陳 翠, 孟哲穎, 鄭元義, 胡 兵,2, 申鍔,2,3

(1. 上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院,上海 200233; 2. 上海超聲醫(yī)學(xué)研究所, 上海 200233; 3. 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬同仁醫(yī)院, 上海 200336)

·論 著·

FGF21siRNA對STZ誘導(dǎo)的1型糖尿病小鼠心臟功能的影響

陳 翠1, 孟哲穎1, 鄭元義1, 胡 兵1,2, 申鍔1,2,3

(1. 上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院,上海 200233; 2. 上海超聲醫(yī)學(xué)研究所, 上海 200233; 3. 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬同仁醫(yī)院, 上海 200336)

目的 探討成纖維細胞生長因子21(FGF21)siRNA對鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)的1型糖尿病(T1DM)小鼠心臟功能的影響機制。方法 16只8周齡雄性C57BL/6J小鼠隨機分為正常對照組(n=6)，F(xiàn)GF21siRNA對照組(n=10), 16只T1DM模型小鼠分為T1DM組(n=6)，T1DM+FGF21siRNA組(n=10)。T1DM模型由單次腹腔注射STZ(150 mg/kg)建立。8周后行FGF21siRNA給藥。實驗到達終點時采用小動物高分辨超聲儀測量小鼠心臟功能;光學(xué)顯微鏡下HE染色觀察心肌細胞形態(tài), Masson染色觀察纖維化程度，利用實時 PCR技術(shù)檢測心肌組織α-肌球蛋白重鏈(α-MHC)，β-肌球蛋白重鏈(β-MHC), 心房鈉尿肽(ANP)、I型膠原(Col I) 和III型膠原(Col III)及FGF 21 mRNA的表達含量。結(jié)果 與正常對照組小鼠相比，T1DM小鼠的心臟功能減低，心肌細胞肥大，膠原纖維增生，伴隨小鼠心肌組織 ANP、α-MHC、β-MHC、Col I、Col III mRNA表達增加，T1DM小鼠經(jīng)FGF 21siRNA處理后上述表現(xiàn)進一步加重。結(jié)論 FGF21siRNA能降低1型糖尿病小鼠的心臟功能，其機制可能與心肌肥大和心肌纖維化有關(guān)。

成纖維細胞生長因子21(FGF 21) siRNA; 1型糖尿病(T1DM); 糖尿病心肌病; 心肌肥大;心肌纖維化

1972年Rubler等[1]研究了4例伴有充血性心力衰竭的糖尿病患者, 其冠狀動脈正常，沒有其他引起充血性心力衰竭的病因, 他們提出該疾病是由糖尿病心肌病導(dǎo)致。Bell等[2]將糖尿病心肌病定義為與冠狀動脈疾病不相關(guān)的疾病，它以舒張功能障礙為特征，少有明顯的臨床表現(xiàn)，除非并發(fā)高血壓(臨床表現(xiàn)明顯時)和/或心肌缺血(臨床表現(xiàn)嚴重時)。

成纖維細胞生長因子21(fibroblast growth factor 21, FGF21)是含有209/210個(人/嚙齒類動物)氨基酸殘基組成的多肽, 主要由肝臟、脂肪組織及胸腺產(chǎn)生和分泌[3]。FGF21也在其他組織中表達, 例如心肌[4]。FGF21作為內(nèi)源性的物質(zhì)代謝調(diào)節(jié)因子, 其與肥胖、糖尿病及代謝綜合征等代謝性疾病的關(guān)系研究已成為熱點, 人血清FGF21在上述疾病中表達的升高提示FGF21參與代謝性疾病的發(fā)生發(fā)展[5,6]。然而, FGF21對心臟的作用還有待深入研究。現(xiàn)有研究[7]表明FGF21通過促進大量抗氧化基因表達阻止心臟肥大, 并且以自分泌形式抑制活性氧形成。1型糖尿病(T1DM)大鼠的心臟FGF 21 mRNA表達與糖尿病進展呈正相關(guān)[4]。本實驗擬用STZ誘導(dǎo)的小鼠T1DM模型, 應(yīng)用FGF21siRNA降低小鼠FGF21的表達,觀察小鼠心臟功能變化、心肌組織α-肌球蛋白重鏈(α-myosin heavy chain, α-MHC)、β-肌球蛋白重鏈(β-myosin heavy chain，β-MHC)、心房鈉尿肽(ANP)、I 型膠原(Col I)和III型膠原(Col III)表達, 從功能及結(jié)構(gòu)方面探討FGF21對糖尿病心肌病的影響機制。

