胡 平，李國(guó)勤，劉雅麗，陳圓圓，趙婉秋，楊 穎，陶爭(zhēng)榮，盧立志*

（1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，浙江杭州 310021；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，江蘇南京 210095；3.浙江省畜牧技術(shù)推廣總站，浙江杭州 310021）

鴿SPAG6基因多態(tài)性與精子活力、體尺性狀的相關(guān)性研究

胡 平1,2，李國(guó)勤1，劉雅麗3，陳圓圓1,2，趙婉秋1，楊 穎1，陶爭(zhēng)榮1，盧立志1*

（1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，浙江杭州 310021；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，江蘇南京 210095；3.浙江省畜牧技術(shù)推廣總站，浙江杭州 310021）

為探討鴿精子相關(guān)抗原6蛋白（SPAG6）基因單核苷酸多態(tài)性（SNPs）及其與鴿精子活力和體尺性狀之間的關(guān)系，選擇98只12月齡銀王鴿，采用DNA直接測(cè)序法對(duì)SPAG6基因部分片段進(jìn)行SNPs篩選。結(jié)果表明：在SPAG6基因編碼區(qū)和非編碼區(qū)分別發(fā)現(xiàn)2個(gè)和7個(gè)突變位點(diǎn)，其中G26789T位點(diǎn)BB基因型個(gè)體精子活力顯著高于AB基因型（P＜0.05），AA基因型個(gè)體脛長(zhǎng)均值顯著高于BB基因型（P＜0.05）；C16181G和C16336T位點(diǎn)與脛圍顯著相關(guān)（P＜0.05），BB基因型為優(yōu)勢(shì)基因型；T27507C位點(diǎn)AA基因型個(gè)體脛圍均值顯著高于AB基因型（P＜0.05）；T30364C位點(diǎn)3種基因型個(gè)體胸寬差異顯著，其中BB基因型為優(yōu)勢(shì)基因型（P＜0.05）。由此可見，SPAG6基因與精子活力和體尺性狀密切相關(guān)，可以作為銀王鴿精子活力與體尺性狀分子標(biāo)記的候選基因。

鴿：精子相關(guān)抗原6蛋白（SPAG6）；單核苷酸多態(tài)性（ SNPs）；精子活力；體尺性狀

精子相關(guān)抗原6蛋白（Sperm Associated Antigen 6，SPAG6）是一種主要集中在軸絲中心粒上，參與調(diào)控精子發(fā)生、成熟以及受精等反應(yīng)的重要功能蛋白[1-2]。SPAG6基因在哺乳動(dòng)物的神經(jīng)系統(tǒng)、肺、睪丸等組織中均有表達(dá)，其中在睪丸生殖的細(xì)胞中表達(dá)量最高[3]。目前，SPAG6基因的研究基本以小鼠為主。研究表明[4]，SPAG6不僅可以調(diào)節(jié)鞭毛運(yùn)動(dòng)，還與胚胎纖維化密切相關(guān)。當(dāng)SPAG6蛋白缺失時(shí)，小鼠會(huì)出現(xiàn)生殖功能障礙現(xiàn)象[5]。Cooley等[6]發(fā)現(xiàn)SPAG6基因在小鼠的初級(jí)和次級(jí)淋巴細(xì)胞中均有表達(dá)，當(dāng)其缺失會(huì)引起免疫突觸間隙中心體兩極分化和肌動(dòng)蛋白間隙損失從而導(dǎo)致免疫下降。鴿SPAG6基因共有9個(gè)外顯子和8個(gè)內(nèi)含子，基因全長(zhǎng)為39 170 bp（GenBank號(hào)：NW_004973238.1 ）。目前，禽類SPAG6基因鮮有報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)銀王鴿SPAG6基因單核苷酸多態(tài)性（Single Nucleotide Polymorphisms, SNPs）檢測(cè)，分析其多態(tài)性與銀王鴿精子活力和體尺性狀等相關(guān)性，探索和研究SPAG6基因的遺傳變異對(duì)鴿精子活力和體尺性狀的影響，為提高鴿的選育工作效果提供了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 銀王鴿群來自北京霍書林養(yǎng)殖場(chǎng)，常規(guī)飼養(yǎng)。鴿群全程籠養(yǎng)，隨機(jī)選取98只12月齡銀王雄鴿進(jìn)行精子活力以及體尺性狀測(cè)定，空腹12 h后進(jìn)行稱重和翅靜脈采血，血樣以20%EDTA抗凝，-20℃保存，用于抽提DNA。

