饒 丹, 朱余軍, 伍妙梨, 袁文, 王 靜, 尹雪琴, 叢 鋒, 練月曉,黃碧洪, 徐鳳嬌, 劉向楠, 劉助紅, 黃 韌, 張 鈺, 郭鵬舉

(廣東省實驗動物監(jiān)測所, 廣州 510663)

大鼠細小病毒雙重PCR檢測方法的建立

饒 丹, 朱余軍, 伍妙梨, 袁文, 王 靜, 尹雪琴, 叢 鋒, 練月曉,黃碧洪, 徐鳳嬌, 劉向楠, 劉助紅, 黃 韌, 張 鈺, 郭鵬舉

(廣東省實驗動物監(jiān)測所, 廣州 510663)

目的 建立快速檢測大鼠細小病毒的PCR方法。方法 根據(jù)大鼠細小病毒基因序列的特點，建立鑒別檢測大鼠細小病毒(RPV)與其他三種大鼠細小病毒(H-1、KRV、 RMV)的雙重PCR方法。根據(jù)RPV核酸序列的性質，在VP2基因篩選了一對用于特異擴增RPV株的引物，在NS1基因設計了一對用于特異性擴增H-1、KRV和RMV的引物。結果 兩對引物組成的二重PCR方法可以特異性的擴增RPV而不擴增核酸同源性高的小鼠細小病毒和多種其他病原微生物；敏感性實驗表明，二重PCR的最低檢測限可達1 000 拷貝/μL。雙重PCR結合測序在檢測23份臨床樣本中，檢測出7份RMV陽性，包括1份與RPV共感染陽性樣本。結論 本研究建立的檢測RPV的雙重PCR方法具有特異性好、靈敏度高及操作簡單等優(yōu)點，是一種簡便、可靠的檢測方法。

大鼠細小病毒(RPV); H-1; KRV; RMV; 雙重PCR

大鼠細小病毒是一類廣泛存在于大鼠群中的病毒，屬于細小病毒科，細小病毒屬，為一類無包膜的小DNA病毒。H-1(Toolan virus-1)株和KRV (Kilham Rat Virus)株是1950年代末期因感染大鼠中傳代的腫瘤細胞系而被發(fā)現(xiàn)，后續(xù)又在自然感染大鼠中發(fā)現(xiàn)了RPV(rat parvovirus)株和RMV(rat minute virus)株[1,2]。通常情況下，自然感染細小病毒的成年大鼠無臨床體征表現(xiàn); 臨床觀察到只有少數(shù)幾例KRV 自然感染的情況但還未發(fā)現(xiàn)H-1株自然感染的病例[3]。自然感染KRV株的大鼠可出現(xiàn)胎兒被母體吸收和胎兒小腦發(fā)育不全、乳鼠黃疸及幼鼠脫水等癥狀。H-1、RMV和RPV株感染大鼠后臨床癥狀不明顯，但也可在鼠群中造成持續(xù)性感染。在野生大鼠中大鼠細小病毒有較高的感染率較高，被感染鼠可通過糞便長期向外排毒，污染飼料、飲水和周圍環(huán)境，細小病毒在鼠群中持續(xù)存在對動物實驗研究結果造成干擾甚至嚴重影響[4]。

由于RPV株與其他3種大鼠細小病毒株及其他嚙齒動物細小病毒核酸同源性差異大[1]，建立一種檢測四種大鼠細小病毒株而不檢測其他嚙齒動物細小病毒株的單重PCR方法比較困難，這也給一次性篩查大鼠細小病毒株帶來不便。

本文建立了檢測4種大鼠細小病毒株的雙重PCR方法，并經特異性、敏感性及臨床樣品檢測。

1 材料與方法

1.1 試劑

核酸提取試劑盒為DNA/RNA共抽提試劑盒(天根)，PCR反應酶試劑、pMD-19T載體等試劑為TAKARA相關產品(大連寶生物)。

1.2 樣本的收集

大鼠細小毒株H-1, KRV來自于ATCC, RMV、RPV及其他病原株為本實驗室保存株。

病毒細胞培養(yǎng)物及臨床野生鼠樣本，用于試驗方法的驗證。

1.3 引物的設計

NCBI下載大鼠細小的所有全基因序列及小鼠、豬等細小病毒序列，比對全基因序列篩選擴增RPV株的特異引物及同時擴增H-1，KRV和RMV的引物。其中P1/P2引物用于擴增大鼠細小病毒RPV株，P3/P4引物用于擴增H-1，KRV和RMV株(表1)。

