王秋悅，鄒亞學(xué)，唐家明，呂 林，張麗陽(yáng)，羅緒剛，李素芬*

（1.河北科技師范學(xué)院，河北秦皇島 066000；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100093）

飼糧鐵水平對(duì)肉仔雞錳吸收及組織中沉積的影響

王秋悅1，鄒亞學(xué)1，唐家明1，呂 林2*，張麗陽(yáng)2，羅緒剛2，李素芬1*

（1.河北科技師范學(xué)院，河北秦皇島 066000；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100093）

本試驗(yàn)旨在研究飼糧鐵水平對(duì)肉仔雞錳吸收及組織中沉積的影響及其機(jī)制。將336只1日齡商品代羅斯308肉公雛按體重隨機(jī)分為4個(gè)組，每組6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)14只雞，分別飼喂不加鐵基礎(chǔ)飼糧（含鐵77.7 mg/kg）、以硫酸亞鐵（FeSO4·7H2O）形式添加鐵100、250、500 mg/kg飼糧。28日齡進(jìn)行原位結(jié)扎十二指腸灌注8.74 mmol/L錳測(cè)定錳吸收率。結(jié)果表明：血漿鐵和血漿轉(zhuǎn)鐵蛋白飽和度均隨飼糧鐵水平升高而提高（P＜0.10）；胰腺、十二指腸黏膜和脛骨灰鐵含量隨飼糧鐵水平升高而升高（P＜0.10），錳含量隨飼糧鐵水平升高而降低（P＜0.10）；3個(gè)加鐵組十二指腸黏膜二價(jià)金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白mRNA水平均顯著低于對(duì)照組（P＜0.10），添加鐵500 mg/kg組膜轉(zhuǎn)鐵蛋白mRNA水平顯著低于對(duì)照組和其他2個(gè)加鐵組（P＜0.10）；加鐵組十二指腸錳吸收率均顯著低于對(duì)照組（P＜0.10）。結(jié)果提示，飼糧鐵可能通過(guò)調(diào)控十二指腸黏膜二價(jià)金屬轉(zhuǎn)運(yùn)載體的表達(dá)降低錳的吸收及組織中的沉積。

鐵；錳；二價(jià)金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；膜轉(zhuǎn)鐵蛋白；肉仔雞

錳和鐵都是動(dòng)物必需的微量元素，二者在吸收和代謝中存在著復(fù)雜的關(guān)系。小腸黏膜上的二價(jià)金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（Divalent Metal Transporter 1，DMT1）是最早發(fā)現(xiàn)的將小腸腔內(nèi)二價(jià)鐵轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)的膜轉(zhuǎn)鐵蛋白，也是腸道中唯一的二價(jià)錳轉(zhuǎn)運(yùn)載體[1]，參與大鼠[2]、豬[3]和雞[4]腸上皮細(xì)胞對(duì)錳的攝取。膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（Ferroportin，F(xiàn)PN1）是最新發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)運(yùn)鐵的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)載體[5]，其主要功能是將鐵從腸黏膜細(xì)胞中轉(zhuǎn)運(yùn)至血液，可能也參與除鐵以外鋅、銅、錳、鈷和鎘的轉(zhuǎn)運(yùn)[6]。因此，本試驗(yàn)旨在研究飼糧鐵水平對(duì)肉仔雞錳吸收及組織中沉積的影響及其機(jī)制，進(jìn)一步揭示錳與鐵之間的互作關(guān)系，為提高肉雞錳吸收率、減少錳排出對(duì)環(huán)境的污染，提供系統(tǒng)、深入的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與處理安排 采用單因子完全隨機(jī)設(shè)計(jì)，共4個(gè)處理組，分別為不加鐵基礎(chǔ)飼糧組、以硫酸亞鐵（FeSO4·7H2O）形式添加鐵100、250、500 mg/kg組。

為觀察飼糧鐵對(duì)錳吸收的影響，在28日齡時(shí)，參照白世平[7]方法，每籠按平均體重抽取2只雞進(jìn)行結(jié)扎十二指腸灌注，結(jié)扎腸段長(zhǎng)度為10 cm，灌注液為含20 μg/mL 酚紅、pH 6.0的5.5 mmol/L Mes-生理鹽水溶液，灌注液含錳8.74 mmol/L，灌注量為3.5 mL，灌注時(shí)間為30 min。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物與飼糧 將336只1日齡商品代羅斯308肉公雛按照體重隨機(jī)分成4個(gè)組，每組6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)14只雞，飼養(yǎng)于不銹鋼肉雞籠中，自由采食和飲自來(lái)水（未檢測(cè)到鐵）。試雞飼養(yǎng)管理按《羅斯肉仔雞飼養(yǎng)管理手冊(cè)》進(jìn)行。

