盧希陽(yáng),陶 妍

上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院,上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心,上海 201306

三疣梭子蟹PtCrustin3成熟肽在畢赤酵母中的重組DNA表達(dá)

盧希陽(yáng),陶 妍*

上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院,上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心,上海 201306

Crustin抗菌肽是一類由甲殼動(dòng)物表達(dá)的具有抗菌作用的小分子肽，它們?cè)趧?dòng)物抵御病原微生物侵染的免疫系統(tǒng)中發(fā)揮了重要作用，被認(rèn)為是替代抗生素的良好候選者。Crustin的N端含有一個(gè)信號(hào)序列，與之相連接的C端為成熟肽序列，內(nèi)含一個(gè)WAP（Whey acidic protein）結(jié)構(gòu)域，為Crustin的活性區(qū)域；根據(jù)信號(hào)肽與WAP結(jié)構(gòu)域之間的結(jié)構(gòu)差異，可以將Crustin分為三種類型。本文以三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）I型Crustin的一個(gè)同工型“PtCrustin3”的成熟肽（mPtCrustin3）為研究對(duì)象，通過(guò)RT-PCR從鰓中克隆到編碼mPtCrustin3的cDNA，并通過(guò)巢式PCR對(duì)其添加EcoRⅠ和XbaⅠ酶切位點(diǎn)以及6×His標(biāo)簽。以pPICZαA為真核表達(dá)載體，成功構(gòu)建了重組表達(dá)載體pPICZαA-mPtCrustin3，電轉(zhuǎn)入畢赤酵母X-33，在29℃、250 r/m的條件下，經(jīng)1.0%甲醇誘導(dǎo)表達(dá)96 h后，獲得的表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)Tricine-SDS-PAGE分析，證明分子量約為11.6 kD的重組體mPtCrustin3在畢赤酵母X-33中被成功表達(dá)。

三疣梭子蟹;RT-PCR;PtCrustin3成熟肽;畢赤酵母;重組表達(dá)

Relf等[1]首次從普通濱蟹（Carcinus maenas）血細(xì)胞中分離到Crustin抗菌肽，其分子量為11.5 kD、富含脯氨酸和半胱氨酸。Crustin的N端含有一個(gè)信號(hào)序列，與之相連接的C端為成熟肽序列，內(nèi)含一個(gè)WAP（Whey acidic protein）結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域包含8個(gè)保守的半胱氨酸殘基，形成一個(gè)含有4個(gè)二硫鍵的緊密包裹結(jié)構(gòu)，是Crustin的主要功能域[2]。Smith等[3]根據(jù)Crustin信號(hào)肽與WAP結(jié)構(gòu)域之間的結(jié)構(gòu)差異，將Crustin分為三種類型。I型Crustin：主要存在于蟹類、螯蝦和龍蝦等甲殼動(dòng)物中，在信號(hào)肽與WAP結(jié)構(gòu)域之間存在一個(gè)序列長(zhǎng)度多變、富含半胱氨酸殘基的結(jié)構(gòu)域；II型Crustin：主要存在于對(duì)蝦中，在信號(hào)肽與WAP結(jié)構(gòu)域之間不僅富含半胱氨酸，還富含甘氨酸；III型Crustin：在信號(hào)肽與WAP結(jié)構(gòu)域之間既沒(méi)有半胱氨酸殘基也沒(méi)有甘氨酸殘基，故被稱為SWD(Single-whey domain)蛋白，亦或Antileukoproteinase-like蛋白或者Chelonianin-like蛋白。抑菌實(shí)驗(yàn)表明，Crustins除了對(duì)微球菌屬、氣球菌屬、動(dòng)性球菌屬、葡萄球菌屬、鏈球菌屬、棒狀桿菌屬和芽孢桿菌屬等革蘭氏陽(yáng)性菌有抑菌活性外[1,4?6]，還對(duì)銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）等革蘭氏陰性菌有不同程度的抑菌活性[7]。

