陳金金趙明霞姜樹曹麗麗趙慶生趙兵王曉東

（1. 中國科學院過程工程研究所生化工程國家重點實驗室，北京 100190；2. 北京林業(yè)大學生物科學與技術學院，北京 100083）

基于rbcL-a和ITS的枸杞鑒別、遺傳關系分析及ITS假基因的發(fā)現(xiàn)

陳金金1趙明霞1姜樹2曹麗麗1趙慶生1趙兵1王曉東1

（1. 中國科學院過程工程研究所生化工程國家重點實驗室，北京 100190；2. 北京林業(yè)大學生物科學與技術學院，北京 100083）

利用rbcL-a及ITS序列作為分子標記，對14個枸杞種或品種及1個偽品白刺進行了真?zhèn)舞b別及遺傳關系分析。CTAB法提取總DNA，用通用引物對rbcL-a和ITS序列擴增、克隆、測序及分析，T克隆解決部分樣品ITS無法成功測序問題。rbcL-a和ITS序列通用引物可在所有樣品中成功擴增，rbcL-a序列全長643 bp，在14個枸杞種或品種中完全一致，與白刺具有45 bp（7%）的堿基變異。ITS序列在14個枸杞種或品種中長度變異范圍為513-692 bp。采用UPGMA法構建系統(tǒng)樹，可區(qū)分白刺與枸杞，黑果枸杞和寧夏枸杞各品種分別聚為兩支，云南枸杞、韓國枸杞及黃果枸杞則聚在寧夏枸杞大分支內(nèi)。rbcL-a序列可有效進行枸杞真?zhèn)舞b別，ITS序列可用于枸杞品種鑒定及遺傳關系分析。此外，本研究首次揭示了枸杞品種及個體內(nèi)的ITS多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)在枸杞中存在ITS假基因這一現(xiàn)象，為未來利用ITS序列進行枸杞系統(tǒng)進化研究提供一些新的參考。

枸杞；鑒別；rbcL-a；ITS假基因

枸杞屬（Lycium L.）在全球約80種，主要分布在南美洲，少數(shù)分布于歐亞大陸。我國產(chǎn)地主要分布于北方，共7種3變種，包括寧夏枸杞（L. barbarum L.）、 枸 杞（L. chinense Mill.）、 柱 筒枸杞（L. cylindricum Kuang et A. M. Lu）、新疆枸杞（L. dasystemum Pojark.）、黑果枸杞（L. ruthenicum Murr.）、截萼枸杞（L. truncatum Y. C. Wang）、云南枸杞（L. yunnanense Kuang et A. M. Lu）、北方枸杞（L. chinense var. potaninii）、黃果枸杞（L. barbarum var. auranticarpum）和紅枝枸杞（L. dasystemum var. rubricaulium）。

寧夏枸杞因具有抗氧化、抗腫瘤、保肝明目、增強免疫、降糖降脂等作用，是我國枸杞屬7個種3個變種中唯一被載入2015版《中國藥典》的枸杞物種［1］。寧夏枸杞屬于典型的異花授粉，基因雜合度高，但由于近年來枸杞繁殖多采用高度自交親和植株及無性擴繁手段，使得枸杞品種的遺傳多樣性降低。寧夏枸杞在長期的栽培過程中，經(jīng)自然雜交、人工雜交和篩選等不斷選育出新品種，如寧杞1-7號、寧菜1號、大麻葉、小麻葉及變種黃果枸杞等，植株和枸杞子的外觀形態(tài)差異較小，種和品種的形態(tài)學鑒別存在困難。由于經(jīng)濟利益驅(qū)動，市場上存在以形態(tài)相似的白刺（Nitraria tangutorum Bobr.）等偽品冒充枸杞銷售的行為。

