李 所，李嘯晨，康錦丹，朱海瑛，郭 慶，鄭 鑫*，尹熙俊*

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林長春 130118；2.延邊大學(xué)動物科學(xué)系，吉林延吉133002）

DNA甲基化抑制因子5-AzaDc對犬卵母細胞體外培養(yǎng)核成熟的影響

李 所1，李嘯晨2，康錦丹2，朱海瑛2，郭 慶2，鄭 鑫1*，尹熙俊2*

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林長春 130118；2.延邊大學(xué)動物科學(xué)系，吉林延吉133002）

本實驗旨在研究DNA甲基化酶抑制劑5-氮-2-脫氧胞苷（5-AzaDc）對犬卵母細胞體外成熟的影響。研究比較添加不同濃度5-AzaDc（1、2 μ mol/L）處理不同時間（1、2、48、72 h）觀察的犬卵母細胞成熟情況，并通過DNA甲基化的免疫熒光染色，觀察5-AzaDc對DNA甲基化在犬卵母細胞中的分布情況及趨勢變化。結(jié)果表明：添加2 μmol/L的5-AzaDc處理48 h，所有卵母細胞均脫離GV期，并且與對照組相比顯著提高進入GVBD-MⅡ期的比率（28.3% vs.87.1%）；免疫熒光染色結(jié)果顯示，成熟卵母細胞的DNA甲基化染色位點主要集中在細胞核內(nèi)，并未在細胞質(zhì)中出現(xiàn)，DNA甲基化程度顯著降低，并使染色質(zhì)凝集。綜上所述，添加2 μmol/L的5-AzaDc處理48 h可以通過抑制DNA甲基化水平提高犬卵母細胞體外成熟率，短時間的抑制DNA甲基化水平對犬卵母細胞的減數(shù)分裂恢復(fù)有積極促進作用。

犬卵母細胞；體外成熟；5-氮-2-脫氧胞苷；DNA甲基化抑制

隨著寵物犬、功能犬越來越受到大眾關(guān)注，世界各國的研究人員對犬的體細胞克隆及繁殖的研究越來越多。隨著2005年首頭“斯納皮”克隆犬的誕生[1]，2015年10月，中國科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院賴良學(xué)研究員研究團隊同樣利用體內(nèi)成熟的犬卵母細胞成功建立了全球首例基因敲除犬模型[2]。目前，犬的體細胞克隆、體外胚胎生產(chǎn)等熱門技術(shù)由于受到犬卵母細胞體外成熟率低而被約束。除外部環(huán)境外，卵母細胞的成熟同時也受到內(nèi)部調(diào)控，如DNA甲基化也能控制卵母細胞的成熟，但有關(guān)犬體內(nèi)DNA甲基化的研究甚少。目前，已證明DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶（DNA Methyhransferases，Dnmts）成員Dnmt1主要維持基因組的甲基化水平[3]，并且Dnmt1與卵母細胞MII期染色質(zhì)有關(guān)并影響附植前的早期胚胎，Dnmt3的轉(zhuǎn)錄與表達有利于生長期的卵母細胞發(fā)育[4]。因此，判斷DNA甲基化能與卵母細胞的成熟有關(guān)。5-氮-2-脫氧胞苷（5-Asa-2'-Deoxyeytidine，5-AzaDc）是經(jīng)典的DNA甲基化酶抑制劑。然而5-AzaDc極少出現(xiàn)在卵母細胞成熟的研究中，尤其是對犬類卵母細胞體外成熟的影響至今未見報道。經(jīng)預(yù)實驗已證明5-AzaDc對犬卵母細胞成熟有一定效果[5]， 本研究將進一步探究5-AzaDc對犬卵母細胞體外成熟的最優(yōu)作用濃度、作用時間及其機制。

