李銀銀, 龔菁菁, 吳紹亮, 李小紅, 王存龍, 霍學(xué)云, 路 靜,呂建祎, 劉 欣, 郭 萌,2, 李長龍, 陳振文, 杜小燕,2

(首都醫(yī)科大學(xué) 1. 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院; 2. 實(shí)驗(yàn)動物部, 北京100069; 3. 山東省臨沭縣人民醫(yī)院, 臨沭 276700)

ND3在自發(fā)性糖尿病長爪沙鼠5種組織中的表達(dá)

李銀銀1, 龔菁菁1, 吳紹亮3, 李小紅1, 王存龍1, 霍學(xué)云1, 路 靜1,呂建祎1, 劉 欣1, 郭 萌1,2, 李長龍1, 陳振文1, 杜小燕1,2

(首都醫(yī)科大學(xué) 1. 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院; 2. 實(shí)驗(yàn)動物部, 北京100069; 3. 山東省臨沭縣人民醫(yī)院, 臨沭 276700)

目的 分析糖尿病長爪沙鼠5種組織中ND3基因在mRNA和蛋白水平的表達(dá)，以期探索長爪沙鼠糖尿病模型中ND3的作用及其靶器官。方法 選取血糖正常對照組沙鼠和糖尿病實(shí)驗(yàn)組沙鼠各6只，分別采集動物的腎臟、肝臟、骨骼肌、腦和心臟組織，采用實(shí)時(shí)定量PCR和Western blotting方法檢測在各組織中ND3 mRNA和ND3蛋白水平表達(dá)狀況。結(jié)果 與對照組動物相比，糖尿病長爪沙鼠ND3 mRNA表達(dá)水平在腎臟組織中極顯著升高，肝臟和肌肉組織中則顯著降低，腦組織中僅有降低趨勢，而在心臟組織中僅有升高趨勢。檢測ND3蛋白水平表明，除心臟組織外，其他組織均與mRNA水平表達(dá)結(jié)果一致。結(jié)論 腎臟組織可能是糖尿病長爪沙鼠ND3基因作用的主要部位，同時(shí)在其他4種組織中該基因也發(fā)揮著一定作用。

長爪沙鼠; 2型糖尿病; ND3基因; 實(shí)時(shí)定量PCR; Western blotting

糖尿病是嚴(yán)重威脅人類健康的重大疾病之一，近半個(gè)世紀(jì)來，其患病率和死亡率呈明顯上升趨勢，在我國已成為繼心血管疾病、腫瘤之后位列第三的常見病、多發(fā)病和慢性非傳染性疾病[1]。其中2型糖尿病即非胰島素依賴型是糖尿病的主要類型[2]。2型糖尿病是由遺傳因素和環(huán)境因素共同作用導(dǎo)致的復(fù)雜遺傳病，以葡萄糖耐量降低、胰島素抵抗為主要特征[3]。本研究室前期通過定向培育的方法初步篩選到一只糖尿病長爪沙鼠近交系模型，其具有空腹血糖升高、糖耐量受損、胰島素抵抗和瘦素抵抗、脂聯(lián)素水平降低等2型糖尿病模型特征，且具有遺傳性[9]。

由于糖尿病是多基因控制復(fù)雜疾病, 2型糖尿病的發(fā)病機(jī)制目前仍不完全清楚, 易感基因的存在及其功能改變可能是影響糖尿病發(fā)生的重要因素[4]。作者前期[5]通過抑制消減雜交(suppression subtractive hybridization, SSH)的方法在自行培育的近交系高血糖長爪沙鼠和正常血糖長爪沙鼠骨骼肌中發(fā)現(xiàn)煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)脫氫酶亞單位3(NADH dehydrogenase 3，ND3)基因表達(dá)有差異，但其在遺傳性2型糖尿病長爪沙鼠不同組織中的表達(dá)情況還不夠清楚。因此，本實(shí)驗(yàn)旨在對ND3在糖尿病沙鼠和正常沙鼠的腎臟、肝臟、骨骼肌、腦和心臟組織中mRNA和蛋白水平的表達(dá)情況進(jìn)行分析，以期探索長爪沙鼠糖尿病模型致病機(jī)制中ND3的作用和靶器官，為長爪沙鼠2型糖尿病新模型的發(fā)生機(jī)制研究提供新的切入點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物選擇

選取近交系糖尿病模型長爪沙鼠和正常對照組沙鼠各6只, 12～15周齡, 雌雄各半。所有動物均來自首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物部[SCXK(京)2015-0009], 于溫濕度控制的普通環(huán)境中飼養(yǎng)[SYXK(京)2013-0005]。