1 材料與方法

1.1 糖尿病動物模型建立及分組

SPF級雄性C57BL/6J小鼠40只, 5～6周齡, 體質(zhì)量18～20 g，購于上海斯萊克實驗動物有限公司[SCXK(滬)2007-0005]，于上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院動物實驗中心[SYXK(滬)2011-0128]操作實驗。小鼠達8周齡后，隨機選取20只通過一次性腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)(150 mg/kg) 建立T1DM小鼠模型, 48 h后經(jīng)鼠尾靜脈釆血并檢測, 血糖大于16.7 mmol/L為成模。本實驗中成模率80%, 成模后隨機選取同等數(shù)量正常組小鼠16只, 共32只小鼠分為4組: 正常對照組(n=6), FGF21siRNA對照組(n=10), T1DM(n=6), T1DM+FGF21siRNA組(n=10)。成模8周后行FGF21siRNA尾靜脈注射, 給藥劑量為5 μg/g,實驗于給藥72 h后結(jié)束。

1.2 主要試劑及儀器

STZ(美國Sigma公司), Onetouch II 血糖儀(美國強生公司); 小動物用高分辨超聲儀 (Vevo2100, 加拿大VisualSonics公司); FGF21siRNA (Genepharma,上海), DEPC水，轉(zhuǎn)染試劑，葡萄糖, Trizol試劑(美國Sigma公司) 。

1.3 超聲心動圖技術(shù)測量心臟功能

于實驗終點使用小動物高分辨超聲儀檢測小鼠心臟功能:腹腔注射質(zhì)量分數(shù)1.5%戊巴比妥鈉進行麻醉(0.1 mL/20 g), 然后將小鼠固定在37℃的恒溫墊上，小鼠四肢末端用4個電極連接。獲取胸骨旁長軸切面M型超聲心動圖，測定左心室舒張末期內(nèi)徑(LVIDd)，左室收縮末期內(nèi)徑(LVIDs)，取3個持續(xù)心動周期的平均值作為原始數(shù)據(jù)，軟件自動測算左室短軸縮短率(fractional shortening, FS)，左室射血分數(shù) (ejection fraction, EF) 。

1.4 光學(xué)顯微鏡下觀察心肌細胞形態(tài)及膠原纖維

小鼠左心室心肌組織用體積分數(shù)10%中性甲醛固定，脫水、清洗、石蠟包埋后制成切片, HE染色及Masson染色后在光學(xué)顯微鏡下觀測并攝片。

1.5 實時 PCR檢測

使用Trizol試劑抽提總RNA并檢測濃度和純度,取2 μg總RNA按照M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶行反轉(zhuǎn)錄(RT),合成cDNA, 加入特異引物(引物序列見表1)及PCR所需試劑, 行PCR循環(huán)。檢測目的基因α-MHC、β-MHC、Col I和Col III、ANP及FGF 21 mRNA。甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH) 作為內(nèi)參?？偡磻?yīng)體積為20 μL, 擴增條件為 94℃預(yù)變性5 min, 94 ℃60 s，62 ℃40 s，72 ℃60 s，延伸10 min，內(nèi)參擴增27個循環(huán), 目的基因擴增32個循環(huán)。以目的基因β-MHC、α-MHC、ANP、Col I、Col III及FGF21與GAPDH比率做定量分析。

班主任負責班級的全面管理工作，是落實學(xué)校教學(xué)理念的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。但是由于中小學(xué)生在身心發(fā)展方面不夠全面，在日常的班級管理工作中，班主任面臨的工作任務(wù)比較多，這對于班主任的個人能力和素質(zhì)提出了比較高的要求。許多班主任在工作的過程中容易感受到心理不平衡，認為自己的付出與回報不成比例，在工作的過程中身心疲憊，嚴重地影響了班主任工作的效率，面對這些問題，需要不斷地完善班主任的發(fā)展策略。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

