李雨 趙磊 陳利 周宇荀 李凱 肖君華

（東華大學(xué)化學(xué)化工與生物工程學(xué)院，上海 201620）

利用外源RNA作為內(nèi)參結(jié)合qPCR準(zhǔn)確檢測SF2蛋白RIP富集RNA的效率

李雨 趙磊 陳利 周宇荀 李凱 肖君華

（東華大學(xué)化學(xué)化工與生物工程學(xué)院，上海 201620）

利用實時熒光定量PCR技術(shù)（Real-time Quantitative polymerase chain reaction，qPCR）檢測0.1%甲醛交聯(lián)RNA免疫共沉淀（RNA Immunoprecipitation，RIP）富集SF2蛋白相互作用的RNA效率，為研究可變剪接因子SF2相互作用RNA的富集效率提供準(zhǔn)確的質(zhì)檢方案。采用RIP技術(shù)獲取HeLa細(xì)胞中SF2蛋白相互作用的RNA，等比例加入外源釀酒酵母（BY4741）RNA，并以其β-actin作為內(nèi)參基因，利用qPCR檢測RIP富集SF2蛋白相互作用RNA的效率。結(jié)果顯示，0.1%甲醛交聯(lián)RIP技術(shù)特異性捕獲得到SF2蛋白-RNA復(fù)合物；qPCR技術(shù)檢測陽性基因PABP、Srsf1在SF2抗體捕獲的產(chǎn)物和IgG抗體的產(chǎn)物中相應(yīng)RNA的濃度差異均在60倍以上。利用qPCR技術(shù)，以外源釀酒酵母（BY4741）RNA作為內(nèi)參，能快速、準(zhǔn)確定量檢測RNA的富集效率。

甲醛交聯(lián)免疫共沉淀；內(nèi)參基因；RNA富集；反轉(zhuǎn)錄實時熒光定量PCR

SF2蛋白（Serine/Arginine Splicing Factor 1）是富含絲氨酸、精氨酸SR（Serine/Arginine）蛋白家族的成員之一，作為剪切因子能夠促進(jìn)剪接體的召集和前體mRNA的組成性剪接［1，2］。在人類基因組中，約有94%的前體mRNA可發(fā)生組成性剪接，可使同一前體mRNA分子產(chǎn)生不同剪接體，從而增加了基因表達(dá)的復(fù)雜性和蛋白的多樣性［3］。SF2蛋白作為多功能RNA結(jié)合蛋白廣泛參與mRNA轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控［4］，包括mRNA初級體的剪接、出核、翻譯和降解等生物合成過程［5-9］。因此深入研究SF2蛋白相關(guān)RNA，對進(jìn)一步揭示其生物學(xué)功能具有重要的意義。

RNA免疫共沉淀技術(shù)被廣泛應(yīng)用于蛋白-RNA相互作用的研究［10，11］，將RNA免疫共沉淀技術(shù)與高通量測序技術(shù)相結(jié)合，能夠獲取與目的蛋白所結(jié)合RNA的信息［12］。然而，在已發(fā)表的279個CLIP數(shù)據(jù)集中，經(jīng)過PCR重復(fù)之后有高達(dá)83.8%的CLIP-seq數(shù)據(jù)因捕獲的RNA特異性較差而被舍棄［13］。因此為提高CLIP數(shù)據(jù)的有效性，獲得低背景，高富集效率的RNA樣本，建立高效靈敏的質(zhì)檢方法十分重要。捕獲的RNA樣本中，無法預(yù)測并篩選出穩(wěn)定表達(dá)的基因作為內(nèi)參基因，因此不能直接利用常規(guī)的qPCR進(jìn)行目標(biāo)RNA的定量檢測。目前常采用PCR結(jié)合瓊脂糖電泳技術(shù)的半定量方案檢測RNA是否捕獲［14］，但無法定量檢測RNA的富集效率以及非特異性RNA的富集情況。該質(zhì)控?zé)o法精確預(yù)測文庫構(gòu)建的質(zhì)量，增加了實驗風(fēng)險性。針對此問題我們提出可以在Srsf1抗體捕獲的產(chǎn)物和IgG抗體的產(chǎn)物中等比例引入外源釀酒酵母RNA，并以釀酒酵母RNA的β-actin作為定量內(nèi)參進(jìn)行qPCR檢測目標(biāo)RNA的富集效率。針對引入外源RNA作為內(nèi)參的方法，如Holstege等［15］采用生物素標(biāo)記外源RNA的方法，檢測全基因組的表達(dá)水平；Kanno等［16］利用外源mRNA進(jìn)行絕對定量，但未見在RIP富集效率檢測中利用酵母菌RNA作為內(nèi)參的報道。