1.2 樣品采集

糖尿病和正常長爪沙鼠均用過量戊巴比妥溶液腹腔注射麻醉施行安死術(shù)，快速采集新鮮的腎臟、肝臟、骨骼肌、腦和心臟等5種組織后立即置于液氮中凍存待用。

1.3 儀器和試劑

儀器: 研磨珠均質(zhì)器(BioSpec, 美國); 低溫高速離心機(jī)(Eppendorf Centrifuge 5417R, Eppendorf, 德國); Nanodrop 2000c(Thermo Scientific, 美國); PCR儀(Applied Biosystems, 美國); Bio-Rad CFX96 manager System; 電泳儀、電轉(zhuǎn)儀和凝膠圖像分析系統(tǒng)(Bio-Rad, 美國)。

試劑: 戊巴比妥(北京化學(xué)試劑公司); TRIzol Reagent 試劑(Invitrogen, 美國); 三氯甲烷、無水乙醇、異丙醇(北京暢力通有限公司, 北京); 快速反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Fast Quant RT Kit)和實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒(SuperReal PreMix Plus, SYBR Green)(天根生化科技有限公司, 北京); 組織蛋白提取試劑盒和二喹啉甲酸(Bicinchoninic Acid，BCA)蛋白定量試劑盒(康為世紀(jì)生物科技有限公司, 北京); ND3抗體(Abcam, 英國)。

1.4 各組織RNA提取及cDNA的制備

將長爪沙鼠5種組織從液氮中取出, 剪取部分組織于均質(zhì)管中, 分別加入約1 mL TRIzol Reagent試劑后進(jìn)行組織破碎, TRIzol試劑法抽提組織總RNA[6]。得到RNA沉淀晾干后, 加入適量不含RNase水溶解得組織總RNA。采用Nanodrop 2000c分析RNA濃度和純度。使用快速反轉(zhuǎn)錄試劑盒對上述總RNA樣品進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。首先用試劑盒所含gDNase, 42 ℃孵育3 min后去除基因組DNA, 利用試劑盒所含高效反轉(zhuǎn)錄酶在42 ℃條件下先孵育15 min, 接著95 ℃再孵育3 min, 完成反轉(zhuǎn)錄得到相應(yīng)的cDNA低溫保存, 用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5 實(shí)時(shí)定量PCR

按照SSH得到的ND3基因片段序列，利用Primer Premier 5.0 設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物3對并優(yōu)化選擇, 最終使用ND3-1引物(表1)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。5種組織均選取β-actin基因作為內(nèi)參基因并設(shè)計(jì)引物(表1)。各引物均由北京天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成。

采用實(shí)時(shí)定量 PCR法在Bio-Rad CFX96 managerSystem上對ND3的mRNA水平進(jìn)行檢測。所用試劑盒為實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒, 反應(yīng)體系總為20 μL。體系中包含如下組分: 2×Super Real PreMix Plus 10 μL,上游引物0.6 μL, 下游引物0.6 μL, 模板cDNA 1 μL, RNase-Free H2O 7.8 μL。反應(yīng)程序均為: 95 ℃15 min,之后95 ℃10 s, 59.1 ℃30 s, 共循環(huán)40次，每個(gè)循環(huán)結(jié)束時(shí)檢測熒光; 從60 ℃到95 ℃分析熔解曲線,每增加0.5℃檢測一次。

表 1 ND3和內(nèi)參基因?qū)崟r(shí)定量PCR引物序列Table 1 Primer sequence of ND3 and internal control genes for Real time-PCR

1.6 Western blotting

取液氮凍存的長爪沙鼠腎臟、肝臟、骨骼肌、腦和心臟等5種組織于均質(zhì)管中, 剪碎后用組織蛋白提取試劑盒提取組織總蛋白, 采用BCA定量法對蛋白進(jìn)行定量。取30 μg總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分離，半干法電轉(zhuǎn)蛋白至NC膜。以TBST (25 mmol/L Tris-base，0.15 mol/L NaCl，0.05% Tween-20，pH7.5)含5%脫脂牛奶封閉膜過夜。用ND3抗體(1∶1 000稀釋) 4℃孵育過夜，TBST洗滌3次后與第二抗體(辣根過氧化酶聯(lián)的抗兔血清)室溫孵育1 h，TBST洗膜后用化學(xué)發(fā)光法顯色。5種組織均選用GAPDH作為內(nèi)參蛋白。最后用凝膠圖像分析系統(tǒng)掃描蛋白質(zhì)印跡條帶灰度。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)方法分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 在糖尿病沙鼠和對照組的5種組織中ND3 mRNA 表達(dá)水平的差異