20世紀80年代以來，分子生物學技術快速發(fā)展，人們認識到直接分析DNA序列信息，可以從根本上避免由表型性狀或成分分析來鑒定種或品種時存在的問題。這種利用一個或少數(shù)幾個DNA片段對物種進行識別鑒定的技術稱為DNA條形碼鑒別技術。rbcL基因是編碼核酮糖-1，5-二磷酸羧化/加氧酶大亞基的，該酶在光合作用及光呼吸中起關鍵作用。rbcL基因高度保守，常用于探索屬、種間的進化關系。由于rbcL基因全長約1 400 bp，不符合標準條形碼長度要求，Kress等［2］選取了rbcL基因中變異最大，且在不同植物中具有廣泛可擴增性的一段約500-600的片段，并命名為rbcL-a，作為DNA條形碼。ITS序列（Internal transcribed spacer）是編碼核糖體RNA的核DNA序列上的轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)，處于rDNA的18S和26S之間，相對保守，作為非編碼區(qū)，它承受的環(huán)境選擇壓力較小，即使變異也以相互獨立的點突變?yōu)橹鳎撎卣魇沟闷錇閷僖韵滤降奈锓N研究提供了便利，具有樣品用量少、鑒定精準等優(yōu)點，目前被廣泛應用于藥用植物的鑒別［3］?；诖?，本研究擬采用分子生物學手段，利用rbcL-a及ITS分子標記對14個枸杞種或品種及其偽品白刺進行品種鑒別和遺傳關系分析，為枸杞真?zhèn)渭捌贩N鑒別，枸杞各種或品種間遺傳關系研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料收集自青海諾木洪農(nóng)場的枸杞產(chǎn)業(yè)園區(qū)，共15份，包括寧夏枸杞的寧杞1-7號、寧菜1號、蒙杞1號和大麻葉共10個品種，寧夏枸杞變種黃果枸杞、黑果枸杞、云南枸杞和韓國枸杞各1份，枸杞偽品白刺1份（表1）。Axygen膠回收試劑盒購買自上海研謹生物科技有限公司，質(zhì)粒載體pMD18-t，大腸桿菌DH5α等均由劉誼蘭博士友情贈與。

表1 供試材料信息

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取 利用Genstar試劑盒進行總DNA提取。

1.2.2 目的基因的克隆和測序 引物序列：通用引物［2，3］，rbcL-a F：5'-ATGTCACCACAAACAGAGACT AAAGC-3'，rbcL-a R：5'-CTTCTGCTACAAATAAGAAT CGATCTC-3'；ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'，ITS5：5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3'。

PCR反應體系（50 μL）：10 nmol/L左右引物各2 μL， 20 ng/μL DNA模板10 μL，ddH2O 11 μL，PCR Master Mix（2X）25 μL。PCR反應程序為94℃預變性5 min；94℃變性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸1 min，35個循環(huán)；72℃延伸5 min，4℃保存。PCR產(chǎn)物利用1%的瓊脂糖凝膠和TAE緩沖液進行電泳檢測，固定電泳功率為12 W，電泳20 min左右，Goldview染色。PCR陽性產(chǎn)物送美吉生物公司進行雙向測序。

1.2.3 T克隆檢測 對于無法順利測通的ITS序列，將其擴增產(chǎn)物利用Axygen膠回收試劑盒進行回收，4℃過夜連接pMD18-t載體，轉(zhuǎn)化E.coli DH5α，37℃培養(yǎng)，12 h后挑取單克隆，經(jīng)PCR驗證陽性后美吉生物公司測序。

1.2.4 序列分析及構建系統(tǒng)發(fā)育樹 將測序結果進行拼接，利用NCBI，將枸杞rbcL-a和ITS序列與已發(fā)表相關屬種植物序列分別進行BLAST同源比對，確定序列邊界。運用Clustal X軟件對不同材料的序列進行對位排列，并進行人工矯正。利用在線軟件 RNAfold WebServer（http://nhjy.hzau.edu.cn/kech/ swxxx/jakj/dianzi/Bioinf4/miRNA/miRNA1.htm） 計 算5.8S區(qū)的最小自由能，并利用MEGA5.0軟件進行序列長度、GC含量及多態(tài)性位點的統(tǒng)計分析。最后采用非加權組平均法（Unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA）構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結果

