武慧+宋明霞+寧思淇+武翠玲+周曉馥

摘要：抗菌肽是機(jī)體先天免疫的重要組成成分，是許多生物體抵抗外來致病菌侵襲的第1道屏障。Indolicidin是一個13氨基酸殘基肽，從牛的嗜中性粒細(xì)胞的胞漿小顆粒分離而來，具有廣譜抗菌性，Rev4是其人工設(shè)計的反向序列。利用經(jīng)典葉盤法，以根癌農(nóng)桿菌A.GV3850介導(dǎo)紫花苜蓿遺傳轉(zhuǎn)化，GUS瞬時表達(dá)檢測轉(zhuǎn)化體系建立成功；壓力篩選后葉片基因組DNA的PCR成功檢測到抗菌肽基因條帶，PCR產(chǎn)物回收測序得到13株轉(zhuǎn)化紫花苜蓿。

關(guān)鍵詞：紫花苜蓿；抗菌肽；遺傳轉(zhuǎn)化

中圖分類號： Q785文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2017）07-0044-03

紫花苜蓿（Medicago sativa L.）為四倍體異花授粉的多年生草本植物，屬于豆科苜蓿屬，基因組大，是很好的水土保持植物與綠肥植物，在世界范圍內(nèi)廣泛種植，以“牧草之王”著稱[1]。長期以來，人們圍繞經(jīng)濟(jì)有效地提高紫花苜蓿產(chǎn)量和品質(zhì)兩大目標(biāo)進(jìn)行了不懈的努力[2-3]，但由于傳統(tǒng)的紫花苜蓿育種方法時間長、成本高且可利用的種質(zhì)資源有限，基因工程的方法更具有科學(xué)性和準(zhǔn)確性[4]。

抗菌肽（antimicrobial peptides，AMPs）是生物體天然免疫的重要組成部分，是機(jī)體抵御外源致病菌的第1道屏障，由于其獨特且多樣的生物學(xué)功能和作用機(jī)制，引起了科學(xué)界的廣泛關(guān)注和研究[5]?？咕氖亲匀贿M(jìn)化的產(chǎn)物，它可以干擾病原微生物，使其細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，通透性增加，進(jìn)而起到殺菌作用，又因病原體不易對其產(chǎn)生抗藥性，因此成為新型高效的抗生素替代品[6]。目前，人們一方面研究抗菌肽在先天免疫中發(fā)揮作用的機(jī)制，一方面設(shè)計新型抗菌、抗感染的抗菌肽制劑[7]，抗菌肽研究前景非常廣闊。

Indolicidin是一個13殘基肽（IL-PWKWPWWPWRR-NH2），從牛的嗜中性粒細(xì)胞的胞漿小顆粒分離而來，具有廣譜的抗菌和抗病毒活性[8]。針對外源抗菌肽基因轉(zhuǎn)入植物體內(nèi)容易被消化分解的不足，有人設(shè)計了抗菌肽Indolicidin的反向序列Rev4，合成的反向肽仍然有高的抗菌活性，且相比其他的抗菌肽，對植物蛋白酶的穩(wěn)定性更高[9]。本研究利用經(jīng)典葉盤法，以根癌農(nóng)桿菌A.GV3850介導(dǎo)紫花苜蓿遺傳轉(zhuǎn)化，GUS瞬時表達(dá)檢測轉(zhuǎn)化體系建立成功；壓力篩選后葉片基因組DNA的PCR成功檢測到抗菌肽基因條帶，PCR產(chǎn)物回收測序得到13株轉(zhuǎn)化紫花苜蓿。本研究提高紫花苜蓿自身抗病性，紫花苜蓿作為綠色飼料具有重大的生態(tài)和社會效益。

1材料與方法

1.1植物材料

供試紫花苜蓿種子為吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院惠贈，吉林師范大學(xué)資源科學(xué)與綠色生產(chǎn)吉林省重點實驗室保存。

1.2菌種和質(zhì)粒

根癌農(nóng)桿菌菌株A.GV3850-pKLP36.PcRIL（149）的pKLP36質(zhì)粒上含有抗菌肽基因，根癌農(nóng)桿菌 A.GV3850-PKYLX35S2（194）中含有g(shù)us基因。以上2種菌株均由美國邁阿密大學(xué)惠贈。

