夏洪宇 孔穩(wěn)穩(wěn) 徐蕊 蒼煒 李晶

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，哈爾濱 150030）

利用放線菌酮提高黃素單氧化酶FMO亞細(xì)胞定位的準(zhǔn)確性

夏洪宇 孔穩(wěn)穩(wěn) 徐蕊 蒼煒 李晶

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，哈爾濱 150030）

研究蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位的常規(guī)方法是構(gòu)建由35S啟動子驅(qū)動目的基因與綠色熒光蛋白基因（GFP）融合的表達(dá)載體，在細(xì)胞中瞬時或穩(wěn)定表達(dá)來確定該蛋白質(zhì)在細(xì)胞中的定位。35S啟動子的優(yōu)勢是能夠獲得較強(qiáng)的GFP信號，但同時也可能因為蛋白質(zhì)合成量過大，導(dǎo)致部分蛋白滯留在運(yùn)輸途徑中或出現(xiàn)在其真實(shí)定位以外的區(qū)域。為了解決這一問題，以模式植物擬南芥中黃素單氧化酶FMOGS-OX1為例，利用蛋白質(zhì)抑制劑放線菌酮處理過量表達(dá)FMOGS-OX1-GFP融合蛋白的煙草葉片。結(jié)果表明：未經(jīng)放線菌酮處理的煙草葉片表皮細(xì)胞，細(xì)胞質(zhì)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中均呈現(xiàn)了較強(qiáng)的熒光信號，放線菌酮處理后，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的信號消失，而細(xì)胞質(zhì)則呈現(xiàn)出穩(wěn)定的信號，因此判斷FMOGS-OX1合成后可能是經(jīng)過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞質(zhì)中的。上述結(jié)果證明適當(dāng)?shù)姆啪€菌酮處理，能夠避免強(qiáng)啟動子驅(qū)動報告基因造成的蛋白質(zhì)合成過量的問題，可有效地提高蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位的準(zhǔn)確性。

GFP；FMOGS-OX1；亞細(xì)胞定位；放線菌酮；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)

綠色熒光蛋白（Green fluorescent protein，GFP）是一種發(fā)現(xiàn)于水母、珊瑚等動物體內(nèi)的生物發(fā)光蛋白。當(dāng)綠色熒光蛋白與生物有機(jī)體蛋白相融合時，能夠保持原有活性，其發(fā)光能力不受到影響，在熒光顯微鏡下可以清晰地觀測到融合蛋白的定位、運(yùn)動和活性等情況［1］。由于GFP自發(fā)的熒光較為穩(wěn)定，觀察具有容易操作、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，所以GFP作為報告基因已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用于基因表達(dá)的組織定位及蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位研究中。GFP能夠在不破壞細(xì)胞和化學(xué)染色的情況下直接成像，也可用于活體實(shí)時定位和動態(tài)的研究［2，3］，基于上述原因GFP逐漸成為分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)研究中的一種重要技術(shù)工具［4-7］。盡管GFP熒光蛋白的檢測有很多優(yōu)點(diǎn)，但它并不能像酶一樣能將底物無限加工而使熒光信號放大，GFP在轉(zhuǎn)基因細(xì)胞中要有一定的轉(zhuǎn)錄本和轉(zhuǎn)錄后修飾才能產(chǎn)生成熟的GFP并適量積累才能觀測到細(xì)胞中的熒光信號。如果使用基因的內(nèi)源啟動子可能出現(xiàn)熒光信號水平過低而難以檢測的問題，因此通常采用強(qiáng)啟動子來驅(qū)動GFP融合基因的強(qiáng)烈表達(dá)［8，9］。但由于GFP蛋白合成量過大，有時會導(dǎo)致部分蛋白滯留在運(yùn)輸途徑中（如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或運(yùn)輸囊泡中）或超出內(nèi)源蛋白質(zhì)的真實(shí)定位范圍，對蛋白質(zhì)的準(zhǔn)確定位造成混淆。

放線菌酮（Cycloheximide，CHX）是從灰色鏈霉菌中分離出來的一種化合物，對真核生物蛋白質(zhì)的合成具有顯著的抑制作用，它可作用于80S核糖體，能夠干擾蛋白質(zhì)合成過程中tRNA的移位因而阻礙翻譯過程［10，11］。由于放線菌酮能夠特異性地抑制新蛋白質(zhì)的合成而不影響已經(jīng)合成的蛋白在細(xì)胞內(nèi)的運(yùn)輸，因此常作為蛋白質(zhì)翻譯過程的有效抑制劑，應(yīng)用于蛋白的表達(dá)、細(xì)胞凋亡機(jī)制等代謝調(diào)控方面的研究，并在農(nóng)學(xué)、醫(yī)學(xué)、藥學(xué)和分子生物學(xué)等研究領(lǐng)域中得到了廣泛的應(yīng)用［12，13］。