1.2 精子活力和體尺測(cè)定 正式實(shí)驗(yàn)前先對(duì)150只12月齡銀王雄鴿進(jìn)行采精訓(xùn)練，每只每天訓(xùn)練1 min，連續(xù)訓(xùn)練3 d，隔2 d后進(jìn)行精液采集、活力鑒定和體尺測(cè)量，其中每份精液測(cè)定3次取均值作為實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，具體測(cè)量方法如下：

精子活力：取精液1滴，置于小試管中，用等溫的0.9%生理鹽水進(jìn)行稀釋，以保持精子的正常運(yùn)動(dòng)，在400倍生物顯微鏡下觀察，估測(cè)直線運(yùn)動(dòng)的精子占總精子數(shù)的百分比，以此評(píng)定出活力。精子活力（%）=呈直線前進(jìn)運(yùn)動(dòng)精子數(shù)/總精子數(shù)。

體尺測(cè)定方法參照NY/T823-2004要求進(jìn)行測(cè)定[7]。

1.3 DNA提取與檢測(cè) 用酚-氯仿抽提法提取鴿血液基因組DNA，通過0.8%瓊脂糖凝膠電泳和OD260/OD280比值判斷DNA純度和濃度，并用TE稀釋至最終濃度為60 ng/μL，-20℃保存。

1.4 引物設(shè)計(jì)與合成 用Primer 5和Oligo 6軟件設(shè)計(jì)6對(duì)上下游引物，引物信息見表1，引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

表1 鴿SPAG6基因多態(tài)性檢測(cè)引物

1.5 PCR擴(kuò)增 PCR反應(yīng)體系為50 μL，其中10×Buffer 5.0 μL，MgCl25.0 μL，2 mmol/L dNTPs 1 μL，上下游引物各1.0 μL，模板DNA 50.0 ng，1U Taq DNA聚合酶1.0 μL，加ddH2O補(bǔ)齊體積至50.0 μL。PCR擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性15 s，55℃退火15 s，72℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸3 min。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析 采用Chromas Version 1.62 導(dǎo)出測(cè)序圖譜文件，用DNAMAN比對(duì)序列，找到突變位點(diǎn)，再結(jié)合Chromas圖譜中波峰的顏色及單、雙峰情況，判斷每個(gè)樣本突變情況，生成Excel數(shù)據(jù)表格。利用POPGENE 32-version 1.31.1對(duì)基因型頻率、等位基因頻率、雜合度（He）、有效等位基因數(shù)（Ne）和多態(tài)信息含量（PIC）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，分析Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)。運(yùn)用SPSS 22.0分析突變位點(diǎn)與精子活力和體尺的關(guān)聯(lián)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR產(chǎn)物檢測(cè) 6對(duì)設(shè)計(jì)合成的引物在正常條件下擴(kuò)增出清晰、特異性高的PCR產(chǎn)物，且與預(yù)期目的片段長(zhǎng)度一致（圖1），可進(jìn)行后續(xù)測(cè)序。

圖1 SPAG6基因6個(gè)片段PCR擴(kuò)增

2.2 基因分型 將測(cè)序結(jié)果運(yùn)用Chromas和DNAMAN軟件比對(duì)、分析，在SPAG6基因6個(gè)片段中共檢測(cè)到了9個(gè)突變位點(diǎn)（C16181G、G16202A、C16309T、C16336T、G26789T、T27507C、T30364C、A30376G、A34212G），結(jié)果見表2。

表2 SPAG6基因突變位點(diǎn)等位基因與基因分型分析

2.3 基因型頻率、等位基因頻率和群體遺傳學(xué)分析 分別對(duì)98只銀王鴿個(gè)體SPAG6基因的9個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行群體遺傳學(xué)分析。由表3可知，除了G26789T位點(diǎn)處于低度多態(tài)，其余位點(diǎn)均處于中度多態(tài)；卡方檢驗(yàn)結(jié)果表明，G16202A和C16309T位點(diǎn)偏離Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)（P＜0.05），其他位點(diǎn)均處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)（P＞0.05）。