1.3PCR擴(kuò)增引物序列

以Primer 5.0軟件設(shè)計正向引物AnF和反向引物AnR。具體序列如下：AnF：5′-CACGAAGCTTACCATGGGATTTTTTCTCTTTTCAC-3′；AnR：5′-GACTGGAGCTCTTAAATAAGAGGCCATTTC-3′。

1.4試驗試劑

GUS染色液，F(xiàn)AA固定液，離心柱瓊脂糖凝膠回收試劑盒，Premix Ex Taq Version 2.0為TaKaRa公司產(chǎn)品，低熔點瓊脂糖為Sigma公司產(chǎn)品，X-Gluc、5-溴-4-氯-3-吲哚半乳糖苷（X-gal）試劑、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）為BBI公司產(chǎn)品，其他國產(chǎn)試劑購自北京鼎國生物公司。

1.5主要儀器設(shè)備

德國QIAGEN高通量組織研磨儀，美國Quawell超微量紫外分光光度計（UV-Vis Spectrophotometer Q5000），HC-2518R高速冷凍離心機(jī)，紫外凝膠電泳成像系統(tǒng)，Agilent溫度梯度PCR擴(kuò)增儀，Nikon熒光體式顯微鏡等。

1.6試驗方法

1.6.1根癌農(nóng)桿菌A.GV3850介導(dǎo)的苜蓿遺傳轉(zhuǎn)化將苜蓿組培苗葉片預(yù)培養(yǎng)3 d后，分別轉(zhuǎn)入D600 nm為0.5的根癌農(nóng)桿菌149和194菌液中，26 ℃、166 r/min振蕩培養(yǎng) 15 min；倒掉菌液，無菌水沖洗3次，置于共培養(yǎng)培養(yǎng)基，25 ℃黑暗條件下，共培養(yǎng)3 d。

葉片轉(zhuǎn)接到Kan壓力篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)30 d，獲得抗性植株；待抗性植株長到2～3 cm，切段后置于1/2 MS培養(yǎng)基中擴(kuò)繁，智能人工氣候箱中培養(yǎng)。

1.6.2轉(zhuǎn)化植株的GUS表達(dá)檢測取194侵染后5 d的轉(zhuǎn)化葉片制成徒手切片，非轉(zhuǎn)化植株葉片作為對照；取1 mL染色液放入2 mL 離心管中，將準(zhǔn)備好的葉片浸泡在染液中，抽真空5 min，37 ℃過夜；取出染液，加入800 μL FAA固定液，顛倒混勻，倒掉，重復(fù)2次；依次加入30%、75%、95%乙醇，進(jìn)行脫色，至陰性對照呈黃白色，倒掉95%乙醇，加入FAA固定液；壓片后以Nikon熒光體式顯微鏡觀察并采集圖像。

1.6.3轉(zhuǎn)化植株的PCR分子檢測取149轉(zhuǎn)化的苜蓿葉片，研磨后加入250 μL CTAB提取緩沖液（2% CTAB，100 mmol/L Tris-HCl pH值為8.0，20 mmol/L EDTA，1.4 mol/L NaCl，3% PVP）和10 μL β-巰基乙醇，65 ℃溫??；加入體積比為25 ∶24 ∶1的酚、三氯甲烷、異戊醇，混勻后 4 ℃、12 000 r/min離心10 min；取上清，無水乙醇醇沉1 h后離心30 min，75%乙醇洗滌沉淀2次；水酶混合液消化RNA；瓊脂糖凝膠電泳檢測。

PCR反應(yīng)為25 μL體系，其中含12.5 μL Premix Ex Taq，正向引物AnF 1 μL，反向引物AnR 1 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O 9.5 μL；PCR程序：94 ℃ 10 min；94 ℃ 1 min，58 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min。

1.6.4PCR產(chǎn)物測序?qū)﹃栃再|(zhì)粒PCR產(chǎn)物和68個呈陽性的PCR產(chǎn)物進(jìn)行切膠回收，送至北京六合華大基因科技有限公司進(jìn)行測序。

2結(jié)果與分析

2.1轉(zhuǎn)化植株的Gus表達(dá)檢測

通過GUS組織化學(xué)定位法，對根癌農(nóng)桿菌194菌液侵染的苜蓿組培苗葉片進(jìn)行GUS瞬時表達(dá)檢測，轉(zhuǎn)化植株的GUS瞬時表達(dá)呈現(xiàn)出藍(lán)色斑點（圖1-B），而對照葉片無藍(lán)色斑點（圖1-A），初步證明轉(zhuǎn)化體系的成功建立。