2.1 rbcL-a序列擴增及測序結果

利用rbcL-a通用引物對15份供試材料的總DNA進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳檢測結果如圖1所示。對以上PCR產(chǎn)物進行測序，測序結果為：白刺和枸杞樣品的rbcL-a序列全長均為643 bp，其中14種枸杞的rbcL-a序列完全一致，白刺與枸杞的rbcL-a序列共有45 bp的堿基差異。序列比對結果如圖2所示。

圖1 枸杞（2-15）及白刺（1）rbcL-a的PCR擴增產(chǎn)物電泳檢測圖

2.2 ITS序列擴增

利用ITS通用引物對15份供試材料的總DNA進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳檢測結果如圖3所示。對以上PCR產(chǎn)物進行測序，其中編號為4、5、7、8、9、10、12、13和15可成功測序。樣品編號為1、2、3、6、11和14的6份樣品存在PCR產(chǎn)物測序無法測通或套峰等現(xiàn)象。為得到這6個樣品的ITS序列，進一步通過T克隆技術進行ITS序列擴增和測序。

2.3 T克隆檢測

樣品1、2、3、6、11和14存在套峰而無法成功測序，初步分析可能是樣品間交叉污染。但重新采集樣品、提取DNA、擴增ITS序列并測序仍存在套峰問題。因此，決定采用T克隆技術進一步研究。將樣品1、2、3、6、11和14擴增得到的ITS序列切膠回收、連接T載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌培養(yǎng)，每個樣品挑選≥10個單菌落，并將PCR陽性菌送測序。測序顯示大部分樣品可成功測序，但也存在高級結構、重復序列及結合問題等導致測序失敗。樣品1共有11個克隆成功測序，樣品2共有10個克隆成功測序，樣品3共有6個克隆成功測序，樣品6共有10個克隆成功測序，樣品11共有9個克隆成功測序，樣品14共有8個克隆成功測序（表2）。

2.4 ITS序列分析

對成功測序的所有樣品ITS序列進行比對及分析，發(fā)現(xiàn)4、5、8、9、10、12、13和15這8個樣品的ITS序列完全一致，序列全長681 bp，其中ITS1長269 bp，ITS2長258 bp，5.8S長154 bp，GC含量分別為65.5%、67.3%、69.4%和55.8%。樣品7為韓國枸杞，與以上枸杞品種ITS序列在ITS2區(qū)僅存在1個堿基的缺失。樣品1、2、3、6、11和14的ITS序列則較為復雜，其ITS序列全長范圍為513-694 bp，平均全長為620.4-684.8 bp。

所有樣品ITS序列長度及GC含量具體數(shù)據(jù)見表2。樣品1（白刺）的序列全長范圍為618-624bp，平均長620.4 bp，GC含量范圍為57.9-58.4%，平均為58.3%；所有枸杞樣品的ITS序列平均全長在628.4-684.8 bp，平均GC含量范圍為62.2-65.6%。這些ITS序列中5.8S區(qū)域長度較為保守，均為一段長154 bp的序列，但樣品2存在兩個長度分別為142和15 bp的序列。

圖2 枸杞（L）與白刺（N）的rbcL-a序列對比圖

圖3 枸杞（2-15）及其偽品白刺（1）ITS序列的PCR擴增產(chǎn)物電泳檢測圖

在6個樣品中均發(fā)現(xiàn)個體植株內(nèi)的ITS序列多態(tài)性。5.8S區(qū)的插入缺失、二級結構最小自由能、序列的GC含量變化等可以幫助判斷ITS假基因的存在。因此，進一步利用在線軟件分析了每一條ITS序列5.8S區(qū)的最小自由能（表3），最小自由能越低表明序列越不穩(wěn)定，更可能為假基因。由表3可知，樣品2的單克隆s2-2和s2-9最小自由能分別是33.1和0.4，明顯低于其他序列，其5.8S序列出現(xiàn)了12 bp和139 bp的大片段缺失，推測這兩條序列為ITS假基因的可能性較大。