參照我國(guó)肉仔雞營(yíng)養(yǎng)需要量（2004）配制1～28日齡肉仔雞玉米-豆粕型基礎(chǔ)飼糧（表1，含鐵77.7 mg/kg），并按上述處理安排配制添加鐵試驗(yàn)飼糧（實(shí)測(cè)含鐵量分別為166、308、579 mg/kg）。試驗(yàn)期28 d。

1.3 樣品采集與制備 試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，試雞禁食8 h后，分別從每個(gè)重復(fù)籠中選取2只與平均體重相近的試雞，心臟穿刺采集EDTA抗凝血，4℃保存，用于測(cè)定血紅蛋白濃度及紅細(xì)胞壓積；采集肝素鈉抗凝血，3 000 r/min離心10 min后得血漿，于-20℃保存，用于測(cè)定血漿鐵及總鐵結(jié)合力。

將抽過(guò)血的試雞屠宰，用生理鹽水沖洗十二指腸2次，然后在距幽門(mén)1 cm處剪開(kāi)十二指腸，用載玻片刮取上部4～5 cm黏膜，液氮速凍后于-80℃凍存，用于相關(guān)基因mRNA水平測(cè)定，然后刮取下部黏膜10 cm左右，取左側(cè)肝臟、心臟、胰臟和左腿脛骨，-20℃凍存，以備用于測(cè)定其中鐵和錳含量。每個(gè)重復(fù)籠中屠宰雞的樣品等量合并為一個(gè)樣品進(jìn)行分析。

灌注試驗(yàn)結(jié)束后，收集十二指腸灌注液，分析其中酚紅和錳含量。每只雞為1個(gè)重復(fù)。

1.4 樣品分析 根據(jù)馬新燕[8]采用的方法，將自來(lái)水、飼糧、十二指腸黏膜、肝臟、心臟、胰臟、脛骨灰和灌注液用混酸（HNO3和HCIO4按20:1混合） 濕消化后，用電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀（Model IRIS Intrepid II，Thermal Jarrell Ash，Waltham，MA）測(cè)定其中的鐵、錳含量。參照白世平[7]方法，用紫外可見(jiàn)分光光度儀（Cary-100，Agilent）測(cè)定灌注液中的酚紅濃度，并計(jì)算錳的吸收率。采用全自動(dòng)血液分析儀（HC-3000）測(cè)定全血紅細(xì)胞壓積及血紅蛋白濃度。參照馬新燕[8]的方法，采用比色法測(cè)定血漿鐵和總鐵結(jié)合力，試劑盒（Cat No.A039和A040）購(gòu)自南京建成生物技術(shù)公司，計(jì)算血清鐵與總鐵結(jié)合力的百分比即血鐵飽和度。

采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR法測(cè)定十二指腸黏膜DMT1和FPN1 mRNA水平。參照白世平[7]所述方法，用Trizol試劑（Invitrogen，Cat No. 15596-026）提取總RNA，用P330-31型核酸分析儀（Implen）測(cè)定細(xì)胞總RNA的濃度及其在230、260、280 nm的吸光度，計(jì)算OD260和OD280的比值，采用1%甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA的完整性。參照SuperScript III TM First-Strand Synthesis System for RT-PCR試劑盒（Qiagen，Cat No.205311）說(shuō)明書(shū)所述步驟合成cDNA模板。采用SYBR Green 染料試劑盒（ABI，Cat No.4367659）在ABI 7500 PCR儀上對(duì)DMT1和FPN1基因進(jìn)行熒光定量PCR分析，以β-actin基因作為內(nèi)參進(jìn)行半定量。所用引物序列見(jiàn)表2，由上海英濰捷基公司合成。每個(gè)樣品做3次平行測(cè)定。

表1 1~28日齡肉仔雞基礎(chǔ)飼糧組成(飼喂基礎(chǔ))

1.5 統(tǒng)計(jì)分析 采用 SAS8.0一般線性模型GLM對(duì)所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。若方差分析差異顯著，則以最小顯著差異LSD法比較各平均數(shù)之間的差異顯著性。以國(guó)際文獻(xiàn)報(bào)道中通常采用的P＜0.10作為檢驗(yàn)差異顯著性標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼糧鐵水平對(duì)肉仔雞生長(zhǎng)性能的影響 由表3可見(jiàn)，飼糧鐵水平對(duì)肉仔雞生長(zhǎng)性能指標(biāo)無(wú)顯著影響（P＞0.10），但日增重和日采食量均有隨飼糧鐵水平升高而降低的趨勢(shì)（P＞0.10）。