2.2轉(zhuǎn)化植株的分子鑒定

本研究利用CTAB法分別提取對照和轉(zhuǎn)化苜蓿組培苗的基因組DNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖2-A所示，原種與轉(zhuǎn)化種苜?；蚪MDNA都較完整、濃度大、無脫尾。根癌農(nóng)桿菌菌株149的pKLP36質(zhì)粒上含有抗菌肽基因，包括煙草中PR-1b部分編碼區(qū)及抗菌肽基因RIL，長約 200 bp；根據(jù)圖2-B可知，陽性質(zhì)粒PCR產(chǎn)物（泳道1）在 100～250 bp 處有條帶，紫花苜蓿原種基因組DNA的PCR產(chǎn)物（泳道2）無目標(biāo)條帶，而轉(zhuǎn)化植株基因組DNA的PCR產(chǎn)物有較為清晰的目標(biāo)條帶（泳道3）。

2.3PCR產(chǎn)物測序

對陽性質(zhì)粒及PCR呈陽性的產(chǎn)物進(jìn)行回收后測序，發(fā)現(xiàn)測序片段與149質(zhì)粒對比結(jié)果一致，信號值基本在正常范圍內(nèi)，即150～500，測序片段質(zhì)量較高，峰圖噪音較低，模板純度較高。由圖3可知，149質(zhì)粒和13個樣品PR-1b編碼區(qū)部分基因以及抗菌肽基因RIL區(qū)段均無突變堿基，即測序成功。

3討論

3.1利用GUS瞬時表達(dá)檢測轉(zhuǎn)化體系

Jefferson等首次提出β-葡糖苷酸基因GUS可作為植物遺傳轉(zhuǎn)化的報告基因之后，在許多國家都得到了廣泛應(yīng)用，其方法操作簡單，靈敏度高，在基因工程領(lǐng)域得到廣泛地應(yīng)用?？梢杂糜谒矔r表達(dá)檢測的報告基因還有綠色熒光蛋白基因（greenfluorescent protein，GFP），但由于有些植物組織中有自發(fā)熒光，會影響GFP檢測的準(zhǔn)確性，產(chǎn)生弱熒光背景，檢測弱啟動子驅(qū)動的GFP活性較難，致使轉(zhuǎn)基因植物的篩選受到限制[10]。GUS酶有產(chǎn)物的放大作用，可以通過GUS染色來進(jìn)行檢測，而未轉(zhuǎn)化植株無GUS活性，因此GUS瞬時表達(dá)檢測對遺傳轉(zhuǎn)化的檢測更加簡便、可靠[11]。因此，GUS是目前轉(zhuǎn)基因植物中應(yīng)用最為廣泛的報道基因。關(guān)于植物葉片的脫色問題，Bowling等通過30%、75%、95%對擬南芥進(jìn)行脫色，結(jié)果對照呈白色，脫色效果好[12]。因此，本試驗中脫色步驟借鑒此方法，且脫色效果很好，便于結(jié)果觀察。

3.2改良的CTAB法提取苜?；蚪MDNA

苜蓿葉片中常含有糖類等物質(zhì)，使其基因組DNA的提取受限。試驗結(jié)果表明：經(jīng)典的CTAB提取緩沖液法最大的優(yōu)點是能除去多糖，可用于草本植物基因組DNA提取。本研究在傳統(tǒng)CTAB法的基礎(chǔ)上加入了PVP，可以有效地裂解植物組織細(xì)胞，保證核酸完整性。同時，PVP可以與酚類產(chǎn)生絡(luò)合物，防止多酚對DNA的污染，還可與多糖結(jié)合，除去糖類物質(zhì)。此外，加入抗氧化劑β-巰基乙醇，可有效地防止酚氧化成醌，避免褐變，使酚容易去除。利用改良法提取的苜?；蚪MDNA完整性好、亮度高、濃度較大，可滿足PCR檢測要求。