1.4 病毒DNA的提取

采用天根DNA/RNA提取試劑盒提取樣品中的大鼠細小病毒DNA，樣品包括組織臟器、糞便或細胞培養(yǎng)物。以從ATCC獲取的H-1、KRV株，本實驗室分離保存的RMV、RPV為陽性對照，以小鼠細小病毒MVM株、多瘤病毒(Poly)、肝螺桿菌、鼠傷寒沙門氏菌為樣本陰性對照，及水為空白對照。

表 1 雙重PCR引物Table 1 Primers of double PCR

1.5 PCR反應

采用Takara Premix Ex-Taq預混酶為PCR反應酶試劑, 反應總體積為20 μL, 內含Premix Ex-Taq 10 μL、引物P1/P2(各0.5 μL, 終濃度均為0.25 μmoL/L)、引物P3/P4(各0.5 μL, 終濃度為0.25 μmoL/L), DNA模板2 μL，雙重蒸餾水 6 μL。

PCR擴增反應程序為: 94 ℃預變性5 min; 94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s; 循環(huán)35 次; 72 ℃終延伸5 min。

1.6 敏感性分析

分別將各毒株擴增的基因片段插入PMD-19T載體中，將質粒從1×107拷貝/μL稀釋至1×101拷貝/μL，以各稀釋質粒為模板進行PCR擴增。

1.7 擴增反應分析

PCR產物以上樣量5 μL點樣于1.5%瓊脂糖凝膠中進行電泳，紫外透射儀下觀察擴增條帶。

2 結果

2.1 PCR擴增結果

圖1為陽性對照樣品與其他病原微生物在引物P1/P2, P3/P4下擴增的PCR產物電泳圖?；旌夏０迥軌蚯逦臄U增出RPV與RMV 目的條帶而無非特異性擴增。與大鼠細小病毒核酸同源性高的小鼠細小病毒MVM株以及其他病原微生物無擴增片段。

圖 1 雙重PCR檢測電泳圖Figure 1 Electrophoresis of dual PCR

2.2 PCR敏感性

為了能夠定量分析研究方法中引物的擴增效率，構建4種毒株基因片段的質粒。敏感性分析結果(圖2～4)表明，以單模板RMV基因片段構建的質粒在二重引物PCR擴增下檢測至少可達質粒稀釋的最大倍數(shù)的濃度10拷貝/μL，以單模板RPV基因片段構建的質粒在雙重引物擴增下的敏感性可達100拷貝/μL，以RPV和RMV混合模板在雙重引物擴增下的最低檢測濃度為1 000拷貝/μL。

2.3 臨床樣本檢測

圖 2 RMV單模板敏感性分析Figure 2 Sensitivity analysis of RMV single template

圖 3 RPV單模板敏感性分析Figure 3 Sensitivity analysis of RPV single template

圖 4 雙重PCR敏感性分析Figure 4 Sensitivity analysis of dual PCR

表 2 臨床樣本檢測結果Table 2 Detection of clinical sample

抽取野鼠樣本23份肝、脾組織混合樣品用于檢測驗證，樣本按照試劑盒說明抽提樣本總DNA/ RNA。檢測結果(表2)顯示: 除一份共感染的樣本外，其他多份樣本的PCR擴增條帶大小為226 bp，說明存在H-1、KRV和RMV株的其中一種或幾種，通過其他PCR驗證及測序分析，表明細小病毒株為RMV株，未檢測到H-1和KRV株。與RMV和RPV株在鼠群中感染率比較高的相關報道一致[5]。