1 材料與方法

1.1 卵巢、卵母細胞的收集 本實驗犬卵母細胞主要是從延吉市肉犬屠宰場收集卵巢獲取，母犬經(jīng)處死宰殺后，將立即剖腹取出的雙側(cè)卵巢放入加有1%青-鏈霉素的生理鹽水保溫瓶中，溫度維持在25～30℃，于1～2 h送回實驗室。收集到的犬卵巢分為黃體前期（剛排完卵）、發(fā)情期（小卵泡）、黃體期中期、休情期、發(fā)情期（大卵泡）、黃體后期6個時期（圖1A）。犬是季節(jié)性單次發(fā)情動物，處于發(fā)情期的卵巢數(shù)目少之又少。本實驗為了保證結(jié)果穩(wěn)定，選取休情期與黃體后期卵巢進行后續(xù)實驗。選取的犬卵巢用37.5℃生理鹽水清洗至少3次，洗去犬卵巢表面的多余血脂和油脂。隨后將犬卵巢置于含有0.1%聚乙烯乙醇（PVA）的TALP-HEPES緩沖液的平皿內(nèi)，在37.5℃的恒溫板上用滅菌的手術(shù)刀片采用橫縱結(jié)合切割法快速劃開卵巢表面皮質(zhì)層，釋放卵子。選取直徑大于或等于110μm、細胞質(zhì)分布均勻、顏色較深、具有2層及2層以上卵丘細胞緊密包裹的卵丘卵母細胞復(fù)合體（COCs），用于本實驗的體外成熟培養(yǎng)（圖1B、C）。

圖1 不同發(fā)情周期犬卵巢及可用于體外培養(yǎng)的卵母細胞

1.2 犬卵母細胞的體外成熟培養(yǎng) 挑選出的高質(zhì)量COCs，在含有0.1% PVA的TALP-HEPES緩沖液中至少洗3～4遍，采用基礎(chǔ)成熟培養(yǎng)基TCM-199，添加25 mmol/L HEPES、10% FBS、10 ng/mL EGF、1 mg/mL L-半胱氨酸，另外增加1% 青-鏈霉素以防止污染。體外培養(yǎng)每100μL微滴培養(yǎng)液中放入15枚犬COCs，隨機分成9組，置于38.5℃、最大飽和濕度、5% CO2濃度的二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)。通過預(yù)實驗，確定在5-AzaDc濃度為1、2μmol/L 2個濃度下處理1、2、48、72 h后換液至無5-AzaDc的培養(yǎng)液中，直至72 h停止培養(yǎng)并觀察卵母細胞成熟情況。

1.3 犬卵母細胞核成熟判定 用小孔玻璃管輕輕吹吸已剝離掉卵母細胞外的卵丘細胞以獲得裸卵（DO），觀察是否排出第一極體。D-PBS洗去脫掉的卵丘細胞后，將DO放進4%多聚甲醛中室溫固定至少15 min。在載玻片四角滴上少量凡士林，將DO放到載玻片中央滴有少量甘油處，一個載玻片5～10個DO為1組，用20μg/mL Hoescht33342染色后5 min，以蓋玻片覆于其上，在顯微鏡下觀察，從中間輕輕下壓再沿四周輕輕壓以防卵母細胞破裂，直到DO胞質(zhì)充滿卵腔為止。用熒光顯微鏡觀察鑒定每個犬卵母細胞的核成熟階段。按照前人[6]報道核成熟階段判定標(biāo)準(zhǔn)，如圖2所示。

圖2 犬卵母細胞體外成熟培養(yǎng)后經(jīng)Hoechst 33342染色檢測不同核成熟期

1.4 DNA甲基化的免疫熒光染色 經(jīng)免疫熒光染色觀察卵母細胞DNA甲基化程度。收集經(jīng)5-AzaDc處理組體外成熟培養(yǎng)卵母細胞及空白對照組成熟犬卵母細胞，用含有0.1%PVA的PBS至少清洗3遍。4%多聚甲醛固定液室溫固定40 min，含1% TritonX-100的PBS室溫通透l.5 h，通透后的卵母細胞在PBS+2%BSA封閉液中室溫封閉l h，后用PBS+2%BSA溶液稀釋好的一抗（抗5-甲基胞嘧啶）孵育（l:50），錫紙包裹避光于4℃過夜，PBS+2%BSA至少清洗4遍，用FITC標(biāo)記二抗羊抗鼠 IgG（l:100）37℃避光染色1.5 h。細胞核用20μg/mL Hoechst 33342 染色5 min，含有0.1%PVA的PBS至少清洗3遍后共聚焦熒光顯微鏡下進行檢測。每個實驗重復(fù)至少3次，每次每組實驗中至少20枚卵子，每次重復(fù)使用相同的曝光度及相關(guān)參數(shù)以排除干擾。

