趙艷坤，邵 偉，余 雄

（新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，新疆肉乳用草食動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室，新疆烏魯木齊 830052）

臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)乳腺上皮細(xì)胞乳蛋白合成的調(diào)控研究

趙艷坤，邵 偉，余 雄*

（新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，新疆肉乳用草食動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室，新疆烏魯木齊 830052）

為探究臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（UC-MSCs）調(diào)控乳腺上皮細(xì)胞（BMECs）乳蛋白合成的可能作用機(jī)制，實(shí)驗(yàn)共分為8組，實(shí)驗(yàn)組利用Transwell小室雙層共培養(yǎng)UC-MSCs和BMECs，BMECs單培養(yǎng)為對(duì)照組，每組又分為不處理組和IGF-Ι R抑制劑AG1024、PI3K抑制劑LY294002不同處理組，ELISA檢測(cè)上清IGF-Ι和β-酪蛋白（CSN2）、κ-酪蛋白（CSN3）含量，實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定CSN2、CSN3、P13K、AKT、mTORmRNA表達(dá)。結(jié)果表明：實(shí)驗(yàn)組各項(xiàng)指標(biāo)均極顯著高于對(duì)照組（P＜0.01）；AG1024處理顯著下調(diào)各基因表達(dá)（P＜0.05），極顯著降低CSN2、CSN3蛋白含量（P＜0.01）；LY294002處理極顯著抑制PI3K mRNA表達(dá)（P＜0.01），顯著降低CSN2、CSN3 mRNA表達(dá)和蛋白含量；AG1024 和LY294002共同處理極顯著下調(diào)P13K、AKT、mTORmRNA表達(dá)（P＜0.01），顯著下調(diào)CSN2、CSN3 mRNA表達(dá)（P＜0.05），極顯著降低CSN2、CSN3蛋白含量（P＜0.01）。綜上，UC-MSCs能夠通過IGF-Ι介導(dǎo)PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路，上調(diào)BMECs主要乳蛋白基因表達(dá)，促進(jìn)乳蛋白合成。

臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞；乳腺上皮細(xì)胞；乳蛋白

乳腺上皮細(xì)胞（Bovine Mammary Gland Epithelial Cells, BMECs）是乳腺發(fā)育和分泌乳汁的執(zhí)行者，體外分離培養(yǎng)BMECs能夠合成和分泌乳蛋白。激素和細(xì)胞因子能夠直接調(diào)節(jié)BMECs乳蛋白的生物合成和分泌[1]。酪蛋白是乳蛋白主要成分，β-酪蛋白、κ-酪蛋白的基因表達(dá)豐度關(guān)乎著其合成與分泌，是研究BMECs乳蛋白合成的標(biāo)志[2]，而乳蛋白基因表達(dá)受多種激素或細(xì)胞因子與復(fù)雜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)協(xié)同調(diào)控[3]。近年來，越來越多的實(shí)驗(yàn)證明體外添加不同濃度類胰島素樣生長(zhǎng)因子-Ι（Insulin Like Growth Factors-Ι, IGF-Ι）可單獨(dú)或協(xié)同其他激素促進(jìn)乳腺生長(zhǎng)發(fā)育、乳蛋白基因表達(dá)，提高泌乳量[4-5]，并認(rèn)為IGF-Ι通過PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路發(fā)揮調(diào)控作用[6]。PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路包括PI3K、PTEN、AKT和mTOR等分子，受各種激素或因子刺激后，調(diào)控乳蛋白合成[7]。研究表明，PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路控制著乳蛋白相關(guān)基因的翻譯[8]，研究該通路對(duì)促進(jìn)泌乳生物學(xué)發(fā)展具重要價(jià)值。但內(nèi)源性IGF-Ι直接介導(dǎo)的PI3K/ AKT/mTOR信號(hào)通路在乳蛋白合成中的作用未見報(bào)道。該團(tuán)隊(duì)前期已成功構(gòu)建UC-MSCs和BMECs無血清共培養(yǎng)體系，并進(jìn)行了條件優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)UCMSCs可顯著促進(jìn)BMECs增殖、抑制其凋亡，且能夠顯著提高BMECs中IGF-I的表達(dá)分泌[9]。因此，本實(shí)驗(yàn)從模擬體內(nèi)細(xì)胞因子調(diào)節(jié)乳腺泌乳的角度出發(fā)，通過UC-MSCs和BMECs共培養(yǎng)，探究?jī)?nèi)源性IGF-Ι對(duì)BMECs乳蛋白合成的影響及可能的作用途徑，在細(xì)胞水平上探索乳腺泌乳功能的調(diào)控機(jī)制具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料 UC-MSCs為前期體外分離培養(yǎng)并鑒定的荷斯坦奶牛臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞；BMECs購自廣州吉妮歐生物科技有限公司；AG1024、LY294002購自于Sigma官網(wǎng)，Transwell小室、Elisa試劑盒購自于上海博谷生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與分組 在前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，按照UC-MSCs和BMECs共培養(yǎng)最佳濃度比（1:2）和時(shí)間點(diǎn)（48 h），應(yīng)用Transwell 小室（孔徑0.4 μm）建立上下雙層細(xì)胞共培養(yǎng)體系，在上室接種BMECs 1×105/孔1 mL，下室接種UCMSCs1×105/孔2 mL，48 h后分別給予IGF-Ι R抑制劑AG1024（AG, 10 μmol/L）、PI3K抑制劑LY294002（LY, 25 μmol/L）處理細(xì)胞24 h，無處理組加入等體積DMSO，吸取上清用于IGF-I、CSN2、CSN3含量檢測(cè)，并采用胰酶消化法收集細(xì)胞，-20℃保存?zhèn)溆糜跓晒舛縋CR基因表達(dá)檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)共分為8組： BMECs、BMECs/UCMSCs、BMECs+AG、BMECs/UCMSCs+AG、B M E C s+L Y、B M E C s/U C-M S C s+L Y、BMECs+AG+LY、BMECs/UC-MSCs +AG+LY，每組均3個(gè)平行處理，均置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)，培養(yǎng)液均為無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基（Serum Free Medium，SFM）。