2.2 飼糧鐵水平對(duì)肉仔雞血液指標(biāo)的影響 由表4可見(jiàn)，飼糧鐵水平對(duì)血漿總鐵結(jié)合力、血紅蛋白濃度及紅細(xì)胞壓積均無(wú)顯著影響（P＞0.10），但顯著影響血漿鐵和血漿轉(zhuǎn)鐵蛋白飽和度（P＜0.10），二者均隨飼糧鐵水平增加而提高（P＜0.10）。

表2 DMT1、FPN1及β-actin引物參數(shù)

2.3 飼糧鐵水平對(duì)肉仔雞組織鐵和錳含量的影響 由表5可見(jiàn)，飼糧鐵水平除對(duì)28日齡心臟鐵含量無(wú)顯著影響（P＞0.10）外，顯著影響其他所測(cè)組織鐵含量（P＜0.10），這些組織鐵含量均隨飼糧鐵水平增加而提高（P＜0.10）。飼糧鐵水平對(duì)肝臟和心臟錳含量無(wú)顯著影響（P＞0.10），但十二指腸黏膜、胰腺和骨灰錳含量均隨飼糧鐵水平增加而降低（P＜0.10）。

2.4 飼糧鐵水平對(duì)肉仔雞十二指腸黏膜DMT1和FPN1mRNA水平及錳吸收率的影響 由表6可見(jiàn)，飼糧鐵水平顯著影響十二指腸黏膜DMT1和FPN1mRNA水平（P＜0.10），其中加鐵組DMT1mRNA水平均顯著低于對(duì)照組（P＜0.10），且添加鐵500 mg/kg組DMT1mRNA水平也低于其他2個(gè)添加鐵組（P＜0.10）。添加鐵500 mg/kg組FPN1mRNA水平顯著低于對(duì)照組和其他2個(gè)添加鐵組（P＜0.10），其他3組間差異不顯著（P＞0.10）。飼糧鐵水平顯著影響原位結(jié)扎十二指腸中錳的吸收率（P＜0.10），其中加鐵組錳吸收率均顯著低于對(duì)照組（P＜0.10），且添加鐵500 mg/kg組錳吸收率也低于其他2個(gè)添加鐵組（P＜0.10）。

表3 飼糧鐵水平對(duì)1～28日齡肉仔雞生長(zhǎng)性能的影響

表4 飼糧鐵水平對(duì)28日齡肉仔雞血液指標(biāo)的影響

表5 飼糧鐵水平對(duì)28日齡肉仔雞組織鐵和錳含量的影響(鮮基) μg/g

表6 飼糧鐵水平對(duì)28日齡肉仔雞十二指腸黏膜DMT1和FPN1mRNA水平及錳吸收率的影響

3 討 論

3.1 飼糧鐵水平對(duì)肉仔雞生長(zhǎng)性能的影響 玉米-豆粕型飼糧中添加100 mg/kg鐵對(duì)1～21日齡肉仔雞采食量和日增重均無(wú)顯著影響[8]，但添加400～800 mg/kg鐵降低采食量和日增重[9]。本試驗(yàn)中添加鐵250、500 mg/kg組采食量和日增重均有降低的趨勢(shì)，說(shuō)明此時(shí)機(jī)體可能已經(jīng)呈現(xiàn)鐵臨界過(guò)量的狀態(tài)。

3.2 飼糧鐵水平對(duì)肉仔雞血液指標(biāo)的影響 盡管動(dòng)物缺鐵會(huì)導(dǎo)致血紅蛋白濃度降低，但在不缺鐵飼糧中添加100～500 mg/kg鐵并不增加血紅蛋白濃度[3]。本試驗(yàn)中對(duì)照組與添加鐵組間血紅蛋白濃度和紅細(xì)胞壓積均未表現(xiàn)出差異，可能與本試驗(yàn)中所用飼糧含鐵較高、此時(shí)雞只僅臨界缺鐵有關(guān)。血漿轉(zhuǎn)鐵蛋白飽和度低于16%說(shuō)明體內(nèi)鐵缺乏，超過(guò)60%則說(shuō)明鐵過(guò)量[10]。本試驗(yàn)飼糧中添加鐵250 mg/kg組轉(zhuǎn)鐵蛋白飽和度接近60%，說(shuō)明雞只處于臨界鐵過(guò)量狀態(tài)，添加鐵500 mg/kg組轉(zhuǎn)鐵蛋白飽和度超過(guò)60%，說(shuō)明雞只處于鐵過(guò)量狀態(tài)。

3.3 飼糧鐵水平對(duì)肉仔雞組織鐵和錳含量的影響斷奶仔豬飼糧中添加鐵100、500 mg/kg，肝臟和十二指腸鐵含量線性增加而錳含量線性降低[3]。斷奶犢牛飼糧中添加750 mg/kg鐵顯著提高肝臟鐵含量，但僅有十二指腸錳含量顯著降低[11]。蛋雞采食添加錳300 mg/kg飼糧6周后，十二指腸和肝臟中錳含量升高而鐵含量降低[12]。本試驗(yàn)中肝臟、胰腺、十二指腸和脛骨灰鐵含量隨飼糧鐵添加水平升高而增加，胰腺、十二指腸和脛骨灰錳含量隨飼糧鐵添加水平升高而降低，強(qiáng)烈提示飼糧鐵和錳在吸收和代謝中存在拮抗關(guān)系。