1.5 統(tǒng)計分析 所有數(shù)據(jù)均采用IBM-SPSS23.0系統(tǒng)分析。對處理之間的差異進行分析，使用一般線性模型單因素方差分析，并進行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換轉(zhuǎn)x`=sin-1√x以服從統(tǒng)計假設(shè)。方差分析后多重比較采用鄧肯式。分類變量組（對照、1、2μmol/L濃度）和時間（1、2、48、72 h），因變量GV、GVBD、MI、MII、UDNM 及GVBD-MII，數(shù)據(jù)表達采用百分?jǐn)?shù)形式（%）。免疫熒光強度分析采用Image J系統(tǒng)分析。顯著性標(biāo)準(zhǔn)為P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同5-AzaDc培養(yǎng)濃度與不同培養(yǎng)時間對犬卵母細胞體外成熟的影響 排除死亡卵子后對不同核成熟時期卵母細胞進行統(tǒng)計。由表1可見，2μmol/L5-AzaDc處理犬卵母細胞48、72 h后，所有卵母細胞均脫離GV期，即GV期卵母細胞比率為0，但不同濃度、其他時間處理組與對照組GV期比率無顯著性差異（P＞0.05）。統(tǒng)計GVBD-MII期，在1μmol/L 72 h和2μmol/L 48、72 h（75.0%、87.1%、68.0%）處理下成熟率顯著高于1μmol/L 1 h和對照組（28.3%、32.4%，P＜0.05），其他處理組雖高于對照組，但相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義。綜上實驗結(jié)果顯示，2μmol/L的5-AzaDc條件下處理48 h為最優(yōu)處理組。

2.2 5-AzaDc處理對甲基化分布及水平的影響 如圖3所示，成熟的犬卵母細胞的DNA甲基化染色位點主要集中在細胞核內(nèi)，并未在細胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)，經(jīng)5-AzaDc處理后，DNA甲基化程度明顯降低，5-AzaDc處理后DNA甲基化受到抑制。對免疫染色結(jié)果進行熒光強度灰度值分析。圖4結(jié)果顯示，5-AzaDc處理后DNA甲基化水平極顯著低于未處理組（P＜0.01）。同一細胞期染色發(fā)現(xiàn)，5-AzaDc引起染色質(zhì)的凝集，濃縮的染色質(zhì)團上出現(xiàn)了完全的去甲基化。實驗確定經(jīng)5-AzaDc處理后，犬卵母細胞在體外成熟發(fā)育過程中的DNA甲基化水平變化趨勢。

圖3 犬卵母細胞抗5-甲基胞嘧啶抗體免疫熒光染色

圖4 免疫熒光染色熒光強度比較

3 討 論

DNA甲基化通過在Dnmts催化下，將甲基轉(zhuǎn)移到胞嘧啶的5位碳原子上，對基因組穩(wěn)定和基因表達模式起著非常關(guān)鍵的作用，并且在組織特異性基因表達、正常胚胎發(fā)育、X染色體失活和基因印跡等方面中起著至關(guān)重要的作用[7]。Vogel等[8]確定了Dnmt主要分布于細胞核內(nèi)，只有少許出現(xiàn)于細胞質(zhì)中。Lees 等[9]提出Dnmts是在細胞質(zhì)中合成與儲存，并逐漸轉(zhuǎn)移到細胞核中執(zhí)行其酶的功能，當(dāng)不再被需要時重新退回到細胞質(zhì)中。也有研究表明，Dnmts與染色體相互關(guān)聯(lián)，并作用于染色體外表面，而不是內(nèi)部[10]，并且正常染色體凝集需要5'甲基胞嘧啶核苷作為先決條件。本研究也同樣證實了5-甲基胞嘧啶存在于犬卵母細胞的細胞核內(nèi)。