進一步對較為復雜的樣品1、2、3、6、11和14進行ITS序列長度及差異位點分析。由表3可知，6個樣品中均存在極高水平的個體植株內(nèi)ITS序列多態(tài)性。其中白刺序列全長為618-624 bp，差異位點為25 bp，黑果枸杞序列全長為513-694 bp，差異位點高達121 bp，黃果枸杞、云南枸杞及寧杞亦存在較大的序列長度差異和位點差異。

2.5 基于ITS序列信息構建系統(tǒng)發(fā)育樹

利用UPGMA法構建基于ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育樹，共72條ITS序列，包括PCR產(chǎn)物成功測序的9種樣品ITS序列及單克隆成功測序的6種樣品63條ITS序列。系統(tǒng)發(fā)育樹如圖4所示，除個別序列外，大部分ITS序列聚類符合樣品信息。所有樣品序列共聚集為3大枝，分別為白刺，黑果枸杞和寧夏枸杞。白刺與枸杞分屬于不同屬，由圖4可見，所有白刺ITS序列聚為一支，很好的與所有枸杞序列分開；黑果枸杞ITS序列完全聚為一支，僅云南枸杞的4號序列由于ITS1和ITS2序列中的部分缺失和突變，與黑果枸杞聚在一起；此外，可以看到大麻葉、寧菜一號、蒙杞一號及黃果枸杞等寧夏枸杞的不同品種或變種與寧杞一至七號聚為一大支，而云南枸杞

和韓國枸杞也聚為此類，說明寧夏枸杞與云南枸杞、韓國枸杞具有較近的遺傳進化關系。以上結果表明，ITS序列雖然存在較大程度的變異，甚至出現(xiàn)假基因，仍可以在一定程度上較為準確地反映枸杞及其偽品的差異，以及不同枸杞品種間的系統(tǒng)發(fā)育關系。

表2 樣品ITS序列長度、GC含量及5.8S區(qū)二級結構自由能

表3 樣品1、2、3、6、11和14的ITS序列長度及差異位點分析

3 討論

3.1 基于rbcL-a和ITS序列的枸杞鑒別

rbcL作為編碼核酮糖-1，5-二磷酸羧化/加氧酶大亞基的表達基因，具有較高的保守性，而其中rbcL-a因其變異較大，在不同植物中具有廣泛可擴增性而成為進行物種鑒別及物種進化關系分析的有利工具。張利民等［4］利用rbcL-a標記對13種苔蘚植物進行研究，該標記能夠明確區(qū)分作為外類群的毛地錢（Dumortiera hirsuta），構建的13種苔蘚類植物的聚類結果與形態(tài)學分析結果一致。本研究中利用rbcL-a標記進行枸杞及其偽品白刺的鑒別，能夠很好地區(qū)分白刺和枸杞。但由于枸杞栽培歷史悠久，所有枸杞rbcL-a序列完全一致。因此，rbcL-a標記僅能用于枸杞與其偽品的鑒別，而無法應用于枸杞屬內(nèi)種及品種的鑒別及親緣關系分析。

由于ITS標記為轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)，在種及品種間存在一定變異，常用于進行種或品種的鑒別。顧選等［5］利用ITS序列結合產(chǎn)地和形態(tài)分析，成功對黑果枸杞及其混偽品小檗科小檗屬植物喀什小檗（Berberis kaschgarica）進行鑒別。本研究中也成功利用ITS序列進行了枸杞與其偽品白刺的真?zhèn)舞b別。