3.4 飼糧鐵水平對(duì)肉仔雞十二指腸DMT1和FPN1mRNA水平及錳吸收率的影響 斷奶大鼠飼喂添加2%羧酸鐵的高鐵飼糧2周后，十二指腸中與鐵吸收轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的基因Dcytb、DMT1、FPN1和TfR1mRNA水平均明顯降低[13]。8日齡肉仔雞飼喂含鐵51 mg/kg和141 mg/kg飼糧6周后，高鐵組十二指腸中DMT1、FPN1和DcytbmRNA水平均低于低鐵組[14]。蛋雞采食添加錳300 mg/kg飼糧6周后，十二指腸DMT1mRNA水平降低，但FPN1mRNA水平升高[12]。本試驗(yàn)中添加鐵組十二指腸黏膜中DMT1mRNA表達(dá)量明顯低于對(duì)照組，且與錳吸收率表現(xiàn)出相同的趨勢(shì)，強(qiáng)烈提示飼糧鐵可能通過(guò)降低DMT1mRNA表達(dá)量而降低了錳的吸收。只有500 mg/kg鐵組十二指腸黏膜中FPN1mRNA表達(dá)量明顯低于對(duì)照組，這可能與FPN1位于基底膜、其表達(dá)量受腸黏膜細(xì)胞內(nèi)鐵含量調(diào)控有關(guān)。

4 結(jié) 論

肉仔雞十二指腸黏膜中DMT1和FPN1mRNA表達(dá)量、原位結(jié)扎十二指腸對(duì)錳的吸收率及胰腺、十二指腸和脛骨灰錳含量均隨飼糧鐵水平升高而降低，表明飼糧添加鐵可能通過(guò)調(diào)控十二指腸黏膜DMT1和FPN1的表達(dá)量降低了錳的吸收及組織中的沉積。

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Effect of Dietary Iron Level on Manganese Absorption and Deposition of Broilers

WANG Qiu-yue1, ZOU Ya-xue1, TANG Jia-ming1, LV Lin2*, ZHANG Li-yang2, LUO Xu-gang2, LI Su-fen1*
(1.Hebei Science and Technology Normal College, Hebei Qinhuangdao 066000, China; 2. Institute of Animal Sciences of CAAS, Beijing 100093,China)

This experiment was conducted to investigate the effect of dietary iron (Fe) level on manganese (Mn) absorption and deposition in broilers. A total of 336 1-day-old Rose-308 male chicks were divided into 4 groups with 6 replicates and 14 chicks each replicate cage, and fed the basal diet (control, containing Fe 77.7 mg/kg) or basal diet supplemented with 100, 250, or 500 mg Fe/kg for 28 days. Ligated duodenal loops were perfused with 8.74 mmol/L of Mn to determine the Mn absorption. The results showed that plasma Fe content and transferrin saturation increased (P＜0.10) as dietary Fe level increased. The Fe contents in pancreas, duodenal mucosa, and tibia ash increased (P＜0.10) and the Mn contents in above mentioned tissues decreased (P＜0.10) as dietary Fe level increased. The DMT1 mRNA levels of Fe-supplemented groups were lower (P＜0.10) than that of the control, and theFPN1mRNA level of Fe-supplemented 500 mg/kg group was lower (P＜0.10) than those of the control and the other two Fe-supplemented groups. The Mn absorption rates of Fe-supplemented groups were lower (P＜0.10) than that of the control. These results suggested that dietary Fe might decrease the absorption and deposition of Mn through the down-regulations ofDMT1andFPN1gene expression in duodenal mucosa of broilers.

Iron; Manganese; Divalent Metal transporter 1; Ferroportin; Broiler

S831.5

A

10.19556/j.0258-7033.2017-05-068

2016-11-24；

2016-12-26

國(guó)家自然科學(xué)基金（31272465）

王秋悅（1980-），女，河北唐山人，副教授，博士，主要從事分子生物學(xué)研究，E-mail: wangqiuyue1980@163. com；并列第一作者：鄒亞學(xué)（1972-），男，河北遷安人，副教授，博士，主要從事分子生物學(xué)研究，E-mail: zouyaxue@163.com

* 通訊作者：呂林，副研究員，碩士生導(dǎo)師，E-mail：lulin1225 @163.com；李素芬，教授，碩士生導(dǎo)師，E-mail: lisufen88@ aliyun.com