2013年，Cui等[7]從三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）的鰓和眼柄中分離到編碼I型Crustin的三種同工型基因（PtCrustin1、PtCrustin2、PtCrustin3），并對(duì)其中的PtCrustin3成熟肽基因進(jìn)行了大腸桿菌原核表達(dá)，獲得的重組體PtCrustin3成熟肽顯示了一定的抑菌作用。然而，原核表達(dá)系統(tǒng)存在無(wú)翻譯后折疊修飾功能、易在細(xì)胞內(nèi)形成包涵體等眾所周知的缺點(diǎn)[8]，且不適合大規(guī)模制備。相比之下，畢赤酵母（Pichia pastoris）表達(dá)系統(tǒng)能高效表達(dá)外源蛋白、表達(dá)穩(wěn)定性高，并具有翻譯后修飾功能，有利于獲得具生物學(xué)活性的重組蛋白，并適合擴(kuò)大制備[9]。據(jù)此，本研究以三疣梭子蟹I型Crustin的PtCrustin3成熟肽（mPtCrustin3）為研究對(duì)象，旨在初步建立基于畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的mPtCrustin3的重組DNA表達(dá)方法，為進(jìn)一步擴(kuò)大制備和對(duì)其生物學(xué)功能的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

三疣梭子蟹（400 g）購(gòu)自上海蘆潮港海鮮市場(chǎng)。畢赤酵母X-33菌株及表達(dá)載體pPICZαA為Invitrogen公司（美國(guó)）產(chǎn)品；大腸桿菌DH5α為本實(shí)驗(yàn)室保存；限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、XbaⅠ、SacⅠ和T4 DNA連接酶以及克隆質(zhì)粒pMD-19T simple購(gòu)自TaKaRa公司(日本)。胰蛋白胨、酵母粉為OXOID公司(英國(guó))產(chǎn)品。博來(lái)霉素為Invitrogen公司(美國(guó))產(chǎn)品；DNA回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、酵母DNA提取試劑盒、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)、蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)和PCR反應(yīng)試劑均購(gòu)自天根生化科技有限公司(北京)。引物合成由上海生工生物工程有限公司完成。其他試劑為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

1.2 總RNA提取和第一鏈cDNA合成

三疣梭子蟹運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室后，取其眼柄和鰓快速置于液氮中凍結(jié)，按照RNAiso Plus說(shuō)明書(shū)提取總RNA。第一鏈cDNA的合成按照Prime Script試劑盒(TaKaRa)操作：總RNA 6 μL、Oligo(dT)Primer (50 μmol/L)1 μL、dNTP Mixture(10 mmol/L each)1 μL、ddH2O 2 μL混勻，65℃保溫5 min，冰上迅速冷卻；依次加入5×Buffer 4 μL、RNase inhibitor(40 U/μL)0.5 μL、Prime Script RTase(200U/)1 μL (200 U)、RNase Free dH2O 4.5 μL，緩慢混勻后42℃保溫30～60 min；95℃保溫5 min，冰上冷卻后得到第一鏈cDNA。

1.3 含限制性酶切位點(diǎn)的mPtCrustin3基因的PCR擴(kuò)增

圖1 通過(guò)PCR擴(kuò)增目的基因的策略圖Fig.1 Strategic map for PCR amplification of target gene

