%，與空白對照組（25.267±1.829）%和陰性對照組（24.377±1.570）%比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=11.658，P=0.009）（見表2和圖3）。

表2 N F-κB p65沉默對鼻咽癌C N E2細胞周期的影響（n=3，%，±s）

表2 N F-κB p65沉默對鼻咽癌C N E2細胞周期的影響（n=3，%，±s）

G2期空白對照組6 4 . 3 2 7 ± 2 . 8 9 4 2 5 . 2 6 7 ± 1 . 8 2 9 1 0 . 4 0 3 ± 1 . 0 8 0陰性對照組6 5 . 6 5 7 ± 3 . 0 5 5 2 4 . 3 7 7 ± 1 . 5 7 0 9 . 9 7 0 ± 1 . 6 7 5 N F -κ B p 6 5沉默組5 9 . 0 0 0 ± 1 . 9 7 6 2 9 . 7 9 0 ± 0 . 8 3 2 1 1 . 2 0 3 ± 1 . 1 4 4F值5 . 1 6 7 1 1 . 6 5 8 0 . 6 6 7P值0 . 0 5 0 0 . 0 0 9 0 . 5 4 7組別G1期S期

2.5 沉默N F-κBp65對C N E2細胞成瘤能力的影響

為研究NF-κB p65沉默后對鼻咽癌細胞成瘤性的影響，筆者將鼻咽癌CNE2細胞接種與裸鼠皮下。實驗結果發(fā)現(xiàn)，NF-κB p65沉默組裸鼠移植瘤生長慢，接種癌細胞40 d后，NF-κBp65沉默組移植瘤重量（0.350±0.259）g，低于陰性對照組（1.395± 0.404）g與空白對照組（2.933±1.085）g，沉默組與空白對照組和陰性對照組間移植瘤的重量比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=14.386，P＜0.05）（見圖4）。

圖3 細胞周期分析圖譜

圖4 C N E2細胞的裸鼠成瘤性分析

3 討論

NF-κB p65是NF-κB家族中的重要成員，在NF-κBp65的表達越高[4]。翁敬錦[5]報道，臨床Ⅰ期患者鼻咽癌組織NF-κB p65的表達陽性率僅為16.7%，而Ⅳb期則高達91.2%。為探索NF-κBp65在鼻咽癌中的作用，筆者構建其特異性siRNA質粒表達載體pGPU6/RFP/Neo-NF-κB p65進行研究。雖然，GUO等[6]采用慢病毒載體短發(fā)夾（short hairpin ribonucleic acid，shRNA）轉染肺癌A549細胞能抑制NF-κBp65的蛋白表達。但慢病毒載體感染對宿主細胞有一定程度的毒性，存在與宿主細胞發(fā)生重組而導致感染個體最終發(fā)病的危險。因此，筆者認為采用siRNA質粒表達載體轉染和G418篩選構建抑制NF-κB p65蛋白表達的穩(wěn)定轉染鼻咽癌CNE2細胞系更合適。該表達載體經(jīng)擴增、純化后轉染鼻咽癌CNE2細胞，NF-κBp65的蛋白表達下降，沉默效果良好（見圖2）。NF-κBp65沉默后，CNE2細胞的增殖能力減弱，生長受到抑制。NF-κBp65沉默后，CNE2細胞周期阻滯于S期。HINZ等[7]發(fā)現(xiàn)，細胞周期素D1（Cyclin-D1）啟動子區(qū)域有2個NF-κB結合位點，NF-κB的活化誘導Cyclin-D1表達，促進細胞G1/S期轉換，加速細胞周期進程，促進細胞增殖、生長。ROBE等[8]報道，體外特異性抑制NF-κB的活性能阻滯膠質瘤細胞株的細胞周期，抑制腫瘤細胞生長，并誘導其凋亡。NF-κBp65沉默對CNE2細胞周期的阻滯可能是CNE2細胞增殖受阻的機制之一。