2.4SPAG6基因SNPs對(duì)精子活力和體尺的影響 根據(jù)SPAG6基因突變檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行個(gè)體SNP分型，采用最小二乘法分析各個(gè)位點(diǎn)不同基因型與12月齡銀王鴿精子活力、體重、體斜長(zhǎng)、龍骨長(zhǎng)、脛圍、脛長(zhǎng)、胸寬、骨盆寬和胸深9個(gè)性狀的關(guān)系，結(jié)果見表4。由于突變位點(diǎn)和性狀較多，表4只列舉了不同基因型個(gè)體差異顯著的性狀。

表3 SPAG6基因多態(tài)位點(diǎn)的遺傳參數(shù)分析

表4 銀王鴿SPAG6基因序列SNPs與精子活力和部分體尺的關(guān)系

由表4可知，G26789T處BB基因型個(gè)體精子活力顯著高于AB基因型（P＜0.05），AA基因型個(gè)體脛長(zhǎng)均值顯著高于BB基因型（P＜0.05）；C16181G和C16336T位點(diǎn)BB基因型個(gè)體脛圍均值顯著高于AA、AB基因型（P＜0.05）；而T27507C位點(diǎn)AA基因型個(gè)體脛圍均值顯著高于AB基因型（P＜0.05）；T30364C位點(diǎn)3種基因型對(duì)胸寬有顯著影響，BB基因型個(gè)體胸寬均值顯著高于AA基因型（P＜0.05）。

3 討 論

本研究在SPAG6基因6個(gè)片段中共檢測(cè)到了9個(gè)突變位點(diǎn)，其中編碼區(qū)中有2個(gè)突變位點(diǎn)，非編碼區(qū)中有7個(gè)突變。有學(xué)者指出非編碼區(qū)雖對(duì)蛋白表達(dá)無直接影響，但是會(huì)通過改變基因轉(zhuǎn)錄效率而影響基因的表達(dá)[8-9]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明編碼區(qū)(C16181G)和非編碼區(qū)(C16336T、G26789T 、T27507C、T30364C)的突變均可影響精子活力和體尺，這可能是由于非編碼區(qū)內(nèi)存在增強(qiáng)或抑制轉(zhuǎn)錄元件影響SPAG6基因轉(zhuǎn)錄，從而改變鴿精子活力和體尺性狀。

目前，SPAG6基因已被證實(shí)與動(dòng)物精液品質(zhì)有顯著影響。Sapiro等[10]發(fā)現(xiàn)當(dāng)小鼠缺乏SPAG6基因時(shí)，其精子活力明顯下降，且存在精子結(jié)構(gòu)形態(tài)異?，F(xiàn)象。這說明SPAG6基因中存在調(diào)節(jié)小鼠精子活力的調(diào)控元件。畢瑜林等[11]研究發(fā)現(xiàn)，北京油雞SPAG6基因C29657T和T23041C與精液量、精子活率和精子畸形率顯著相關(guān)，而與精子活力不存在顯著關(guān)系。胡娟[12]研究表明，油雞SPAG6基因中存在位點(diǎn)與精液品質(zhì)之間具有顯著關(guān)系。本研究發(fā)現(xiàn)，G26789T位點(diǎn)與銀王鴿精子活力有顯著關(guān)系，BB基因型銀王鴿精子活力顯著高于AB基因型，這表明SPAG6基因可能參與和調(diào)控精子運(yùn)動(dòng)過程。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)鴿SPAG6基因9個(gè)突變位點(diǎn)中，2個(gè)位點(diǎn)(G16202A、C16309T)不處于Hardy-Weinberg平衡，其余位點(diǎn)均處于Hardy-Weinberg平衡。多態(tài)信息含量(PIC)是衡量等位基因片段多態(tài)性的理想指標(biāo)，當(dāng)0.5＜PIC＜0.25(中度多態(tài))時(shí)，遺傳變異較大；當(dāng)PIC＜0.25(低度多態(tài))時(shí)，遺傳變異較小。本實(shí)驗(yàn)中所有位點(diǎn)PIC均小于0.5，其中G26789T位點(diǎn)處于低度多態(tài)，其余均處于中度多態(tài)，這表明SPAG6基因在今后遺傳選育中可發(fā)揮較大作用。