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

PCR策略如圖1所示，參考PtCrustin3的cDNA序列（GenBank注冊(cè)號(hào)：JQ728424）設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物F1和R1（表1），以第一鏈cDNA為模板進(jìn)行第一次PCR，反應(yīng)體系和條件為：上下游引物(10 mol/L)各0.8 L、10×Buffer 2.0 L、dNTP(2.5 mmol/L)1.6 L、Taq DNA聚合酶(2.5 U/L)0.2 L、DNA模板0.5 L，加無(wú)菌水至20 L；94℃預(yù)變性3 min、94℃變性30 s、退火（56.5℃）30 s、72℃延伸1 min，最終72℃延伸5 min，30個(gè)循環(huán)。以第一次PCR產(chǎn)物為模板，設(shè)計(jì)含EcoRⅠ酶切位點(diǎn)的前引物F2和含6×His標(biāo)簽的后引物R2（表1）進(jìn)行第二次PCR，反應(yīng)體系和條件同第一次PCR，除了退火溫度改為56℃；再以第二次PCR產(chǎn)物為模板，設(shè)計(jì)含XbaⅠ酶切位點(diǎn)的后引物R3（表1），采用F2與R3進(jìn)行第三次PCR，反應(yīng)體系和條件同第一次PCR，除了退火溫度改為57.9℃。第三次PCR產(chǎn)物經(jīng)割膠純化后與pMD-19T質(zhì)粒連接得到重組質(zhì)粒pMD-19T-mPtCrustin3，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，37℃培養(yǎng)過(guò)夜，挑1個(gè)陽(yáng)性克隆由上海生工生物工程有限公司測(cè)序。

1.4 Crustin氨基酸序列的多重比對(duì)及分子系統(tǒng)樹(shù)的構(gòu)建

使用DNAMAN6.0對(duì)Crustin全長(zhǎng)氨基酸序列進(jìn)行多重比對(duì)，各序列來(lái)自NCBI網(wǎng)站，序列號(hào)分別為：PtCrustin3（GenBank登錄號(hào):AFU61580.1）、美洲螯龍蝦（Homarus americanus,GenBank登錄號(hào):ABM92333.1）、眼斑龍蝦（Panulirus argus,GenBank登錄號(hào):AAQ15293.1）、歐洲龍蝦（Homarus gammarus,GenBank登錄號(hào):CAH10349.1）、遠(yuǎn)海梭子蟹（Portunus pelagicus1,GenBank登錄號(hào):ABM65762.1;Portunus pelagicus2,GenBank登錄號(hào):AFN37210.1）、羅氏沼蝦（Macrobrachium rosenbergii,GenBank登錄號(hào):ACL15396.1）、日本囊對(duì)蝦（Marsupenaeus japonicas,GenBank登錄號(hào):AME17866.1）、紫螯青蟹（Scylla tranquebarica1,GenBank登錄號(hào):AGU01540.1;Scylla tranquebarica2,GenBank登錄號(hào):AFI56572.1）、挪威海螯蝦（Nephrops norvegicus,GenBank登錄號(hào):CCE46014.1）、日本仿長(zhǎng)額蝦（Pandalopsis japonica1,GenBank登錄號(hào):AFN80342.1;Pandalopsis japonica2,GenBank登錄號(hào):AGU01543.1）。分子系統(tǒng)樹(shù)根據(jù)上述生物Crustin全長(zhǎng)的氨基酸序列構(gòu)建，采用MEGA6.0鄰位相聯(lián)法，各結(jié)點(diǎn)的置信度由自引導(dǎo)值估計(jì)，重復(fù)次數(shù)為1000。

