趙占強(qiáng)，周玉香，洪 濤

(1.寧夏中衛(wèi)山羊選育場(chǎng),寧夏中衛(wèi) 755006；2.寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院,寧夏銀川 7550021； 3.中衛(wèi)市沙坡頭區(qū)農(nóng)業(yè)和科技委員會(huì),寧夏中衛(wèi) 755000)

不同濃度海藻糖對(duì)牛冷凍精液品質(zhì)的影響

趙占強(qiáng)1，周玉香2，洪 濤3

(1.寧夏中衛(wèi)山羊選育場(chǎng),寧夏中衛(wèi) 755006；2.寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院,寧夏銀川 7550021； 3.中衛(wèi)市沙坡頭區(qū)農(nóng)業(yè)和科技委員會(huì),寧夏中衛(wèi) 755000)

【目的】為提高牛冷凍精液的保存效果，【方法】本試驗(yàn)在新采集的牛精液中添加其他物質(zhì)的基礎(chǔ)上添加0mol/L，0.014 mol/L ，0.028mol/L，0.042 mol/L濃度的海藻糖，比較不同濃度海藻糖對(duì)低溫保存牛精液品質(zhì)的影響。【結(jié)果】表明：在相同的保存時(shí)間下，海藻糖濃度為0.042 mol/L時(shí)，精子活力最高，精子畸形率最低，對(duì)牛冷凍精液保存效果最佳?！窘Y(jié)論】說(shuō)明海藻糖濃度在0.042mol/L時(shí)，對(duì)牛精液冷凍保存?zhèn)ψ钚　?/p>

牛精液；海藻糖；低溫保存；精液品質(zhì)

海藻糖是由兩個(gè)葡萄糖分子以α,α,1,1-糖苷鍵構(gòu)成的非還原性糖，自身性質(zhì)非常穩(wěn)定，具有獨(dú)特的生物學(xué)特性，對(duì)生物有抗脫水、抗冷凍保護(hù)作用和抗高滲保護(hù)作用，同時(shí)海藻糖還有防止淀粉老化、防止蛋白質(zhì)變性、抑制脂類物質(zhì)酸敗、抑制魚(yú)腥味的生成、矯正味道和矯正氣味、抑制大米的米糠臭、保鮮、穩(wěn)定超氧化物歧化酶和補(bǔ)充能源等功能特性[1]。

試驗(yàn)在采集的牛精液中添加其他物質(zhì)的基礎(chǔ)上,添加不同濃度的海藻糖作為冷凍保護(hù)劑，在相同存放條件下，相同存放時(shí)間內(nèi)，對(duì)比找出精子活力高，精子畸形率低的最佳濃度的海藻糖，以提高精液解凍后的活力和保護(hù)效果，從而提高受精率。

1 材料和方法

1.1 牛精液的采集

本試驗(yàn)所選取的種公牛是來(lái)自寧夏某肉牛場(chǎng)的種公牛，選擇年齡為2～3歲，健康無(wú)病，繁殖性能好的5頭西門(mén)塔爾種公牛，假陰道法采精，采精頻率每周2次。

1.2 試劑與耗材

主要試劑：果糖，Tris，海藻糖，檸檬酸，姬姆薩染色液、蒸餾水、青霉素、鏈霉素。

主要耗材：相差顯微鏡、電子天平、恒溫水浴箱、5.0 mL試管、試管架、載玻片、蓋玻片、血細(xì)胞計(jì)數(shù)器、移液槍、250 mL燒杯、100 mL量筒、玻璃棒、定性濾紙、消毒紙巾、硫酸紙、滅菌牛皮紙、5 mL注射器、在保持滲透壓不變的情況下配制不同濃度海藻糖：A組：0 mol/L為對(duì)照組，B組：0.014 mol/L，C組：0.028 mol/L，D組：0.042 mol/L。

2 具體試驗(yàn)方法[1]

2.1 精液的采集

精液用假陰道采集。向假陰道內(nèi)注入38℃左右的溫水，內(nèi)胎前三分之二處用涂抹棒均勻涂擦適量消毒凡士林潤(rùn)滑劑，并從活塞孔打氣，使假陰道有適度的壓力。將采精公牛包皮清洗干凈，采精前先讓公?？张酪淮危删珕T右手持假陰道，站在公牛右后方，當(dāng)公牛起跳，前肢爬上臺(tái)牛時(shí)，迅速向前用左手托著公牛包皮，右手持假陰道與臺(tái)牛成40度角，假陰道口斜向下方，左右手配合將公牛陰莖自然地引入假陰道內(nèi)，公牛往前一沖即完成射精動(dòng)作，公牛隨即而下，采精員右手緊握假陰道，隨公牛陰莖而下，待公牛前肢落地時(shí)，緩慢地把假陰道脫出，立即將假陰道口斜向上方，打開(kāi)活塞放氣，使精液盡快地流入集精管內(nèi)，然后小心地取下集精管，迅速送至精液處理室。