1.3 IGF-Ι、CSN2、CSN3含量測(cè)定 采用雙抗體夾心法測(cè)定上述各組上清中IGF-Ι、CSN2、CSN3濃度水平，方法按照ELISA試劑盒（上海博谷生物科技有限公司）說明書進(jìn)行。

1.4 基因轉(zhuǎn)錄相對(duì)定量測(cè)定 參照試劑盒說明書（LN-0108A，上海諾倫生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司）提取各組細(xì)胞總RNA，全自動(dòng)酶聯(lián)免疫分析儀測(cè)出RNA濃度以及OD260/280，以提取的總RNA為模板，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書（10 μL，37℃15 min、85℃ 5 s）合成cDNA。乳蛋白關(guān)鍵基因CSN2、CSN3和主要信號(hào)通路關(guān)鍵分子PI3K、AKT、mTOR基因序列均從GenBank中獲取，引物用Primer5.0軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)，由上海博古生物科技有限公司合成，引物信息詳見表1。PCR按20 μL反應(yīng)體系進(jìn)行，反應(yīng)條件為95℃ 30 s變性，95℃5 s，60℃ 31 s，50個(gè)循環(huán)，上機(jī)自動(dòng)分析熒光信號(hào)并將其轉(zhuǎn)換Ct值，采用 ΔΔCt法分析，以磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）為內(nèi)參基因計(jì)算各目的基因mRNA相對(duì)定量值（2-ΔΔCt）。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析 數(shù)據(jù)用SPSS 18.0軟件進(jìn)行ANOVA方差分析，差異顯著時(shí)采用Duncan's法對(duì)各組間平均數(shù)進(jìn)行多重比較，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Elisa檢測(cè)結(jié)果 實(shí)驗(yàn)組IGF-Ι含量極顯著高于對(duì)照組（P＜0.01），AG1024處理組極顯著降低IGF-Ι含量（P＜0.01），BMECs/ UC-MSCs+AG1024組IGF-Ι含量極顯著高于BMECs+AG1024組（P＜0.01）（圖1）；實(shí)驗(yàn)組CSN2、CSN3含量極顯著高于對(duì)照組（P＜0.01），AG1024和LY294002處理組CSN2、CSN3的合成量均極顯著低于處理前（P＜0.01），BMECs/UC-MSCs+AG組極顯著高于BMECs+AG組（P＜0.01），BMECs/UC-MSCs+LY組極顯著高于BMECs+LY組（P＜0.01），BMECs/UC-MSCs+AG+LY組顯著高于BMECs+AG+LY組（P＜0.05）（圖2）。