本研究以黃素單氧化酶（Flavin-containing monooxygenase，F(xiàn)MOGS-OX1）的亞細(xì)胞定位研究為例，用放線菌酮處理過量表達(dá)FMOGS-OX1基因的煙草表皮細(xì)胞，控制FMOGS-OX1的產(chǎn)量，從而獲得了FMOGS-OX1的準(zhǔn)確定位。芥子油苷是一種存在于十字花科植物中與植物生物脅迫抗性密切相關(guān)的次生代謝產(chǎn)物，F(xiàn)MOGS-OX1是芥子油苷合成途徑中的重要側(cè)鏈修飾酶，這種側(cè)鏈結(jié)構(gòu)的修飾對芥子油苷的生物活性有很大的影響［14，15］。本研究討論了放線菌酮在植物蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位研究中的應(yīng)用，旨為提高蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位的準(zhǔn)確性提供技術(shù)方法上的參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 以擬南芥（Arabidopsis thaliana）和煙草（Nicotiana benthamiana）作為實(shí)驗材料。植物生長在溫度為20℃，相對濕度為70%，光合通量為100 μ Ei的植物培養(yǎng)箱中，16 h/8 h光/暗周期條件下培養(yǎng)。

1.1.2 菌株及試劑 大腸桿菌DH5α、農(nóng)桿菌LBA4404、pCAMBIA 2300-35S-C-GFP載體由本實(shí)驗室提供、膠回收試劑盒、iScript cDNA合成試劑盒、DNA Marker DL2000、dNTP、Hotmaster Taq、DNA Ploymerase等購自TAKARA試劑公司。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取與cDNA合成 選取擬南芥幼嫩的葉片提取總RNA，參照Trizol法提取，DNA酶Ⅰ處理后以備用。將提取好的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，cDNA合成具體方法參考 iScript cDNA合成試劑盒。

1.2.2 植物表達(dá)載體的構(gòu)建 構(gòu)建植物表達(dá)載體35S∶FMOGS-OX1-GFP，以上述獲得的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，采用特異性引物5'-GGCTTA AUATGGCACCAACTCAAAACA-CAATC-3'和5'-GGTTTAAUT GATTC GAGGAAATA-AGA AG-3'克隆FMOGS-OX1基因的CDS序列。PCR反應(yīng)體系參照Hotmaster Taq說明書。將FMOGS-OX1基因的編碼區(qū)無終止密碼子的片段，采用USER法［16］克隆到pCAMBIA 2300-35S-C-GFP載體上，構(gòu)建過量表達(dá)FMOGS-OX1和GFP融合基因的植物表達(dá)載體35S∶FMO GS-OX1-GFP，將連接好的產(chǎn)物轉(zhuǎn)入到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于含有卡那霉素的LB培養(yǎng)基中篩選，挑取陽性單克隆菌落PCR鑒定并送去測序，將測序正確的質(zhì)粒用于后續(xù)研究。

1.2.3 農(nóng)桿菌法轉(zhuǎn)化煙草葉片 采用CaCl2法制備農(nóng)桿菌LBA4404 感受態(tài)細(xì)胞，取1 μL 35S∶FMOGSOX1-GFP質(zhì)粒加入農(nóng)桿菌感受態(tài)菌液中，凍融法進(jìn)行轉(zhuǎn)化。挑取農(nóng)桿菌單菌落分別置于含有卡那霉素、鏈霉素和利福平的YEB液體培養(yǎng)基中篩選，于搖床中28℃ 200 r/min振蕩培養(yǎng)過夜，當(dāng)菌液OD600約為0.6時3 000 r/min 離心10 min，棄上清液收集菌體，重懸于農(nóng)桿菌接種緩沖液（4.8 g MES，5 mL1 mol/LMgCl2，乙酰丁香酮120 μm/L，pH值5.6）中，28℃活化3 h后，采用注射器吸入菌液1 mL，將菌液注入待測煙草葉片背面，輕輕的滲入葉片直到看到液體擴(kuò)散，再侵染下一個葉片，具體實(shí)驗方法參考農(nóng)桿菌滲入法［17］。