此外，尹躍等［6］利用SRAP和SSR分子標記對35個枸杞品種進行鑒別，結果表明，單一引物對最多僅能進行3-14個品種的鑒別，SSR引物對的最大鑒別率要高于SRAP。這表明，由于許多枸杞品種采用無性繁殖，很多品種間基因差異較小，造成了單一分子標記鑒別的難度。本研究發(fā)現(xiàn)枸杞種內(nèi)ITS序列高度多態(tài)性、假基因的存在以及寧夏枸杞不同栽培品種間ITS序列完全一致，這些問題使得僅利用ITS序列對枸杞屬內(nèi)種或品種進行鑒別的不易。

3.2 枸杞ITS序列假基因

ITS序列在高等植物基因組中高度重復，因不等交換、基因擴增和轉(zhuǎn)換等方式發(fā)生位點間的致同進化，從而使得不同的ITS序列拷貝漸趨一致或完全一致，這是其作為DNA條形碼候選序列的重要原因。但由于高度重復，進化過程中部分序列會發(fā)生功能缺失突變，如插入、缺失或者移碼造成無法正常編碼而形成假基因；或者mRNA轉(zhuǎn)錄物反轉(zhuǎn)錄為cDNA后隨機整合入基因組，且經(jīng)歷長期進化后因隨機突變積累而形成假基因［7］。近年來，在許多植物中均發(fā)現(xiàn)了ITS假基因的存在。馬長樂等［8］詳細介紹了櫟屬中ITS 假基因的曲折發(fā)現(xiàn)過程。2003年，Bailey等［9］在櫟屬的系統(tǒng)學研究中發(fā)現(xiàn)了ITS假基因的存在，對采用ITS序列做進化分析和同源基因致同進化的假設提出了挑戰(zhàn)。研究發(fā)現(xiàn)，在山茶屬中，基于形態(tài)學特征及使用ITS序列構建的系統(tǒng)發(fā)育關系存在明顯沖突［10］。徐穎等［11］認為可能是由于ITS拷貝的多態(tài)性。范文等［12］對1個疑似香港紅茶樣品進行ITS序列擴增，從同一株植物的基因組中擴增得到了74種不同的ITS序列，其中76%為ITS假基因，顯示出了高度的多態(tài)性。

本研究在白刺中檢測到ITS基因的多態(tài)性。范文月［13］在內(nèi)蒙古西部的白刺樣品中同樣檢測到ITS基因的多態(tài)性，推測該現(xiàn)象是由于白刺物種間廣泛雜交或較強基因漸滲引起的。目前，雖然在不同枸杞種或品種中檢測到顯著的ITS序列變異，但尚沒有明確的同一枸杞植株中存在ITS假基因的報道［14-17］。這可能是由于選擇枸杞材料差異、實驗技術方法不同導致。本研究共采集分析了14種枸杞樣品的ITS序列，其中5份樣品中發(fā)現(xiàn)了個體內(nèi)ITS多態(tài)性。為排除DNA污染干擾，除對利用葉片進行DNA提取外，進一步采用種子萌發(fā)嫩芽進行DNA提取及ITS序列擴增，確認實驗結果的準確性。枸杞ITS假基因的首次發(fā)現(xiàn)，是對簡單利用ITS序列單一分子標記進行枸杞屬植物系統(tǒng)進化關系分析的一個提醒。