用SPSS21.0 統(tǒng)計軟件包完成數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標準差表示，組間比較用單因素方差分析(One-way ANOVA)，兩兩比較用q檢驗, P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 糖尿病小鼠體質(zhì)量及血糖變化

STZ注射后48 h小鼠較正常組小鼠體質(zhì)量降低，血糖升高(P＜0.05)，表明造模成功。各組小鼠體質(zhì)量及血糖變化(表2)。

2.2 糖尿病小鼠心臟功能變化

相比于正常對照組, T1DM 組小鼠EF, FS明顯減低(P＜0.05); T1DM+FGF21siRNA組比T1DM組EF和FS進一步減低(P＜0.05); 但FGF21siRNA對照組與正常對照組差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)(表3、圖1)。

表 1 β-MHC, α-MHC, Col I, Col III, ANP, FGF21, GAPDH的PCR擴增引物Table 1 Primer sequence of β-MHC, α-MHC, Col I, Col III, ANP, FGF21, GAPDH

表 2 各組小鼠體質(zhì)量及血糖Table 2 Changes of body weight and blood glucose in mice

2.3 心肌細胞形態(tài)改變及膠原纖維增生

與正常對照組小鼠心肌細胞(圖2A)比較，T1DM組小鼠心肌排列紊亂, 心肌細胞肥大，細胞核增大(圖2C), FGF21siRNA處理T1DM小鼠后, 心肌細胞肥大程度及細胞核增大程度更顯著(圖2D),單純FGF 21siRNA處理組則未見明顯改變(圖2B)。Masson染色顯示FGF21siRNA處理后的T1DM小鼠(圖2H)較未處理小鼠(圖2G)膠原纖維明顯增加，正常對照組(圖2E)與FGF21siRNA組(圖2F)未見明顯差異。

表 3 小鼠心臟功能變化Table 3 Cardiac function of mice in each group %

圖 1 小鼠心臟超聲表現(xiàn)Figure 1 Echocardiography performance of mice

圖 2 小鼠心肌細胞形態(tài)及膠原纖維增生Figure 2 Cardiomyocytes morphology and collagen fibro proliferation

2.4 FGF21siRNA沉默效果

與正常對照組比較, FGF21siRNA處理組心肌組織內(nèi)FGF 21 mRNA表達水平降低(P＜0.05)，表明FGF21siRNA有效沉默F(xiàn)GF 21 mRNA表達(圖3)。

2.5 心肌組織β/α-MHC、 Col I 、Col III、ANP變化

與正常對照組比較，T1DM組小鼠心肌組織內(nèi)β/αMHC比值及 ANP, Col I, Col III表達水平均升高 (P＜0.05); T1DM+FGF21siRNA組β/αMHC比值及ANP, Col I, Col III表達水平較T1DM組升高(P＜0.05); 但FGF21siRNA對照組與正常對照組差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)(表4)。

圖 3 FGF 21siRNA處理組FGF 21 mRNA表達量Figure 3 Expression of FGF 21 mRNA in cardiac tissue of mice treated with FGF21siRNA

表 4 各組小鼠心肌組織β/α-MHC、 Col I 、Col III、ANP變化Table 4 Changes of β/α-MHC, Col I, Col III, ANP in cardiac tissue of mice

3 討論

血清FGF21與心血管疾病關(guān)系密切, 動脈粥樣硬化、冠心病、心肌缺血, 心臟肥大, 糖尿病心肌病的患者血清中FGF21含量增加[3]。外源性FGF21干預(yù)能顯著預(yù)防DM早期誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡[8], 內(nèi)源性FGF21在糖尿病狀態(tài)下也能發(fā)揮抗心肌細胞凋亡作用[4]。本實驗應(yīng)用STZ構(gòu)建DM病小鼠模型，通過FGF21siRNA降低小鼠心肌中FGF21 mRNA表達，研究FGF21與糖尿病心肌病的關(guān)系。超聲心動圖檢查顯示T1DM組小鼠心臟功能低于正常組,經(jīng)過FGF21siRNA處理后心臟功能進一步降低, 表明FGF21siRNA可降低心臟射血分數(shù)及左室短軸縮短率, 降低T1DM小鼠的心臟功能。