1.2.4 蛋白合成抑制劑放線菌酮處理 放線菌酮作為一種蛋白合成抑制劑能夠抑制蛋白的從頭合成，實(shí)驗采用5%放線菌酮處理轉(zhuǎn)基因35S∶FMOGSOX1-GFP煙草葉片1 h、3 h、5 h后對比未處理的35S∶FMOGS-OX1-GFP葉片進(jìn)行亞細(xì)胞定位結(jié)果進(jìn)行分析。

1.2.5 GFP檢測 采用農(nóng)桿菌滲入法轉(zhuǎn)化煙草葉片，5 d后檢測葉片表皮細(xì)胞中的熒光信號。圖像采用LeicaSP2型激光共聚焦顯微鏡×20（NA0.7）或×60（NA1.2）倍鏡觀察，對材料進(jìn)行照相采集。在488 nm波長下，光電子倍增調(diào)到525-565 nm范圍內(nèi)檢測GFP。為降低非特異性不規(guī)則噪聲的影響，顯微鏡應(yīng)用xy模式。在364-488 nm的不同光通道內(nèi)，通過掃描采集圖像獲取連續(xù)的圖片。顯微鏡數(shù)據(jù)處理采用Image J。

2 結(jié)果

2.1 基因克隆與表達(dá)載體構(gòu)建

選取擬南芥幼嫩的葉片提取RNA，以反轉(zhuǎn)錄所獲得的cDNA為模板，擴(kuò)增得到FMOGS-OX1基因的CDS全長（圖1），電泳結(jié)果顯示PCR產(chǎn)物條帶位置與目的片段的大小一致，且測序結(jié)果正確。將PCR產(chǎn)物克隆到pCAMBIA 2300-35S-C-GFP載體上（圖2），轉(zhuǎn)入大腸桿菌中，檢測結(jié)果正確，表明35S∶FMOGS-OX1-GFP載體構(gòu)建成功。檢測正確的菌液提取質(zhì)粒，并將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到農(nóng)桿菌中，挑取單菌落進(jìn)行PCR鑒定。鑒定結(jié)果與克隆的目的條帶一致（圖3），保留正確菌液以備煙草轉(zhuǎn)化用。

圖1 FMOGS-OX1基因的擴(kuò)增

2.2 FMOGS-OX1亞細(xì)胞定位的結(jié)果

采用農(nóng)桿菌滲入法將菌液注入煙草葉片，5 d后取瞬時表達(dá)35S∶FMOGS-OX1-GFP 的煙草葉片，通過激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行表皮細(xì)胞的觀察，發(fā)現(xiàn)熒光信號幾乎充滿了整個細(xì)胞，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)清晰可見（圖4-B）。在這種情況下，由于熒光信號過于強(qiáng)烈，很難確定這些位置是否都是FMOGS-OX1行使功能的準(zhǔn)確位置。為了降低熒光信號的強(qiáng)度，我們采用5%放線菌酮對轉(zhuǎn)基因煙草葉片進(jìn)行了不同長度時間（1 h、3 h和5 h）的處理。結(jié)果表明，經(jīng)5%放線菌酮處理1 h后（圖4-C），細(xì)胞內(nèi)整體熒光信號顯著減弱，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的結(jié)構(gòu)仍然清晰可見，處理3 h 后（圖4-D）熒光信號進(jìn)一步減弱，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的信號逐漸消失。由此我們推測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)可能并不是FMOGS-OX1執(zhí)行生理功能的最終位置，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)可能只是負(fù)責(zé)FMOGS-OX1蛋白的修飾或運(yùn)輸。放線菌酮處理后，新蛋白質(zhì)的合成受到了抑制，而滯留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的蛋白質(zhì)經(jīng)修飾被釋放或運(yùn)輸?shù)侥康牡?，因而信號逐漸消失。當(dāng)放線菌酮處理達(dá)到5 h時（圖4-E），內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的熒光信號基本消失，而在細(xì)胞周邊區(qū)域熒光信號顯著加強(qiáng)，且隨著處理時間的延長熒光信號強(qiáng)度和位置趨于穩(wěn)定。

對放線菌酮處理5 h以上的35S∶FMOGS-OX1-GFP葉片表皮細(xì)胞進(jìn)行高倍鏡的觀察發(fā)現(xiàn)（圖4-F），熒光信號主要出現(xiàn)在細(xì)胞邊緣位置，在細(xì)胞內(nèi)部可以清晰觀察到由于液泡的存在而形成的原生質(zhì)索，因此這些熒光信號應(yīng)該是來源于細(xì)胞質(zhì)，在外圍靠近細(xì)胞膜的區(qū)域熒光信號較強(qiáng)烈，可觀察到一些顆粒狀的信號中斷（圖4-G），很可能是懸浮于細(xì)胞質(zhì)中的葉綠體等細(xì)胞器形成的。由于熒光信號沒有呈現(xiàn)明顯的細(xì)胞膜的輪廓，我們推斷FMOGS-OX1應(yīng)該特異性地存在于細(xì)胞質(zhì)中，而且FMOGS-OX1在翻譯以后很可能經(jīng)過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的加工和修飾或是經(jīng)由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)運(yùn)輸釋放到細(xì)胞質(zhì)中行使生理功能。