3.3抗菌肽基因的遺傳轉(zhuǎn)化前景

抗菌肽分子較小，動物源抗菌肽在植物體內(nèi)易被蛋白酶快速降解，成為外原抗菌肽在植物體內(nèi)表達(dá)的限制因素。但在作物中表達(dá)動物源與植物源的肽是可能的，可通過消除蛋白酶敏感位點來修飾肽，或設(shè)計反向類似物，從而實現(xiàn)對病原抗性的提高[13]。Xing等采用來自異源物種中的肽來抵抗植物病原，研究了來自動物源的肽，篩選了肽對植物蛋白酶的敏感性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，基于反向序列的肽擁有特別強(qiáng)的對植物葉片中蛋白酶的抵抗能，并同時擁有抗菌活性[14]。本研究以根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)抗菌肽基因Rev4的遺傳轉(zhuǎn)化并獲得成功，轉(zhuǎn)化植株作為綠色飼料具有重大的生態(tài)和社會效益。

參考文獻(xiàn)：

[1] Samac D A，Bucciarelli B，Miller S S，et al. Transgene silencing of sucrose synthase in alfalfa （Medicago sativa L.） stem vascular tissue suggests a role for invertase in cell wall cellulose synthesis[J]. BMC Plant Biology，2015，15（1）： 283.

[2]Aung B，Gruber M，Amyot L，et al. MicroRNA156 as a promising tool for alfalfa improvement[J]. Plant Biotechnology Journal，2015，13（6）： 779-790.

[3]Zhang Y M，Liu Z H，Wen Z Y，et al. The vacuolar Na+-H+ antiport gene TaNHX2 confers salt tolerance on transgenic alfalfa （Medicago sativa）[J]. Functional Plant Biology，2012，39（8）： 708-716.

[4]Zhang Y，Zhang H，Liu Z，et al. The wheat NHX antiporter gene TaNHX2 confers salt tolerance in transgenic alfalfa by increasing the retention capacity of intracellular potassium[J]. Plant Molecular Biology，2015，87（3）： 317-327.

[5] Anupa G，Bhat M A，Srivastava A K，et al. Cationic antimicrobial peptide，magainin down-regulates secretion of pro-inflammatory cytokines by early placental cytotrophoblasts[J]. Reproductive Biology and Endocrinology，2015，13（1）： 121.

[6]Urfer M，Bogdanovic J，Lo Monte F，et al. A peptidomimetic antibiotic targets outer membrane proteins and disrupts selectively the outer membrane in escherichia coli[J]. The Journal of Biological Chemistry，2016，291（4）： 1921-1932.

[7]Chou S，Shao C，Wang J，et al. Short，multiple-stranded β-hairpin peptides have antimicrobial potency with high selectivity and salt resistance[J]. Acta Biomaterialia，2016，30： 78-93.

[8]Selsted M，Novotny M，Morris W，et al. Indolicidin，a novel bactericidal tridecapeptide amide from neutrophils[J]. The Journal of Biological Chemistry，1992，267（7）： 4292-4295.

[9]Li Q，Lawrence C B，Davies H M，et al. A tridecapeptide possesses both antimicrobial and protease-inhibitory activities[J]. Peptides，2002，23（1）： 1-6.

[10]Zhang Q，Walawage S，Tricoli D，et al. A red fluorescent protein （DsRED） from Discosoma sp. as a reporter for gene expression in walnut somatic embryos[J]. Plant Cell Reports，2015，34（5）： 861-869.

[11]Liu X，Lang S，Su L，et al. Improved agrobacterium-mediated transformation and high efficiency of root formation from hypocotyl meristem of spring Brassica napus ‘Precocity cultivar[J]. Genetics and Molecular Research，2015，14（4）： 16840-16855.

[12]Bowling S，Guo A，Cao H，et al. A mutation in Arabidopsis that leads to constitutive expression of systemic acquired resistance[J]. The Plant Cell，1994，6（12）： 1845-1857.

[13]Anantharaman A，Sahal D. Reverse engineering truncations of an antimicrobial peptide dimer to identify the origins of potency and broad spectrum of action[J]. Journal of Medicinal Chemistry，2010，53（16）： 6079-6088.

[14]Xing H，Lawrence C，Chambers O，et al. Increased pathogen resistance and yield in transgenic plants expressing combinations of the modified antimicrobial peptides based on indolicidin and magainin[J]. Planta，2006，223（5）： 1024-1032.