β/α-MHC比值及ANP是反應(yīng)心肌肥大的代表性指標。與正常對照組小鼠相比, T1DM組小鼠心肌組織中ANP表達明顯增加, β/α-MHC比值明顯升高，F(xiàn)GF21siRNA處理后，ANP表達進一步增加，β/α-MHC比值進一步升高，差別具有統(tǒng)計學(xué)意義，符合光學(xué)顯微鏡下觀察到的心肌細胞肥大表現(xiàn)。實驗結(jié)果表明FGF21siRNA可促進心肌組織中ANP表達及升高β/α-MHC比值。以往的研究[10]報道高血糖引發(fā)糖尿病心肌病并且啟動一系列刺激因素進而引起心肌纖維化及膠原沉積，心肌纖維化主要表現(xiàn)為心肌膠原含量增加, 膠原類型及膠原比例發(fā)生改變, 心肌組織中主要含有Col I 和Col III。本實驗中T1DM組小鼠較正常組小鼠心肌組織中Col I、Col III表達顯著增加，F(xiàn)GF21siRNA處理后表達程度進一步增加，這與光學(xué)顯微鏡下觀察到膠原纖維增生進展表現(xiàn)一致，表明FGF21siRNA可引起心肌組織膠原纖維增生。

本實驗結(jié)果顯示: FGF21siRNA可引起心肌肥大和心肌纖維化，使心臟功能減低; 該作用可能是通過影響心肌肥大及心肌纖維化關(guān)鍵基因轉(zhuǎn)錄水平的表達實現(xiàn)的。

參考文獻：

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[4] Zhang C, Huang Z, Gu J, et al. Fibroblast growth factor 21 protects the heart from apoptosis in a diabetic mouse model via extracellular signal-regulated kinase 1/2-dependent signalling pathway [J]. Diabetologia, 2015, 58(8):1937-1948.

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Reduction of Cardiac Function Induced by FGF21siRNA in Type 1 Diabetic Mice

CHEN Cui1, MENG Zhe-ying1, ZHENG Yuan-yi1, Hu Bing1,2, SHEN E1,3
(1. Shanghai Jiaotong Univesity Affiliated No.6 Hospital, Shanghai 200233, China 2. Shanghai Institute of Ultrasound in Medicine, Shanghai 200233, China 3. Tong Ren Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine, Shanghai 200336, China)

Objective To investigate the effects of Fibroblast growth factor 21 (FGF21) siRNA on cardiac function in type 1 diabetic (T1DM) mice and explore the mechanisms of actions. Methods Sixteen C57BL/6J mice were randomly divided into, control group and FGF21siRNA control group, sixteen T1DM model mice were divided into T1DM group and T1DM + FGF21siRNA group, type 1 diabetes was induced by STZ. Cardiac function was analyzed by echocardiography, morphological changes of cardiomyocytes were observed by HE staining, collagen fiber was observed by Masson staining, the expression of α-myocin heavy chain (α-MHC), β-myocin heavy chain (β-MHC), atrial natriuretic peptide (ANP), type I collagen (Col I) and type III collagen (Col III) of myocardium were detected by Real-time PCR. Results The expression of α-MHC, β-MHC, ANP, Col I and Col III in myocardium of T1DM mice treated with FGF21siRNA were increased compared to those of untreated ones. Cardiac function, cardiomyocyte hypertrophy and collagen fiber proliferation of treated mice were worse than those of untreated ones. Conclusion FGF21siRNA may contribute to cardiac malfunction T1DM mice, which may associate with the development of myocardial hypertrophy, myocardial fibrosis.

FGF21siRNA; Type 1 diabetic (T1DM); Diabetic cardiomyopathy; Myocardial hypertrophy; Myocardial fibrosis

Q95-33

A

1674-5817(2017)01-0001-05

10.3969/j.issn.1674-5817.2017.01.001

2016-09-06

國家自然科學(xué)基金面上項目(NO.81270208)

陳 翠(1989-), 女, 臨床醫(yī)學(xué)碩士研究生。

E-mail: sjtuchencui1989@163.com

申 鍔(1968-), 女, 主任醫(yī)師, 從事糖尿病心肌病研究。E-mail: shene126@126.com