3 討論

在現(xiàn)代分子生物學(xué)研究中綠色熒光蛋白GFP已經(jīng)成為一個非常重要的報告分子，能夠作為活細(xì)胞探針用于亞細(xì)胞定位的研究。對轉(zhuǎn)基因擬南芥、煙草等植物的研究表明，GFP對植物的生長發(fā)育不會產(chǎn)生毒害，因此采用GFP檢測蛋白的表達(dá)可以適用于活體實(shí)時定位和動態(tài)研究［18-20］。一般通過構(gòu)建目的基因與綠色熒光蛋白相融合的表達(dá)載體，對其進(jìn)行過量表達(dá)，通過對GFP熒光信號的檢測來分析該蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)行使功能的位置［21］。為了研究FMOGS-OX1在細(xì)胞中行使功能的位置，我們構(gòu)建了由CaMV35S啟動子驅(qū)動FMOGS-OX1與GFP融合基因的植物表達(dá)載體35S∷FMOGS-OX1-GFP，在煙草（Nicotiana benthamiana）細(xì)胞中進(jìn)行瞬時表達(dá)。對芥子油苷合成酶FMOGS-OX1進(jìn)行亞細(xì)胞定位研究時發(fā)現(xiàn)，在整個細(xì)胞尤其是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及細(xì)胞質(zhì)中檢測到極強(qiáng)的GFP信號，我們推測很可能由于FMOGS-OX1被過量合成，導(dǎo)致部分蛋白滯留在合成、加工及轉(zhuǎn)運(yùn)的位置上，干擾了對FMOGS-OX1的準(zhǔn)確定位。很難判斷這些信號是否能代表FMOGS-OX1在細(xì)胞中執(zhí)行功能的準(zhǔn)確位置，為了獲得FMOGS-OX1真實(shí)的定位信息，避免信號過強(qiáng)帶來的困擾。我們采用放線菌酮對轉(zhuǎn)35S∷FMOGS-OX1-GFP 的煙草葉片細(xì)胞進(jìn)行了處理，研究結(jié)果表明，經(jīng)放線菌酮的處理，發(fā)現(xiàn)適當(dāng)濃度和時間的放線菌酮處理后，細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的GFP信號逐漸減弱并消失，最后只有細(xì)胞質(zhì)中可持續(xù)檢測到較強(qiáng)的GFP信號，證明FMOGS-OX1是在細(xì)胞質(zhì)中行使功能的。我們推測FMOGS-OX1蛋白合成過程可能需要在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上進(jìn)行修飾、濃縮等步驟，較強(qiáng)的GFP信號出現(xiàn)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等亞細(xì)胞區(qū)域，可能是由于過量的蛋白質(zhì)在運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞質(zhì)之前暫時滯留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，需要在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上進(jìn)行運(yùn)輸，因此大量的熒光信號出現(xiàn)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上。而經(jīng)放線菌酮處理后，新蛋白質(zhì)的合成受到了抑制，而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的蛋白質(zhì)被陸續(xù)運(yùn)輸至細(xì)胞質(zhì)中，因而在細(xì)胞質(zhì)中觀察到了穩(wěn)定的GFP信號。