1.5 重組表達(dá)載體pPICZαA-mPtCrustin3的構(gòu)建及電轉(zhuǎn)化畢赤酵母X-33

采用EcoRⅠ和XbaⅠ對(duì)測(cè)序無(wú)誤的pMD-19T-mPtCrustin3進(jìn)行雙酶切，將獲得的目的片段mPtCrustin3與經(jīng)相同酶處理過(guò)的表達(dá)載體pPICZαA混合，在T4 DNA連接酶作用下，16℃反應(yīng)過(guò)夜；轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α后，37℃培養(yǎng)過(guò)夜；通過(guò)菌落PCR、雙酶切和DNA測(cè)序鑒定重組表達(dá)載體pPICZαA-mPtCrustin3。采用SacⅠ對(duì)其酶切后，以1:8(V/V)與畢赤酵母X-33感受態(tài)細(xì)胞混合，轉(zhuǎn)入預(yù)冷的0.2 cm電轉(zhuǎn)杯中，冰浴5 min，1.5 kV、25 F、200 Ω，電擊5 ms，立即加入1 mL預(yù)冷的1 mol/L的山梨醇，離心后菌體涂布于含100 μg/mL博來(lái)霉素的YPDS平板(1%酵母提取物、2%胰蛋白胨、2%D(+)葡萄糖、1 mol/L山梨醇、2%瓊脂)，30℃培養(yǎng)72 h至單克隆產(chǎn)生。

1.6 甲醇利用快速型酵母轉(zhuǎn)化子的篩選和鑒定

挑取10個(gè)單菌落分別接種至MM平板(1.34%YNB、0.4 mg/L生物素、5 mL/L甲醇、15 g/L瓊脂)和MD平板（1.34%YNB（Yeast Nitrogen Base without Amino Acids）、0.4 mg/L生物素、20 g/L葡萄糖、15 g/L瓊脂）上，篩選甲醇利用快速型轉(zhuǎn)化子。對(duì)篩選到的酵母轉(zhuǎn)化子提取基因組DNA，以此為模板，采用pPICZαA的通用引物5'AOX1和3'AOX1進(jìn)行PCR鑒定。

1.7 mPtCrustin3的誘導(dǎo)表達(dá)及Tricine-SDS-PAGE

挑取經(jīng)鑒定無(wú)誤的酵母轉(zhuǎn)化子接種于25 mL BMGY培養(yǎng)基(1.34%YNB、0.4 mg/L生物素、1%甘油、100 mmol/L磷酸鉀緩沖液,pH 6.0)中，29℃、250 r/min培養(yǎng)至OD600為3.0-6.0；離心（5000 r/min）收集菌體，重懸于100 mL BMMY培養(yǎng)基(配方同BMGY培養(yǎng)基，除了1%甲醇取代甘油)中，調(diào)OD600至1.0，30℃、250 r/min培養(yǎng)96 h，每隔24 h補(bǔ)加甲醇至總體積的1.0%；收集發(fā)酵培養(yǎng)液用作Tricine-SDS-PAGE分析，濃縮膠濃度4%，夾層膠濃度10%，分離膠濃度16.5%，超低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)由中科瑞泰(北京)生物科技有限公司提供。

2 結(jié)果

2.1 通過(guò)PCR擴(kuò)增含酶切位點(diǎn)的mPtCrustin3基因

第一次PCR擴(kuò)增到一個(gè)557 bp長(zhǎng)度的片段(圖2-A)，該片段應(yīng)編碼PtCrustin3前體肽（由N端的信號(hào)肽和C端的成熟肽組成），并含部分5’和3’非編碼區(qū)；以此片段為模板，第二次PCR擴(kuò)增到一個(gè)306 bp的片段（圖2-B），該片段應(yīng)編碼PtCrustin3的成熟肽（mPtCrustin3），其5’端和3’端應(yīng)分別含EcoRⅠ酶切位點(diǎn)和6×His標(biāo)簽；以此片段為模板，第三次PCR擴(kuò)增到一個(gè)315 bp的片段(圖2C)，該片段的3’端應(yīng)含XbaⅠ酶切位點(diǎn)。最后一次PCR產(chǎn)物經(jīng)克隆進(jìn)pMD-19T質(zhì)粒和DNA測(cè)序，證明兩個(gè)限制性酶切位點(diǎn)和6×His標(biāo)簽被成功添加(圖3)；推斷的氨基酸序列表明該基因編碼102個(gè)氨基酸殘基，除去N端的2個(gè)額外殘基（E,F）和C端的的6個(gè)組氨酸殘基外，其余94個(gè)殘基組成了mPtCrustin3區(qū)域，且10個(gè)高度保守的半胱氨酸殘基位于該區(qū)域內(nèi)。