2.2 精液的稀釋與保存

采集精液進(jìn)行活力檢測(cè)，將等溫稀釋液與合格精液混合進(jìn)行稀釋；按照試驗(yàn)方案分組，并在試管上做標(biāo)記，保存在集精杯(37℃)中靜置30 min，使精子與稀釋液充分接觸，然后放入4℃冰箱，用8層紗布覆蓋在集精杯口，每隔24 h觀察1次，并記錄結(jié)果。

2.3 精子的活力檢測(cè)

將低溫保存的稀釋精液搖勻后,取中層精液10 μL在37℃恒溫板上等溫預(yù)熱的載玻片上滴片,蓋上蓋玻片后置于配有37℃恒溫臺(tái)的顯微鏡下放大400倍檢查200個(gè)以上精子,分別統(tǒng)計(jì)呈直線運(yùn)動(dòng)的精子數(shù)占精子總數(shù),計(jì)算精子活力。活力評(píng)定一般采用十級(jí)評(píng)分法，即按呈前進(jìn)運(yùn)動(dòng)的精子所占百分率分別評(píng)為1.0、0.9、0.8……0等10個(gè)等級(jí)，若無(wú)前進(jìn)運(yùn)動(dòng)的精子，則以“0”表示之。例如“0 .8”就表示呈前進(jìn)運(yùn)動(dòng)的精子數(shù)占總精子數(shù)的80%?！?.0”則表示100%的精子呈前進(jìn)運(yùn)動(dòng)。

2.4 精子畸形率的的檢測(cè)

將低溫保存好的精液取出解凍后，滴一滴于載玻片一端，用另一邊緣光滑的載玻片將樣品均勻地涂于載玻片上，每一樣品制作兩個(gè)抹片。自然晾干后，用中性福爾馬林固定15 min，水洗后吹干或晾干，用姬姆薩染色液染色1.5 h，清水漂洗后晾干。在顯微鏡(400～600倍)下，每個(gè)抹片觀察200個(gè)以上精子(分左、右二個(gè)區(qū))，按下面公式計(jì)算精子畸形率。

A=Al÷S×100

其中A：畸形率即頂體完整率，A1：畸形精子數(shù)；S：精子總數(shù)

2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SAS8.2軟件包進(jìn)行方差分析，試驗(yàn)結(jié)果以±SD表示，并采用t檢驗(yàn)檢驗(yàn)其差異顯著性[2]。

3 結(jié)果與分析

由表1可知 ，在相同條件，相同保存時(shí)間下，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，各組精子的活力都呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，96 h前，A、B、C、D四組精子活力下降不明顯，差異不顯著(P>0.05)；144 h時(shí)，A、B、C、D四組精子活力下降明顯，A組精子活力下降最快，D組精子活力下降最慢，C組與A組差異顯著(P<0.05)。由表2可知，同一保存時(shí)間下，添加不同濃度的海藻糖，D組的精子畸形率最低，D組與A、B、C組精子畸形率比較差異顯著(P<0.05)，而A、B、C組間的精子畸形率差異不顯著(P>0.05)。

注：同列數(shù)字肩上有相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，有不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

表2 各組精液精子在相同保存時(shí)間下畸形率情況

注：同行數(shù)字肩上有相同字母表示差異不顯著，有不同字母表示差異顯著。

4 小結(jié)與討論

評(píng)定精子品質(zhì)的指標(biāo)較多，活力反映精子直線前進(jìn)運(yùn)動(dòng)的能力，活力與精子的運(yùn)動(dòng)能力密切相關(guān)，在獲能、頂體反應(yīng)和受精過(guò)程中，精子膜必須具有生化活性。若精子質(zhì)膜受到損傷，則直接導(dǎo)致精子活力和受精能力下降[3]。本試驗(yàn)采用測(cè)定精子活力和畸形率來(lái)研究牛精子的品質(zhì)，從結(jié)果可以看出，在低溫保存條件下稀釋液中添加適當(dāng)濃度海藻糖，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，可以有效的提高精子的活力，并降低精子的畸形率，與不添加海藻糖的對(duì)照組差異顯著。