圖2 35S∶FMOGS-OX1-GFP植物表達(dá)載體構(gòu)建示意圖

圖3 35S∶FMOGS-OX1-GFP載體農(nóng)桿菌菌落PCR鑒定

圖4 放線菌酮處理對35S∶FMOGS-OX1-GFP轉(zhuǎn)基因煙草表皮細(xì)胞中GFP熒光信號的影響

目前，在分子生物學(xué)中采用放線菌酮作為蛋白質(zhì)合成抑制劑處理細(xì)胞來研究蛋白質(zhì)定位及其他特性已經(jīng)逐步被接受。Guirimand等［22］在研究長春花5-磷酸甲羥戊酸激酶，甲羥戊酸5-二磷酸脫羧酶和法尼基二磷酸合成酶的亞細(xì)胞定位時發(fā)現(xiàn)，組成型啟動子驅(qū)動的GFP融合基因表達(dá)信號出現(xiàn)在過氧化物酶體和細(xì)胞質(zhì)中，利用放線菌酮處理后，信號則特異性地呈現(xiàn)在過氧化物酶體中，細(xì)胞質(zhì)中的信號來自于過量合成的無法及時轉(zhuǎn)運(yùn)到過氧化物酶體中的蛋白質(zhì)。此外，他們的研究還發(fā)現(xiàn)，放線菌酮的濃度和處理時間在一定范圍內(nèi)對實(shí)驗結(jié)果沒有影響，不會改變蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞的定位。在本研究中發(fā)現(xiàn)，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的滲入法轉(zhuǎn)化煙草葉片5 d后，用5%的放線菌酮處理5 h以上可以有效地抑制煙草葉片中GFP融合蛋白的過量累積，從而獲得較為適中的熒光信號強(qiáng)度對目標(biāo)蛋白進(jìn)行準(zhǔn)確的亞細(xì)胞定位。這些參數(shù)對其他植物蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位中放線菌酮的應(yīng)用提供了有益的參考。除了用于蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位研究，放線菌酮作為蛋白質(zhì)合成抑制劑還可應(yīng)用于蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的分析，Poutrain等［23］將小長春花中Aux/IAA 蛋白與YFP融合，用放線菌酮處理后觀察生長素誘導(dǎo)該蛋白質(zhì)的降解過程發(fā)現(xiàn)了該蛋白質(zhì)的不穩(wěn)定性。

綜合本次的研究結(jié)果和其他學(xué)者對放線菌酮的不同應(yīng)用，可以證明放線菌酮作為一種高效的蛋白質(zhì)合成抑制劑，在有效阻止新蛋白合成的同時，對已有蛋白質(zhì)的功能不產(chǎn)生明顯的影響，因而可以在蛋白質(zhì)研究中得到廣泛的應(yīng)用。

4 結(jié)論

本研究證明放線菌酮可以作為一種蛋白質(zhì)抑制劑應(yīng)用于蛋白亞細(xì)胞定位的研究中，在蛋白質(zhì)過量表達(dá)的情況下，通過抑制蛋白質(zhì)的合成，避免蛋白質(zhì)定位出現(xiàn)假陽性信號，獲得更為準(zhǔn)確的定位信息。本研究發(fā)現(xiàn)，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的滲入法轉(zhuǎn)化煙草葉片5 d后，用5%的放線菌酮處理5 h以上可以有效地抑制煙草葉片中GFP融合蛋白的過量累積，從而獲得較為適中的熒光信號強(qiáng)度，對目標(biāo)蛋白進(jìn)行準(zhǔn)確的亞細(xì)胞定位。這一結(jié)果為植物中其他蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位的研究提供了參考數(shù)據(jù)。

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（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Improving the Accuracy of FMOGS-OX1Subcellular Localization Using Cycloheximide

XIA Hong-yu KONG Wen-wen XU Rui CANG Wei LI Jing
（Northeast Agricultural University，Harbin 150030）

The conventional method of protein subcellular localization is to build the vector with the expression of fused target gene and green fluorescent protein gene（GFP）driven by 35S promoter. The subcellular localization of the target protein is then determined in the cells transiently expressing the fusion gene. Utilization of 35S promoter will lead to overexpression of the fusion gene and obtaining strong GFP signal. But sometimes the excessively synthesized protein will possibly remain in the transportation organelle or the areas exceeding the native protein location. The aim of this study is to solve this problem in the study of protein subcellular localization. To accurately determine the subcellular localization of Flavin-Containing Monooxygenase 1（FMOGS-OX1）in model plant Arabidopsis，a protein inhibitor，cycloheximide was applied to repress the over-expression of FMOGS-OX1-GFP fusion protein in tobacco epidermal cell. The results showed that before the treatment of cycloheximide，strong GFP signal was presented in both ER and cytosol. While after treated with cycloheximide，GFP signal disappeared in ER but remained in cytosol. This study demonstrated that proper treatment of cycloheximide may effectively avoid the excessive over-expression of the gene driven by 35S and thus is conducive to precisely determine the intercellular position where the protein facilitates its function.

GFP；FMOGS-OX1；subcellular localization；cycloheximide；endoplasmic reticulum

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.05.012

2016-10-28

國家自然科學(xué)基金基礎(chǔ)科學(xué)人才培養(yǎng)基金項目（J1210069），黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項 目（12531003）

夏洪宇，女，碩士，研究生，研究方向：植物學(xué)；E-mail：xiahongyu0708@sina.com

李晶，女，博士，教授，研究方向：植物次生代謝；E-mail：lijing@neau.edu.cn