圖2 目的基因的PCR擴(kuò)增Fig.2 PCR amplification of target gene

圖3 編碼mPtCrustin3的cDNA及其推斷的氨基酸序列Fig.3 Nucleotide and deduced amino acid sequences of mPtCrustin3

2.2 不同來(lái)源Crustin之間氨基酸序列的比較

圖4 不同來(lái)源Crustin氨基酸序列的多重比較Fig.4 Multiple comparison of Crustin amino acid sequence from different species

對(duì)不同來(lái)源Crustin一級(jí)結(jié)構(gòu)的多重比對(duì)結(jié)果如圖4所示，不同來(lái)源的Crustin氨基酸序列中顯示了14個(gè)高度保守的氨基酸殘基（黑色陰影），它們均位于成熟肽區(qū)域中，其中11個(gè)高度保守的殘基位于WAP結(jié)構(gòu)域區(qū)域，內(nèi)有8個(gè)半胱氨酸殘基在空間上可以形成4對(duì)二硫鍵，被認(rèn)為與Crustin的穩(wěn)定和抗菌活性有關(guān)，由此證明了WAP結(jié)構(gòu)域的重要性。在被比較的甲殼類動(dòng)物中，與PtCrustin3同源性最高的是遠(yuǎn)海梭子蟹同工型1（76%），其次是眼斑龍蝦（53%）；其余來(lái)源的Crustin與PtCrustin3之間的氨基酸同源性在37～44%（表2）。

表2 不同來(lái)源Crustin之間氨基酸序列的同源性Table 2 Homology of the Crustin amino acid sequences among different species

2.3 基于Crustin氨基酸序列的分子系統(tǒng)樹(shù)分析

由圖5可見(jiàn)，根據(jù)不同Crustin氨基酸序列構(gòu)建的分子系統(tǒng)樹(shù)可分為1個(gè)大的分支和1個(gè)小分支。三疣梭子蟹PtCrustin3和遠(yuǎn)海梭子蟹同工型1位于大分支下面的1個(gè)小分支，由自引導(dǎo)值100支持，證明它們之間的親緣關(guān)系最近,該分子系統(tǒng)樹(shù)的分析結(jié)果與氨基酸序列多重比對(duì)的結(jié)果基本一致。

圖5 基于Crustin氨基酸序列的分子系統(tǒng)樹(shù)Fig.5 Molecular phylogenetic tree based on Crustin amino acid sequence

2.4 構(gòu)建重組表達(dá)載體pPICZαA-mPtCrustin3及其鑒定

將上述經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證的mPtCrustin3片段與表達(dá)載體pPICZαA連接以獲得重組表達(dá)載體pPICZαA-mPtCrustin3(圖6)。轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α后，使用載體上的引物5’AOX1和3’AOX1進(jìn)行菌落PCR鑒定，由圖7A可見(jiàn)，在約835 bp處有明顯條帶，與理論值相符；另一方面，采用EcoRⅠ和XbaⅠ對(duì)重組表達(dá)載體pPICZαA-mPtCrustin3進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，由圖7B泳道3可見(jiàn)，僅顯示了1個(gè)大分子量的條帶（切下目的片段后剩下的載體片段），卻未見(jiàn)315 bp目的片段的條帶（可能由于濃度太低）；但未酶切的陰性對(duì)照（泳道4）顯示了一個(gè)更大分子量的條帶，初步證明重組表達(dá)載體pPICZαA-mPtCrustin3已構(gòu)建成功。此外，DNA測(cè)序結(jié)果也證明mPtCrustin3與pPICZαA正確連接，未發(fā)生基因變異。

圖6 重組表達(dá)載體pPICZαA-mPtCrustin3的構(gòu)建Fig.6 Construction of recombinant expression vector pPICZαA-mPtCrustin3