體尺性狀是家禽選育中的重要表型性狀，直接或間接影響其生產(chǎn)性能，也是衡量家禽健康的重要指標(biāo)[13]。體尺性狀與其個(gè)體遺傳緊密聯(lián)系，而SPAG6基因通過影響動(dòng)物生殖功能間接改變動(dòng)物遺傳效應(yīng)。目前，還未有關(guān)于SPAG6基因與體尺性狀相關(guān)性的研究。本試驗(yàn)研究了SPAG6基因與銀王鴿體尺之間的關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果顯示C16181G、C16336T、T27507C位點(diǎn)顯著影響銀王鴿脛圍，其中C16181G、C16336T位點(diǎn)有3種基因型，BB基因型個(gè)體脛圍顯著高于AA基因型，而T2750位點(diǎn)的AA基因型為優(yōu)勢(shì)基因。另外，G26789T和T30364C位點(diǎn)突變分別與脛長(zhǎng)和胸寬呈顯著關(guān)系，這說明SPAG6基因可能參與鴿體尺性狀的調(diào)控，C16181G、C16336T、G26789T 、T27507C、T30364C位點(diǎn)可作為鴿體尺性狀的候選分子標(biāo)記位點(diǎn)。

4 結(jié) 論

本研究首次在鴿中研究了SPAG6基因的多態(tài)性并分析其與精子活力和體尺性狀等的相關(guān)性。SPAG6基因的G26789T位點(diǎn)與精子活力顯著相關(guān)，C16181G、C16336T、G26789T、T27507C、T30364C位點(diǎn)與相應(yīng)體尺性狀呈顯著相關(guān)。因此，SPAG6基因G26789T位點(diǎn)可以作為鴿精液品質(zhì)候選分子標(biāo)記位點(diǎn)，且C16181G、C16336T、G26789T 、T27507C、T30364C位點(diǎn)可作為鴿體尺性狀的候選分子標(biāo)記位點(diǎn)。但由于本實(shí)驗(yàn)樣本數(shù)量較少，因此本實(shí)驗(yàn)結(jié)果是否適合其他品種的鴿子還需進(jìn)一步驗(yàn)證。

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Abstract:In order to analyze the correlation between the single nucleotide polymorphisms(SNPs) ofSPAG6and sperm motility, body measurements of pigeon, ninety eight twelve-month-old Silver King Pigeons were screened by DNA direct sequencing .The results showed that two mutation sites were found in coding region and seven mutation sites were found in non-coding region. The genotype BB of the mutation site of G26789T was significantly higher than genotype AB in sperm motility (P＜0.05), tibia length of genotype AA of this site was significantly longer than that of genotype BB (P＜0.05). In addition, the mutation sites of C16181G and C16336T were significantly associated with shank girth, genotype BB was the advantage genotype (P＜0.05). The mutation site of T27507C was correlated to the shank girth, and Genotype AA was significantly higher than genotype BB in shank girth (P＜0.05). The mutation site of G26789T which had three genotypes was significantly related to chest width, and genotype BB was the advantage genotype (P＜0.05). The results indicate thatSPAG6gene is closely related to sperm motility and body measurements, and can be used as a molecular marker for sperm motility and body measurements in marker assisted selection (MAS) for Silver King Pigeon.

Correlation of Single Nucleotide Polymorphisms of Sperm Associated Antigen 6 Gene with Sperm Motility and Body Measurements in Pigeon

HU Ping1,2, LI Guo-qin1, LIU Ya-li3, CHEN Yuan-yuan1,2, ZHAO Wan-qiu1,YANG Ying1,TAO Zhen-rong1, LU Li-zhi1*
(1.Institute of Animal Husbandry and Veterinary Science, Zhejiang Academy of Agricultural sciences, Zhejiang Hangzhou 310021, China; 2.College of Animal Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Jiangsu Nanjing 210095,China; 3.Animal Husbandry Technology Extension Station of Zhejiang Province, Zhejiang Hangzhou 310021, China)

Pigeon; Sperm associated antigen 6(SAG6);Single nucleotide polymorphism (SNPs); Sperm motility; Body measurement

S839.2

A

10.19556/j.0258-7033.2017-05-042

2016-10-09；

2016-11-06

浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院地方科技合作項(xiàng)目（WZ201400 02）；重點(diǎn)科學(xué)技術(shù)研究開發(fā)計(jì)劃（GKZ101503）；湖州市攻關(guān)計(jì)劃農(nóng)業(yè)項(xiàng)目（2016GN07）

胡平（1991-），男，江蘇儀征人，碩士，研究方向?yàn)閯?dòng)物環(huán)境生理營(yíng)養(yǎng)，E-mail: huping0514@foxmail.com

* 通訊作者：盧立志，研究員，碩士生導(dǎo)師，E-mail: lulizhibox @163.com