筆者將穩(wěn)定轉染NF-κB p65沉默的CNE2細胞株接種裸鼠皮下，發(fā)現(xiàn)移植瘤生長緩慢，接種40d后，麻醉法處死裸鼠，分離移植瘤，發(fā)現(xiàn)瘤體小，重量明顯低于陰性對照組與空白對照組，差異有統(tǒng)計學意義（見圖4）。LIN等[9]報道，體外和體內抑制IL-6/ STAT3/NF-κB信號通路，人乳腺癌干細胞增殖和微球體形成受阻，核NF-κB p65和Cyclin D1蛋白下降，腫瘤生長慢、平均重量減小。NARAYANAN等[10]用甲基亞硝基脲（MNU）和睪酮誘導的大鼠前列腺癌，腫瘤生長的早期和晚期有浸潤的單核細胞，NF-κBp65表達升高。通過飲食給予塞來昔布，浸潤癌組織的單核細胞減少，NF-κBp65表達抑制，癌細胞凋亡和腫瘤生長抑制。REN等[11]發(fā)現(xiàn)，細胞中NF-κB p65持續(xù)過表達與腫瘤細胞自主的NF-κB活化相關，維持上皮細胞的存活和軟瓊脂集落形成。NF-κB驅動、誘發(fā)的上皮腫瘤涉及腫瘤細胞對NF-κB信號的自主效應和慢性炎癥“場效應”。NF-κB表達與活化有助于腫瘤細胞以自主的方式促進其發(fā)生與發(fā)展[12-13]。干擾NF-κB p65的表達，鼻咽癌CNE2細胞的成瘤能力降低，裸鼠移植瘤生長受抑制，惡性表型得到一定程度的控制。細胞周期阻滯可能是該效應的重要機制，但這種效應是否涉及誘導癌細胞凋亡和腫瘤細胞的NF-κB自主活化阻斷，還有待深入研究。另外，實驗中發(fā)現(xiàn)陰性對照組（轉染pGPU6/RFP/Neo-NC細胞）裸鼠移植瘤生長較空白對照組（未轉染載體的CNE2細胞）裸鼠移植瘤慢，這可能是質粒表達載體產(chǎn)生的作用，其內在的聯(lián)系尚不清楚。

綜上所述，NF-κB p65沉默能抑制鼻咽癌CNE2細胞的惡性表型，NF-κB p65可能是鼻咽癌治療潛在的有效分子靶點。

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Inhibition of NF-κBp65 expression reduce malignant phenotype of nasopharyngeal carcinoma CNE2 cell*

Cai-wen Fan1,Juan Tang2,Hui Huang2,Lu Li1,Qin Luo1,Shi-jiang Yi2,Qiu Xiang1
(1.Science Experimental Center,Guilin Medical College,Guilin,Guangxi 541004,China; 2.Affiliated Hospital of Guilin Medical College,Guilin,Guangxi 541001,China)

ObjectiveTo investigate the biological effects of NF-kappa B p65(NF-κBp65)on nasopharyngeal carcinoma.MethodsNF-κBp65 specific siRNA plasmid expression vector(pGPU6/RFP/Neo-NF-κB p65)and negative control plasmid expression vector(pGPU6/RFP/Neo-NC)were constructed and transfected into human nasopharyngeal carcinoma CNE2 cell line by non-liposomal lipid transfection agent to establish NF-κB p65 silencing stable transfected CNE2 cell line(NF-κB p65 silencing group)and negative control cell line(negative control group).The expression of NF-κB p65 gene in cancer cells was analyzed by Western blot.The proliferation and cell cycle of cancer cells were analyzed by MTT assay and Flow Cytometry.A xenograft model in nude mice was established to analyze the tumor igenicity of cancer cells.ResultsThe stable transfected CNE2 cell lines were successfully obtained.The expression of NF-κB p65 protein was decreased in cells of NF-κB p65 silencing group.The cell cycle was arrested in S phase and proliferation was reduced after NF-κB p65 was silenced.The growth of transplanted tumor in nude mice of NF-κB p65 silencing group was slower,and weight of transplanted tumor was lighter than that in negative control group or blank control group,the difference was statistically significant(F=14.386,P＜0.05).ConclusionsMalignantbiological phenotype of nasopharyngeal carcinoma CNE2 cell line could be reduced by silencing NF-κB p65.

nasopharyngeal carcinoma;NF-κB p65;siRNA

R739.6

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.08.002

1005-8982（2017）08-0007-05

2016-12-16

國家自然科學基金資助課題(No：81260344）；廣西自然科學基金資助課題（No：2013GXNSFAA019228）；廣西壯族自治區(qū)教育廳資助課題（No：LX2014274）

向秋，E-mail：guilin996@163.com