表1 引物序列

圖1 AG1024對(duì)BMECs中IGF-I含量的影響

圖2 AG1024和LY294002對(duì)BMECs中CSN2、CSN3合成量的影響

2.2 RT-qPCR鑒定結(jié)果 表2數(shù)據(jù)顯示，各樣本RNA濃度均在200～400 ng/μL，OD260/280均在1.8～2.2，表明總 RNA 純度較高，并且有足量的RNA用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)；各基因RT-qPCR擴(kuò)增圖譜顯示（圖3），Ct值是反映體系中熒光信號(hào)達(dá)到閥值時(shí)經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，熔解曲線顯示（圖3），基線平穩(wěn)，表明PCR產(chǎn)物單一，能準(zhǔn)確定量目的基因mRNA的表達(dá)量。

表2 各組細(xì)胞樣品的總RNA濃度和純度

圖3 各基因擴(kuò)增圖譜和熔解曲線

2.3 AG1024和LY294002對(duì)乳蛋白合成和信號(hào)通路關(guān)鍵基因表達(dá)的影響 定量結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組PI3K、AKT、mTORmRNA表達(dá)豐度均極顯著高于對(duì)照組（P＜0.01），AG1024和LY294002處理組均極顯著下調(diào)各項(xiàng)基因表達(dá)豐度（P＜0.01）（圖4）；各組細(xì)胞中CSN2、CSN3mRNA的表達(dá)，實(shí)驗(yàn)組最高，顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），AG1024和LY294002單獨(dú)處理組均顯著低于處理前（P＜0.05），BMECs+AG+LY組較對(duì)照組相比極顯著下調(diào)（P＜0.01），BMECs/UC-MSCs+AG+LY組較實(shí)驗(yàn)組相比顯著下調(diào)（P＜0.05），不同處理方案的實(shí)驗(yàn)組均顯著高于同處理的對(duì)照組（P＜0.05）（圖5）。

3 討 論

前期實(shí)驗(yàn)已證實(shí)，UC-MSCs、BMECs均可分泌IGF-Ι，無血清共培養(yǎng)條件下，UC-MSCs能夠顯著提高BMECs中IGF-Ι、IGF-Ι R mRNA表達(dá)。研究結(jié)果表明，UC-MSCs可分泌IGF-I等多種細(xì)胞因子，通過自分泌、旁分泌作用影響其他組織[10]；Tucker[11]研究發(fā)現(xiàn)，離體的BMECs能夠分泌IGF-Ι，且能夠表達(dá)IGF-Ι R。本實(shí)驗(yàn)ELISA結(jié)果顯示，共培養(yǎng)后BMECs中IGF-Ι含量極顯著高于單純BMECs組，驗(yàn)證了與UC-MSCs共培養(yǎng)可提高BMECs的IGF-Ι表達(dá)分泌量，而本研究證實(shí)了Burgos等[12]外源添加IGF-Ι可促進(jìn)BMECs乳蛋白合成的研究結(jié)果 。IGF-Ι R抑制劑顯著抑制IGF-Ι、CSN2、CSN3合成的結(jié)果，進(jìn)一步證明了IGF-Ι可促進(jìn)BMECs合成酪蛋白。抑制劑處理后BMECs的CSN2、CSN3mRNA表達(dá)豐度和CSN2、CSN3合成量相吻合。王浩宇等[13]研究發(fā)現(xiàn)，BMECs的CSN2 mRNA表達(dá)豐度隨著IGF-I濃度的增加而上調(diào)；另有報(bào)道，IGF-Ι可提高BMECs的酪蛋白基因表達(dá)[14]，促進(jìn)BMECs乳蛋白的合成。這些均與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，轉(zhuǎn)錄水平說明了IGF-Ι作為一種重要細(xì)胞因子參與了UCMSCs促進(jìn)BMECs的CSN2、CSN3 mRNA表達(dá)，從而促進(jìn)CSN2、CSN3蛋白含量增加，但不同之處在于本實(shí)驗(yàn)并非使用外源添加的IGF-Ι，而是利用Transwell小室判斷UC-MSCs分泌的IGF-Ι對(duì)BMECs的作用，且采用的是無血清培養(yǎng)基，排出了其他外源因子的干擾，因此可以說UC-MSCs對(duì)BMECs乳蛋白合成的調(diào)控作用是由IGF-Ι參與得以實(shí)現(xiàn)。