與對照組(Control)相比, 糖尿病組(DM)腎臟(Kidney)組織中ND3 mRNA的表達(dá)極顯著升高(圖1)，參照SSH的結(jié)果中，該基因在糖尿病沙鼠中的表達(dá)量高于正常沙鼠，該結(jié)果與消減雜交結(jié)果相一致。在肝臟(Liver)和肌肉(Muscle)組織中，ND3在糖尿病組的表達(dá)量均顯著低于對照組，腦(Brain)組織mRNA表達(dá)量僅有下降趨勢, 而在心臟(Heart)組織中，mRNA的表達(dá)僅有升高趨勢。

2.2 在糖尿病沙鼠5種組織中ND3蛋白表達(dá)水平

Western blotting檢測ND3蛋白在5種組織中的表達(dá)結(jié)果顯示, 腎臟中糖尿病組的蛋白水平極顯著高于對照組, 與實(shí)時(shí)定量 PCR的趨勢結(jié)果一致(圖2)。肝臟組織中ND3在糖尿病組中蛋白水平顯著低于對照組，腦組織有極顯著下降，均與其mRNA的表達(dá)水平趨勢相一致。在心臟組織中，糖尿病組與對照組相比ND3蛋白也顯著降低，而骨骼肌中僅有降低趨勢。

3 討論

2型糖尿病在糖尿病患者中占比達(dá)90%以上[7],因此多數(shù)相關(guān)研究是針對2型糖尿病發(fā)生機(jī)制的研究。2型糖尿病是由多基因控制的復(fù)雜內(nèi)分泌代謝性疾病，因此用自發(fā)性糖尿病模型研究其分子遺傳發(fā)生機(jī)制是理想的手段[8]?，F(xiàn)有糖尿病動物模型包括實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)的、自發(fā)的及轉(zhuǎn)基因小鼠、大鼠和豬，但都有不同程度的缺陷，如耗時(shí)、丟失基因表型等。本研究室前期[9]經(jīng)過定向培育形成了一個(gè)自發(fā)性糖尿病長爪沙鼠模型群體，經(jīng)研究證實(shí)其具有2型糖尿病特性，能夠自發(fā)形成糖尿病并具有遺傳性, 在群體中的發(fā)生率較高(目前培育到F17代，發(fā)生率在66%以上)，是對已有模型的重要補(bǔ)充。作者利用這一實(shí)驗(yàn)材料，通過SSH方法從骨骼肌中篩選到糖尿病和正常沙鼠差異表達(dá)的基因ND3，并對該基因進(jìn)行了不同組織器官的表達(dá)水平研究。

由于2型糖尿病會影響一些外周組織和核心器官的代謝和功能[10]，作者選取了腎臟、肝臟、骨骼肌、腦和心臟組織進(jìn)行ND3基因表達(dá)水平的研究。有報(bào)道[11]稱線粒體基因變異與2型糖尿病的發(fā)生存在一定的相關(guān)性。ND3是由線粒體ND3基因編碼的蛋白質(zhì), ND3變體與線粒體腦肌病伴乳酸血癥和卒中樣發(fā)作有關(guān)，以及與Leigh綜合征、亞急性壞死性腦病和Leber氏遺傳性視神經(jīng)病相關(guān)[12]。由于線粒體ND3基因所表達(dá)的酶亞單位是呼吸鏈復(fù)合物I的重要組成部分，理論上β細(xì)胞ND3基因缺陷會導(dǎo)致呼吸鏈復(fù)合物I活性降低，從而引起胰島β細(xì)胞功能障礙使糖尿病發(fā)病成為可能，則ND3在2型糖尿病致病機(jī)制中可能發(fā)揮著重要作用[13]。

圖 1 ND3在沙鼠5種組織mRNA表達(dá)水平A-E: The relative mRNA expression levels of ND3 in 5 tissues (kidney, liver, muscle, brain and heart) between both groups of gerbils. Results were normalized to the housekeeping gene β-actin(n=6,*P＜0.05,**P＜0.01)Figure 1 mRNA expression level of ND3 in 5 tissues from control and diabetic gerbils

圖 2 ND3在沙鼠5種組織中蛋白的表達(dá)A-E: The relative protein expression levels of ND3 in 5 tissues (kidney, liver, muscle, brain and heart) between control and diabetic gerbils. 1 to 6 are from control group, 7 to 12 are from diabetes group. Below the bands of gray scan, semi-quantitation of data shown corresponding statistics determined by using Image J (n=6,*P＜0.05,**P＜0.01)Figure 2 Protein expression level of ND3 in 5 tissues from diabetic and control gerbils