圖7 pPICZαA-mPtCrustin3的菌落PCR（A）和雙酶切鑒定（B）Fig.7 Identification of pPICZαA-mPtCrustin3 by colony PCR(A)and restriction endonuclease digestion(B)

2.5 酵母轉(zhuǎn)化子的篩選及其鑒定

將重組表達(dá)載體pPICZαA-mPtCrustin3電轉(zhuǎn)入畢赤酵母X-33細(xì)胞后，經(jīng)含100 μg/mL博來(lái)霉素的YPDS平板、MM和MD平板篩選后，獲得10株甲醇利用快速型酵母轉(zhuǎn)化子；選擇2株經(jīng)YPD液體培養(yǎng)基過(guò)夜培養(yǎng)后，提取其酵母基因組DNA為模板，使用載體上的通用引物5’AOX1和3’AOX1進(jìn)行PCR驗(yàn)證，如圖8所示，2株樣品均在2200 bp和835 bp處有明顯條帶，前者為畢赤酵母X-33中因存在醇氧化酶基因AOX1自身的引物結(jié)合位點(diǎn)而擴(kuò)增的條帶，后者為含目的基因的擴(kuò)增條帶，與理論值相符。由此證明pPICZαA-mPtCrustin3成功嵌合進(jìn)畢赤酵母基因組DNA。

圖8 酵母轉(zhuǎn)化子的PCR鑒定Fig.8 PCR identification of yeast transformants

2.6 重組體mPtCrustin3的誘導(dǎo)表達(dá)及Tricine-SDS-PAGE分析

對(duì)上述篩選到的1號(hào)酵母轉(zhuǎn)化子采用BMM培養(yǎng)基、1%甲醇誘導(dǎo)表達(dá)96 h后，離心取上清用作Tricine-SDS-PAGE分析，由圖9可見(jiàn)，與陰性對(duì)照（含pPICZαA空質(zhì)粒的酵母轉(zhuǎn)化子）相比，該酵母轉(zhuǎn)化子在小于14.4 kD處有明顯的條帶，接近理論分子量位置（11.6 kD），證明重組體mPtCrustin3被成功表達(dá)。

圖9 培養(yǎng)液上清的Tricine-SDS-PAGE分析Fig.9 Tricine-SDS-PAGE analysis for supernatants from culture solutions

3 討論

迄今為止，僅Cui等[7]報(bào)道了三疣梭子蟹PtCrustin3成熟肽在大腸桿菌中的重組DNA表達(dá)，并且是以融合蛋白的形式表達(dá)的，顯然不利于目的蛋白的獲取。鑒于此，本研究擬通過(guò)構(gòu)建畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)，以期實(shí)現(xiàn)三疣梭子蟹mPtCrustin3的真核重組表達(dá)，所選的宿主菌為野生型畢赤酵母X-33，其對(duì)外源蛋白具有較好的分泌和適應(yīng)能力[10]，有利于獲得目的蛋白。由本研究結(jié)果可知，基本上已實(shí)現(xiàn)上述目標(biāo)，但在進(jìn)一步的研究中還有待于對(duì)有些方面進(jìn)行改變和完善。例如，圖9中1號(hào)泳道的目的條帶下方還顯示了1個(gè)淡條帶，其原因分析如下：載體pPICZαA中α因子信號(hào)肽的N端存在Kex2和Ste13兩個(gè)切割位點(diǎn)，若在Kex2位點(diǎn)處被切割的話，目的片段5’端的EcoR I與Kex2位點(diǎn)之間的序列會(huì)導(dǎo)致重組體mPtCrustin3的N端額外引入6個(gè)氨基酸殘基；另一方面，雖然Ste13位點(diǎn)被切割的效率不高，但若在該位點(diǎn)被切割的話，可能導(dǎo)致重組體mPtCrustin3的N端引入2個(gè)或4個(gè)額外的氨基酸殘基，由此獲得分子量不同的目的蛋白。上述兩種情況均不能獲得天然的N末端，該結(jié)果是否會(huì)對(duì)重組體mPtCrustin3的空間結(jié)構(gòu)以及生物學(xué)活性產(chǎn)生影響還有待于進(jìn)一步的研究。進(jìn)一步的研究將聚焦于選擇合適的限制性內(nèi)切酶，以期獲得具有天然N末端的重組體mPtCrustin3。