表1 不同濃度5-AzaDc處理不同時間對犬卵母細胞體外成熟的影響

隨著對于DNA甲基化的深入研究，人們還發(fā)現(xiàn)了一些可以抑制DNA甲基化酶的藥物，應(yīng)用最普遍的是5-AzaDc和5-氮雜胞苷（5-AzaC）2種藥物[11]。但由于5-AzaC不僅能滲入到DNA抑制DNA的合成同時還能滲入RNA中抑制RNA與蛋白質(zhì)的合成，故目前多應(yīng)用5-AzaDc。最近針對許多物種的研究發(fā)現(xiàn)，通過對供體細胞重構(gòu)胚處理5-AzaDc和5-AzaC，可以部分消除重編程標(biāo)記，顯著提高克隆胚胎的發(fā)育能力[12]。在牛方面的研究也證明，對供體細胞和早期克隆胚胎處理5-AzaDc和TSA 可以顯著提高克隆牛胚胎的體內(nèi)、體外發(fā)育潛能[13]。另有報道表明，5-AzaDc處理使小鼠胚胎細胞的分化狀態(tài)改變并抑制Dnmt的活性；細胞接觸5-AzaDc引起復(fù)制時間改變，抑制基因的活化，并引起異染色質(zhì)的去凝集[14]。 本研究對5-AzaDc處理組和對照組分別進行抗5mc抗體免疫熒光染色，結(jié)果顯示成熟的犬卵母細胞經(jīng)5-AzaDc處理后，DNA甲基化程度明顯降低，5-AzaDc處理后DNA甲基化受到抑制。

對供體細胞和克隆胚胎均用低濃度5-AzaDc（20 nmol/L，72 h）進行處理可以顯著提高克隆胚胎的囊胚率[7]。 Enright等[15]對供體成纖維細胞進行5-AzaDc處理后發(fā)現(xiàn)0.08～0.31μmol/L的高劑量5-AzaDc降低了重構(gòu)胚的囊胚發(fā)育比率；進一步研究發(fā)現(xiàn)，少于0.1μmol/L的5-AzaDc反而會提高重構(gòu)胚的融合率，并且不影響后期囊胚發(fā)育的情況。本研究預(yù)實驗表明，低濃度（10、100 nmol/L）的5-AzaDc處理2、48 h均不能增加卵母細胞進入GVBD-MⅡ期的比率，而較高濃度（l、2μmol/L）的5-AzaDc處理2、48 h均能使卵母細胞進入MI-MⅡ期的比率增加。而本研究的進一步研究表明，更高濃度（3μmol/L）的5-AzaDc使卵母細胞死亡數(shù)顯著增加（數(shù)據(jù)未顯示）。相似研究表示，5-AzaDc對細胞具有一定的毒性作用，在培養(yǎng)液中添加這種試劑可以誘發(fā)細胞中的細胞形態(tài)變化、細胞凋亡等，因此高濃度5-AzaDc引起細胞毒性及凋亡[12]也與本研究結(jié)果相似，但是針對作用細胞種類的不同，對于5-AzaDc引起凋亡的濃度也有所不同。因此，本研究選取濃度為l、2 μmol/L，處理時間經(jīng)預(yù)處理分別選擇1、2、48、72 h。