本文中糖尿病長爪沙鼠腎臟組織ND3 mRNA和ND3蛋白表達(dá)水平均有升高(P＜0.01)。糖尿病性腎病是糖尿病慢性并發(fā)癥之一[14]，腎臟中糖尿病相關(guān)的血糖紊亂、微血管病變可致慢性腎功能不全、蛋白尿以及腎小球病變[15,16]。有研究表明[17]ND3變異可能引起線粒體氧化磷酸化作用的缺失，以及與糖尿病腎病、肌肉萎縮和脂肪肝等相關(guān)。本文結(jié)果還表明，糖尿病長爪沙鼠的肝臟中ND3的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平降低，而肝臟是血糖代謝調(diào)節(jié)的重要器官，當(dāng)血糖濃度較高時(shí)，肝臟通過合成肝糖原及脂蛋白來降低血糖濃度；血糖濃度較低時(shí)，肝臟通過肝糖原分解或糖異生作用升高血糖。因此，在糖尿病動物中其線粒體氧化供能作用降低，由此可能引起ND3的表達(dá)水平也降低[18]。

骨骼肌是葡萄糖吸收和脂肪酸氧化最大的器官，在胰島素的作用下吸收人體大部分的血糖以進(jìn)行肌肉的有氧和無氧呼吸，因此它對全身糖代謝起非常重要作用[19]，而ND3基因的缺失會導(dǎo)致線粒體氧化吸收葡萄糖作用降低，呼吸作用受影響。本研究檢測到2型糖尿病模型長爪沙鼠肌肉中ND3的表達(dá)降低可能也與肌肉中該基因的變異有關(guān)。糖尿病患者腦內(nèi)線粒體利用葡萄糖產(chǎn)生大量活性氧導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激，影響腦部神經(jīng)電生理和病理狀態(tài)[20]。并且有研究表明[21]線粒體ND2基因C5178 A多態(tài)性與2型糖尿病患者并發(fā)心腦血管病有密切關(guān)系，同為線粒體電子呼吸鏈上復(fù)合體I的編碼基因之一，ND3基因在本研究中也在心臟和腦組織中有mRNA和蛋白水平的表達(dá)變化。

綜上所述，作者對長爪沙鼠糖尿病模型研究表明，腎臟組織可能是糖尿病長爪沙鼠ND3基因作用的主要部位，同時(shí)在其他4種組織中該基因也發(fā)揮著一定作用，這一結(jié)果或可對利用長爪沙鼠深入研究2型糖尿病發(fā)生的分子機(jī)制提供新的思路。

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Expression of ND3 in 5 Tissues of Hereditary Diabetic Mongolian Gerbils

LI Yin-yin1, GONG Jing-jing1, WU Shao-liang3, LI Xiao-hong1, WANG Cun-long1, HUO Xue-yun1, LU Jing1, LV Jian-yi1, LIU Xin1, GUO Meng1,2, LI Chang-long1, CHEN Zhen-wen1, DU Xiao-yan1,2
(1. School of Basic Medical Science; 2. Department of Laboratory Animal, Capital Medical University, Beijing 100069, China; 3. The People’s Hospital of Linshu, Linshu 276700, China)

Objective To investigate the mRNA and protein expression level of NADH dehydrogenase 3(ND3) gene in 5 different tissues of diabetic gerbils, to understand the location and target tissue of ND3 in diabetic gerbil model. Methods Six gerbils for control and diabetic groups were selected respectively. The kidney, liver, skeletal muscle, brain and heart from each group were collected. The mRNA and protein expression of ND3 were evaluated by Real time-PCR and Western blotting in both groups. Results The mRNA expression of ND3 in diabetic group was extremely significantly increased in kidney, and significantly decreased in liver and skeletal muscle compared with those of control animal. While it just showed decreasing tendency in brain and increasing tendency in heart tissue. The detection of protein expression showed that the protein level was consistent with mRNA expression in all tissues except heart. Conclusions The kidney may be the target tissue of ND3 in diabetic gerbil. In addition, ND3 also exhibits effect in other 4 tissues of diabetic gerbil.

Mongolian gerbils; Type 2 diabetes; ND3; Real-time PCR; Western blotting

Q95-33

A

1674-5817(2017)01-0006-05

10.3969/j.issn.1674-5817.2017.01.002

2016-09-30

國家科技支撐計(jì)劃(No. 2015BAI09B01); 國家自然科學(xué)基金 (Nos. 31272393, 31572348); 北京自然基金(No. 7141002)

李銀銀(1989-), 女, 碩士研究生, 專業(yè): 實(shí)驗(yàn)動物學(xué)。E-mail: yyl7590@163.com

杜小燕(1971-), 女, 博士, 副教授。主要從事實(shí)驗(yàn)動物教學(xué)和研究。E-mail: duduyan@ccmu.edu.cn