因本研究中目的蛋白在畢赤酵母中的表達(dá)量較低，故圖9顯示的是對(duì)發(fā)酵液上清進(jìn)行濃縮處理后的電泳結(jié)果。關(guān)于表達(dá)量低的原因可能與使用的是天然cDNA有關(guān)，經(jīng)分析，編碼mPtCrustin3的94個(gè)氨基酸殘基的天然密碼子中有7個(gè)密碼子對(duì)于畢赤酵母而言屬于低頻密碼子。已有研究表明，對(duì)密碼子進(jìn)行優(yōu)化可提高目的蛋白在畢赤酵母中的表達(dá)量[11?14]，因此在后續(xù)研究中將根據(jù)畢赤酵母的密碼子偏愛(ài)性，對(duì)目的基因進(jìn)行優(yōu)化合成，以期提高目的蛋白的表達(dá)量。

4 結(jié)論

本研究通過(guò)RT-PCR從三疣梭子蟹鰓中克隆到編碼PtCrustin3成熟肽的基因mPtCrustin3，經(jīng)巢式PCR獲得含EcoRⅠ和XbaⅠ酶切位點(diǎn)及6×His標(biāo)簽的目的基因，經(jīng)與pPICZαA連接成功構(gòu)建重組表達(dá)載體pPICZαA-mPtCrustin3，轉(zhuǎn)化至畢赤酵母X-33后，在29℃、250 r/m下，經(jīng)1%甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)96 h后，成功表達(dá)重組體mPtCrustin3。本研究為進(jìn)一步研究三疣梭子蟹PtCrustin3的功能及其應(yīng)用奠定了良好基礎(chǔ)。

[1]Relf JM,Chisholm JRS,Kemp GD,et al.Purification and characterization of a cysteine-rich 11.5-kDa antibacterial protein fromthegranularhaemocytesoftheshorecrabCarcinusmaenas[J].EuropeanJournalofBiochemistry,1999,264(2):350-357

[2]Mu C,Zheng P,Zhao J,et al.A novel type I crustin(CrusEs2)identified from Chinese mitten crab Eriocheir sinensis [J].Fish&Shellfish Immunology,2011,31(1):142-147

[3]Smith VJ,Fernandes JMO,Kemp GD,et al.Crustins:Enigmatic WAP domain-containing antibacterial proteins from crustaceans[J].Developmental&Comparative Immunology,2008,32(7):758-772

[4]Afsal VV,Antony SP,Bright AR,et al.Molecular identification and characterization of Type I crustin isoforms from the hemocytes of portunid crabs,Scylla tranquebarica and Portunus pelagicus[J].Cellular Immunology,2013,284(1-2):45-50

[5]Yu AQ,Shi YH,Wang Q.Characterisation of a novel Type I crustin involved in antibacterial and antifungal responses in the red claw crayfish,Cherax quadricarinatus[J].Fish&Shellfish Immunology,2016,48(1):30-38

[6]Imjongjirak C,Amparyup P,Tassanakajon A,et al.Molecular cloning and characterization of crustin from mud crab Scylla paramamosain[J].Molecular Biology Reports,2009,36(5):841-850

[7]Cui Z,Song C,Liu Y,et al.Crustins from eyestalk cDNA library of swimming crab Portunustri tuberculatus:molecular characterization,genomicorganizationandexpressionanalysis[J].Fish&ShellfishImmunology,2012,33(4):937-945