圖4 AG1024和LY294002對(duì)BMECs中PI3K、AKT、mTOR mRNA表達(dá)的影響

圖5 AG1024和LY294002對(duì)BMECs中CSN2、CSN3mRNA表達(dá)的影響

本研究結(jié)果顯示，與UC-MSCs共培養(yǎng)可以提高BMECs的PI3K、AKT、mTORmRNA表達(dá)，該表達(dá)可被抑制劑極顯著下調(diào)，表明IGF-Ι通過PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。研究發(fā)現(xiàn)，IGF-I與IGF-IR結(jié)合可活化PI3K、AKT和MAPK通路[15]；曾凡星等[16]給大鼠注射IGF-I明顯促進(jìn)mTOR及其上游信號(hào)AKT活性。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，阻斷劑LY294002通過抑制PI3K下調(diào)了其下游信號(hào)分子AKT、mTOR的表達(dá)，且顯著下調(diào)了BMECs中CSN2、CSN3的mRNA表達(dá)，當(dāng)IGF-I和PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路同時(shí)被抑制時(shí)，極顯著下調(diào)了BMECs的CSN2、CSN3 mRNA表達(dá)，而共培養(yǎng)的CSN2、CSN3的合成量以及CSN2、CSN3mRNA表達(dá)豐度較處理的BMECs顯著升高，表明與UC-MSCs共培養(yǎng)可能是通過IGF-I重新激活BMECs中被阻斷的PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路，促進(jìn)BMECs乳蛋白關(guān)鍵基因的表達(dá)，從而促進(jìn)酪蛋白的合成。Morrison[17]通過實(shí)驗(yàn)證明，IGF-Ι在BMECs中是通過增強(qiáng)mTOR信號(hào)途徑促進(jìn)乳蛋白的表達(dá)合成；高海娜等[18]證明了mTOR可以提高CSN1S1和CSN2基因的表達(dá)，促進(jìn)乳蛋白的合成。這提示來源于UC-MSCs的IGF-I與BMECs中IGF-IR結(jié)合活化了PI3K，激活下游信號(hào)分子AKT，活化的AKT引起mTOR的磷酸化，使整個(gè)PI3K/AKT/mTOR信號(hào)表達(dá)增強(qiáng)，從而參與對(duì)CSN2、CSN3mRNA表達(dá)的調(diào)控作用，促進(jìn)BMECs中CSN2、CSN3的合成量。

乳蛋白的合成調(diào)控是一個(gè)極其復(fù)雜的過程，受多條信號(hào)通路的調(diào)控，且UC-MSCs可以分泌除IGF-Ι外的多種細(xì)胞因子，但本實(shí)驗(yàn)只是對(duì)IGF-I和PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路進(jìn)行了檢測(cè)，其他因子和信號(hào)途徑是否參與并不可知，且本實(shí)驗(yàn)并未檢測(cè)PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路的上游、下游及正向、負(fù)向調(diào)控分子，尚不足以揭示其促進(jìn)乳蛋白合成的具體調(diào)控機(jī)理，需進(jìn)一步研究探索。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)初步揭示了UC-MSCs對(duì)BMECs乳蛋白合成的可能作用機(jī)制，即UC-MSCs可能通過IGF-Ι介導(dǎo)PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路，上調(diào)BMECs中CSN2、CSN3的mRNA表達(dá)，促進(jìn)CSN2、CSN3的合成。

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S823.3

A

10.19556/j.0258-7033.2017-05-055

2016-11-21；

2017-02-08

國(guó)家自然科學(xué)基金（31560645）；自治區(qū)科技人才培養(yǎng)項(xiàng)目（GN2015YX014）;中國(guó)博士后基金委；2015年度新疆研究生科研創(chuàng)新項(xiàng)目（XJGRI2015083）

趙艷坤（1990-），女，河南人，博士生，從事反芻動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究，E-mail：452349621@qq.com

* 通訊作者：余雄，E-mail：yuxiong8763601@126.com