圖4 基于ITS序列構建的系統(tǒng)發(fā)育樹

3.3 基于ITS序列的枸杞遺傳關系分析

由于枸杞栽培歷史悠久、資源引種和馴化手段多樣，為典型的異花授粉致使種間雜交現(xiàn)象普遍，導致品種多命名亂等現(xiàn)象，因此，借助現(xiàn)代分子遺傳技術開展種質(zhì)資源評價、遺傳關系分析十分必要。石志剛等利用ITS序列分別分析了3種枸杞和寧夏枸杞種下18個品種的遺傳關系，結果表明ITS序列長度變異范圍為559-634 bp，能夠在一定程度上對枸杞資源的整理和分類有所幫助［17］，其研究發(fā)現(xiàn)，寧夏黃葉、品種88028、寧杞2號和百花聚為一支，而寧夏黃果、品種88024、圓果、尖頭圓果、白條、類黃葉、品種240、大麻葉、寧杞1號、小麻葉、品種9001和不育系聚為另一大類。李小剛等［18］借助ITS序列對10種枸杞屬植物進行了親緣關系研究，發(fā)現(xiàn)寧杞3號、寧杞7號、寧杞5號、扁果枸杞、蒙杞1號和品種0901聚為一支，而野生黑果枸杞、品種07-2、寧杞4號及寧杞1號聚為一支。結合本研究聚類分析，可見各聚類結果具有差異，進一步說明由于ITS假基因的存在，可能造成聚類分析結果的較大差異。因此，利用ITS序列作為分子標記對枸杞屬植物進行遺傳進化分析時，應考慮假基因的存在，對進化關系分析結果采取慎重態(tài)度。未來工作中，我們將加大枸杞品種及樣品量，對其ITS假基因及其遺傳信息進行更為廣泛的研究。

4 結論

分子標記rbcL-a可用于區(qū)分枸杞屬及其偽品白刺。在14種枸杞材料中有5種在單個植株內(nèi)發(fā)現(xiàn)ITS序列的高度多態(tài)性，并首次報道了枸杞中ITS假基因的存在?；贗TS序列構建系統(tǒng)發(fā)育樹，白刺單獨聚為一支，黑果枸杞聚為一支，寧杞各品種聚為一支，該聚類結果與植物學分類較一致。

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（責任編輯 李楠）

Identification，Phylogenetic Relationship Analysis of Lycium Based on rbcL-a and ITS Sequence and the Discovery of ITS Pseudogene

CHEN Jin-jin1ZHAO Ming-xia1JIANG Shu2CAO Li-li1ZHAO Qing-sheng1ZHAO Bing1WANG Xiao-dong1
（1. State Key Laboratory of Biochemical Engineering，Institute of Process Engineering，Chinese Academy of Sciences，Beijing 100190；2. College of Biological Science and technology，Beijing Forestry University，Beijing 100083）

Identification and phylogenetic relationship analysis of 14 species or cultivars of Lycium and 1 adulterant of Nitraria tangutorum were studied using rbcL-a and ITS as molecular markers. Total DNA was extracted by CTAB method. With universal primers，rbcL-a and ITS were amplified，cloned，sequenced and analyzed via PCR. T cloning technique was used to deal with the unsuccessful sequencing of ITS sequence of some samples. rbcL-a and ITS sequences with universal primers were amplified successfully in all samples. The lengths of rbcL-a in Lycium and N. tangutorum were 643 bp，and the sequences of rbcL-a were the same in all samples of Lycium，but existed 45 bp variation sites（7%）compared with N. tangutorum. The lengths of ITS in 14 species or cultivars of Lycium ranged from 513 - 692 bp. The UPGMA phylogenetic tree was constructed based on ITS sequence to distinguish samples of Lycium and N. tangutorum well. ITS sequences of L. ruthenicum and L. barbarum were clustered into two groups，respectively. L. yunnanense，L. chinense and L. barbarum var. auranticarpum were classed as the same branch of L. barbarum. The marker of rbcL-a can effectively identify Lycium from its adulterant. The molecular marker of ITS is applicable in variety identification and genetic relationship analysis of Lycium. This study revealed the polymorphism of ITS in L. barbarum L. varieties and individuals for the first time，and the presence of ITS pseudogenes in L. barbarum L.，which offers some new views for systematic evolution research of Lycium using ITS sequence.

Lycium；identification；rbcL-a；ITS；pseudogene

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.05.018

2016-08-16

青海省基本科技計劃項目（2013-N-505）

陳金金，女，博士，研究方向：植物天然產(chǎn)物煉制；E-mail：chenjj1107@126.com

王曉東，男，博士，研究方向：植物天然產(chǎn)物煉制；E-mail：xdwang@ipe.ac.cn