[8]Jonasson P,Liljeqvist S,Nygren PA,et al.Genetic design for facilitated production and recovery of recombinant proteins in Escherichia coli[J].Biotechnology and Applied Biochemistry,2002,35(2):91-105

[9]Macauley-Patrick S,Fazenda ML,McNeil B,et al.Heterologous protein production using the Pichia pastoris expression system[J].Yeast,2005,22(4):249-270

[10]曹慕琛,徐健勇,羅立超,等.黑曲霉糖化酶基因的克隆及其在畢赤酵母X-33中的表達(dá)[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2011,39(14):8226-8230

[11]宋長(zhǎng)豐,陶妍,趙冬梅,等.斑點(diǎn)叉尾鮰鐵調(diào)素成熟肽在畢赤酵母中的表達(dá)及其抑菌活性[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào),2015,23(3):380-387

[12]簡(jiǎn)思美,蔡斌斌,吳程,等.基因改造AiiA蛋白在畢赤酵母中的表達(dá)[J].福建師范大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2015,31(6):55-63

[13]劉真英,李文利.密碼子優(yōu)化后的柞蠶溶菌酶在酵母中的表達(dá)及活性測(cè)定[J].微生物學(xué)通報(bào),2016,43(2):292-300

[14]孫風(fēng)敏,韓焱,李文利.基于密碼子優(yōu)化的蛋白酶K在畢赤酵母中的表達(dá)及分離純化[J].微生物學(xué)通報(bào),2014,41(11):2198-2207

Recombinant DNAExpression of PtCrustin3 Mature Peptide from Portunus trituberculatus in Pichia pastoris

LU Xi-yang,TAO Yan*
Shanghai Engineering Research Center of Aquatic-Product Processing&Preservation/College of Food Science and Technology/Shanghai Ocean University,Shanghai 201306,China

Crustins are series of small molecular antimicrobial peptides expressed mainly in crustaceans.They play important roles in the animal immune system against pathogenic microorganism infection,thus,they are considered to be good candidates to replace antibiotics.The N-terminal of Crustin contains a signal sequence and its C-terminal contains a mature peptide sequence including the WAP(whey acidic protein)domain.The mature peptide is responsible for bioactivity of Crustin.According to structural differences of the region between signal peptide and WAP domain,Crustin can be divided into three types.The present study focused on the mPtCrustin3,the mature peptide of an isoform for Crustin typeI from Portunustri tuberculatus.The cDNA encoding mPtCrustin3 was cloned from gill of P.tuberculatus by RT-PCR.EcoR I site, and XbaⅠsite and 6×His tag were added to 5’and 3’of this cDNA,respectively,by nested PCR.This target fragment was ligated to pPICZ α A vector to construct a recombinant expression vector pPICZ α A-mPtCrustin3.Then the pPICZαA-mPtCrustin3 was transformed into competent Pichia pastoris X-33 cells.Recombinant mPtCrustin3 was induced with 1.0%(V/V)methanol at 29℃,250 r/m for 96 h.Tricine-SDS-PAGE analysis demonstrated that the expressed product was the recombinant mPtCrustin3 with molecular weight of about 11.6 kD.

Portunus trituberculatus;RT-PCR;Ptcrustin3 mature peptide;Pichia pastoris;recombinant expression

TQ465.6

:A

:1000-2324(2017)02-0303-07

10.3969/j.issn.1000-2324.2017.02.029

2016-06-01

:2016-07-12

上海市教育委員會(huì)產(chǎn)學(xué)研項(xiàng)目(15CXY30);農(nóng)業(yè)部都市農(nóng)業(yè)(南方)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放基金(UA201307)

盧希陽(yáng)(1989-),男,碩士研究生,研究方向:水產(chǎn)生物分子生物學(xué).E-mail:125119453@qq.com

*通訊作者:Author for correspondence.E-mail:ytao@shou.edu.cn