4.1 海藻糖對(duì)低溫保存精液活力的影響

張樹(shù)山等研究發(fā)現(xiàn)在豬的冷凍稀釋液中添加海藻糖可提高凍后精子的活率、頂體完整率、膜功能的完整率等指標(biāo)[4]。海藻糖在高溫、高寒、高滲透壓及干燥失水等惡劣環(huán)境條件下在細(xì)胞表面能形成獨(dú)特的保護(hù)膜，有效地保護(hù)蛋白質(zhì)分子不變性失活，從而維持生命體的生命過(guò)程和生物特征。本試驗(yàn)中，添加不同濃度的海藻糖在24 h、48 h、72 h、96 h時(shí)差異不顯著(P>0.05)。在144h時(shí)差異顯著(P<0.05)。表明隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)，海藻糖的特性就發(fā)揮的越好，特別是添加0.042 mol/L時(shí)精子的存活力差異就越顯著。

4.2 海藻糖對(duì)低溫保存精液畸形率的影響

Molinia[5]等研究表明，在稀釋液中沒(méi)有甘油存在的情況下，蔗糖或海藻糖的存在使綿羊精子解凍后的活率比葡萄糖存在時(shí)高，說(shuō)明二糖具有冷凍保護(hù)作用。據(jù)報(bào)道綿羊精液中添加 0.2 mol/L 海藻糖經(jīng)冷凍解凍后可顯著地降低畸形率[6]。試驗(yàn)中的結(jié)果顯示，在精液中添加0.042 mol/L的海藻糖對(duì)精子畸形率的影響明顯的低于其他三組，并且差異顯著。表明冷凍精液稀釋液中添加0.042 mol/L的海藻糖可有效使精子的畸形率下降。

[1] 桑潤(rùn)滋編.動(dòng)物繁殖生物技術(shù)[M].中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社,2002.

[2] 貴州農(nóng)學(xué)院主編.生物統(tǒng)計(jì)附試驗(yàn)設(shè)計(jì)[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，1999.

[3] 胡建宏,李青旺,江中良,海藻糖對(duì)豬精液冷凍保存效果的影響[J]畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào),2006, 37(12):12-18.

[4] 張樹(shù)山，李青旺，李剛等.海藻糖、蔗糖和乳糖對(duì)豬精液冷凍保護(hù)效果的影響[J], 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào),2006,34(6):41-45.

[5] Molinia FC, Evans G, Casares PI, Maxwell WMC. Effect of monosaccharides and disaceliaridesin Tris-based diluents on motility ,acrosome integrity and fertility of pellet frozen ram spermatozoa[J]. Anim Reprod Sci, 1994,36:13-22.

[6] 徐振軍,車世德,趙冰等. 絨山羊精液低溫保存技術(shù)研究[J], 黑龍江畜牧獸醫(yī)， 2009,52(10):29-30.

Effect of Different Concentrations of Trehalose on Cattle Frozen Semen

ZHAO Zhan-qiang1, ZHOU Yu-xiang2, HONG Tao3

(1.Goatbreedingfarmofzhogwei,zhongwei,Gansu, 755006; 2.Agriculturalcollege,NingxiaUniversity,Yinchuan,Gansu, 7550021)

:【Objective】To improve the preservation results of cattle frozen semen 【Method】 The experiment added the trehalose of different concentration (0 mol/L, 0.014 mol/L, 0.028mol/L, 0.042 mol/L) into the new collected cattle semen with the basis of other additives in order to compare the effect of different concentrations of trehalose on cattle frozen semen 【Result】Under the same preservation time, when the concentration of trehalose was 0.042 mol/L, sperm motility was the highest and sperm abnormality rate was the lowest, and the preservation effect of cattle frozen semen was the best 【Conclusion】Our study illustrated that the harm for the preservation of cattle frozen semen could be minimized when the concentration of trehalose is 0.042mol/L.

cattle semen; trehalose; cryopreservation; semen quality

2016-11-17 接收日期:2016-12-05

趙占強(qiáng)(1985-)，男，漢，寧夏銀川人，本科，專業(yè)：動(dòng)物醫(yī)學(xué)，從事工作：中衛(wèi)山羊的品種保護(hù)。

S823.2

A

1001-9111(2017)01-0023-03