3 討論

大鼠細小病毒是大鼠感染中比較常見的病毒，自然感染的大鼠通常無臨床癥狀。PCR 方法已經用于嚙齒動物細小病毒的檢測[4,6,7]，但還沒有一種用于檢測包括4種大鼠細小病毒株在內的PCR方法。本研究建立了一種可用于檢測包含4種大鼠細小病毒在內的雙重PCR方法，一對特異性引物擴增RPV株的VP2基因片段，另一對引物擴增另外3種大鼠細小株(H-1、KRV和RMV)的NS1基因序列。兩對物擴增的片段大小差為91 bp，便于凝膠電泳圖中對目的條帶的識別，同時因擴增片段大小差別適中對相互的擴增效率影響小。建立的方法通過特異性驗證，對于多種其他病原微生物無特異性擴增片段及可見雜帶，陽性樣本可獲得清晰的目的擴增片段并且無非特異性擴增。敏感性試驗中，單模板最低檢測限度分別可達10及100拷貝/μL，混合模板的最低檢測限度均可達1 000 拷貝/μL，可見兩對引物的擴增效率高，可作為可靠的檢測用引物。本研究建立的大鼠細小病毒雙重PCR方法對篩查大鼠細小病毒的感染具有一定的應用價值。

[1] Besselsen DG, Besch-Williford CL, Pintel DJ, et al. Detection of H-1 parvovirus and Kilham rat virus by PCR[J]. J Clin Microbiol, 1995, 33(7):1699-1703.

[2] 賀爭鳴, 衛(wèi)禮, 張然, 等. 檢測大鼠細小病毒抗體的ELISA、IEA和HI法比較[J]. 上海實驗動物科學, 1993, 13(3):132-134.

[3] 劉先菊, 佟魏, 張麗芳, 等. 大鼠細小病毒H-1株培養(yǎng)方法的建立[J]. 中國實驗動物學報, 2011, 19(6):495-498.

[4] Ball-Goodrich LJ, Leland SE, Johnson EA, et al. Rat parvovirus type 1: the prototype for a new rodent parvovirus serogroup [J]. J Virol, 1998, 72(4):3289-3299.

[5] Wan CH, Soderlund-Venermo M, Pintel DJ, et al. Molecular characterization of three newly recognized rat parvoviruses [J]. J Gen Virol, 2002, 83(8):2075-2083.

[6] Wan CH, Bauer BA, Pintel DJ, et al. Detection of rat parvovirus type 1 and rat minute virus type 1 by polymerase chain reaction[J]. Lab Anim, 2006, 40(1):63-69.

[7] 李曉波, 付瑞, 王吉, 等. 大鼠細小病毒 H-1 株和KRV株雙重PCR檢測方法的建立及應用[J]. 中國比較醫(yī)學雜志, 2015, 25(6):46-52.

Development of Dual PCR for Detection of Rat Parvovirus

RAO Dan, ZHU Yu-jun, WU Miao-li, YUAN Wen, WANG Jing, YIN Xue-qin, CONG Feng, LIAN Yue-xiao, HUANG Bi-hong, XU Feng-jiao, LIU Xiang-nan, LIU Zhu-hong, HUANG Ren, ZHANG Yu, GUO Peng-ju

Objective To establish a PCR method for rapidly detecting rat parvovirus. Methods According to the characters of nucleotide sequence of rat parvovirus, a dual PCR was developed to differentially detect RPV and other three rat parvovirus (H-1/KRV/RMV). A pair of primers amplifying VP2 gene were applied to exclusively amplify RPV while another pair of primers targeting the NS1 gene was designed for specific amplification of H-1, KRV and RMV primer. Result Rat parvovirus were screened without detecting minute virus of mice which had high nucleotide homology with rat parvovirus and also negative for three other microorganism pathogen. Sensitivity tests showed that the minimum detectable concentration was as low as 1 000 copies μL. When dual PCR combined with sequencing were applied to detect 23 clinical samples, seven samples detected were RMV positive including one coinfected with RPV. Conclusion The dual PCR was verified to be specific and sensitive which could be used as a reliable method to screen rat parvovirus.

Rat Parvovirus (RPV); H-1; KRV; RMV; Dual PCR

S855.3 Q95-33

A

1674-5817(2017)01-0032-04

10.3969/j.issn.1674-5817.2017.01.007

2016-09-05

廣東省科技計劃項目(2014B070706006); 國家科技支撐計劃(2015BAI07B00)廣東省科技計劃項目(2013B060400028)

饒 丹(1988-), 研究實習員, 研究方向: 臨床應用分子生物學。 E-mail: raodan2007@126.com

郭鵬舉(1970-), 研究員, 研究方向: 獸醫(yī)免疫學。E-mail: PIGuo2016@163.com