Zhao等[14]研究表明，5-AzaC促進體外培養(yǎng)的小鼠卵母細胞成熟與其染色體結(jié)構(gòu)的改變有關(guān)，與本研究結(jié)果相似。在卵母細胞中，在卵母細胞生長期DNA甲基化出現(xiàn)全面的增加，并在GV期達到最高水平。Lodde 等[16]通過對5-甲基胞嘧啶的免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)染色質(zhì)的初次凝集伴隨著DNA甲基化水平的輕微升高。大部分關(guān)于犬卵母細胞體外成熟的研究均表明，犬卵母細胞體外成熟培養(yǎng)后，卵母細胞仍大部分處于GV期，無法達到GVBD。本實驗室做了很多關(guān)于犬卵母細胞體外成熟培養(yǎng)的研究，嘗試采用不同培養(yǎng)溫度[17]、不同培養(yǎng)方法均未能顯著提高犬卵母細胞到達GVBD-MII期的比率 。本次研究結(jié)果顯示，經(jīng)2μmol/L濃度的5-AzaDc處理犬卵母細胞48、72 h后，所有卵母細胞均脫離GV期；GVBD-M II期在1μmol/L濃度下處理72 h、2μmol/L濃度下處理48 h（75.0%、87.1%）下犬卵母細胞成熟率高于1μmol/L濃度下處理1 h組和對照組，存在顯著差異。但根據(jù)實驗結(jié)果顯示，雖然1μmol/L濃度下處理72 h效果也好，但由于死亡數(shù)較多，因此不適宜作為培養(yǎng)犬卵母細胞的最優(yōu)條件。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果顯示，2μmol/L的5-AzaDc條件下處理48 h為最優(yōu)處理組。免疫熒光染色觀察DNA甲基化在卵母細胞中的分布情況及趨勢顯示，成熟的犬卵母細胞的DNA甲基化染色位點主要集中在細胞核內(nèi)，經(jīng)5-AzaDc處理后，DNA甲基化程度明顯降低，表明5-AzaDc處理后DNA甲基化受到抑制。短時間的5-AzaDc處理增加犬卵母細胞成熟率的原因可能是5-AzaDc使DNA甲基化受到抑制，使染色體去凝集，促使GVBD的發(fā)生，短時間的5-AzaDc處理后，將卵母細胞釋放到無5-AzaDc的基礎(chǔ)培養(yǎng)液中，使卵母細胞發(fā)生重新甲基化，使染色體凝集，進而使犬卵母細胞進入MI-MⅡ期。說明通過短時間的抑制DNA甲基化水平對犬卵母細胞的減數(shù)分裂恢復(fù)有積極促進作用。

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Effect of DNA Methyltransferase Inhibitor 5-AzaDc on Nuclear Maturation of Canine Oocytes in vitro

LI Suo1, LI Xiao-Cheng2, KANG Jin-dan2, ZHU Hai-Ying2, GUO Qing2, ZHENG Xin1*, YIN Xi-Jun2*
(1.College of Animal Science and Technology, Jilin Agricultural University, Jilin Changchun 130118, China; 2.Department of Animal Science, Yanbian University, Jilin Yanji 133002, China)

Researches showed that DNA methylation was very important for the maturation of oocytes, however, the effect of DNA methylation on canine oocytes maturationin vitrohas not been examined. The objective of this study was to evaluate the effect of DNA methyltransferase inhibitor 5-AzaDc on nuclear maturation of canine oocytesin vitro. We compared thein vitronuclear maturation of canine oocytes treated with various concentrations (1, 2 μmol/ L) of 5-AzaDc for different durations (1, 2, 48 or 72 h). Immunodetection of 5-AzaDc treatment was conducted on the distribution and trend of DNA methylation in canine oocytes. the results indicated that the treatment of 2 μmol/L 5-AzaDc for 48 h reduced the proportion of canine oocytes that blocked in GV stage, and significantly increased the percentage of canine oocytes that reached GVBD-MIIin vitro. Immunofluorescence staining of anti-5-methylcytosine showed that the localization of DNA methylation during canine oocyte centralized in nuclear area, but not in cytoplasm, and the treatment with 5-AzaDc significant decreased the DNA methylation level. In conclusion, 2 μmol/L 5-AzaDc supplementation during IVM for 48 h improved the maturation of canine oocytes by inhibiting the DNA methylation levels of oocytes, and the inhibition of DNA methylation levels for a short time active effect on meiotic resumption of canine oocytes.

Canine oocyte;in vitromaturation; 5-AzaDc; DNA methyltransferase

S829.3

A

10.19556/j.0258-7033.2017-05-050

2016-11-24；

2016-12-29

吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)科研啟動基金（201602）；吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)博士后流動站（166992）；中國博士后科學(xué)基金第60批面上資助（ 2016M601393）

李所（1988-），女，博士，講師，主要研究方向動物遺傳育種與繁殖，E-mail: wonderful8899@ 163.com

* 通訊作者：尹熙俊，男，教授，博士生導(dǎo)師，E-mail: yinxj33 @msn.com；鄭鑫，女，教授，博士生導(dǎo)師，E-mail: zhengxin jilin@126.com