本研究針對RIP捕獲SF2蛋白相互作用的RNA為樣本，以釀酒酵母RNA的β-actin作為內(nèi)參，采用qPCR技術(shù)精準(zhǔn)定量檢測目標(biāo)RNA的富集效率。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料 HeLa細(xì)胞；釀酒酵母（BY4741）。

1.1.2 試劑及儀器 RNAiso Plus、Yeast RNAiso Kit試劑購自TaKaRa公司、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自ThermoScientific公司、SuperReal PreMix SYBR Green購自 TIANGEN公司、高糖DMEM培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司、胎牛血清購自美國Gibco公司、SF2抗體、normal IgG抗體均購自Santa cruz公司、Protein A+G Agarose、RIPA lysis buffer等蛋白相關(guān)試劑購自碧云天公司、蛋白酶抑制劑、RNA抑制劑均購自Thermo公司、引物則都由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成純化；非接觸式全自動破碎儀購自Diagenode公司、Nanodrop 2000c超微量分光光度計購自Thermo Fisher Scientific、實時熒光定量 PCR儀購自Applied Biosystems公司；其余常用化學(xué)試劑均購自國藥集團(tuán)。

1.2 方法

1.2.1 酵母RNA的提取 采用RNAiso Plus、Yeast RNAiso Kit進(jìn)行RNA抽提。以Nanodrop 2000c超微量分光光度計和0.1%甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA的質(zhì)量和完整性，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 qPCR檢測外源釀酒酵母RNA 以Srsf1和PABP［17，18］做陽性參照（參考文獻(xiàn)已證明與SF2蛋白相互作用的RNA），PQLC1［17］作為陰性參照；qPCR采用SuperReal PreMix SYBR Green試劑盒，ABI 7500 real-time PCR system 和 7500 System Software-SDS 2.2（Applied Biosystems）分析RNA樣本，反應(yīng)體系和反應(yīng)條件依據(jù)說明書進(jìn)行。

1.2.3 RIP得到SF2蛋白及其靶RNA 采用0.1%甲醛交聯(lián)免疫共沉淀（RNA immunoprecipitation，RIP）技術(shù)，獲取得到以下產(chǎn)物：（1）細(xì)胞裂解上清：總蛋白（Input-pr），總RNA（input-RNA）；（2）RIP上清蛋白（Unbounding-pr）；（3）RIP沉淀：SF2抗體特異性捕獲的SF2蛋白（SF2-ip-pr），RNA（SF2-ip-RNA），IgG抗體吸附的非特異性RNA（IgG-ip-RNA）。以Nanodrop 2000c超微量分光光度計和1% 甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA的質(zhì)量和完整性，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 SDS-PAGE、Western blot、考馬斯亮藍(lán)檢測目標(biāo)蛋白SF2 Input-pr、Unbounding-pr、SF2-ip-pr蛋白樣品在12%的SDS-PAGE上分離得到兩個相同的SDS-PAGE膠，其一轉(zhuǎn)移至PVDF膜，一抗（鼠源）按1∶1 000稀釋比孵育過夜，用辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠二抗室溫孵育1 h，利用ECL發(fā)光試劑盒顯色；其二浸沒在考馬斯亮藍(lán)試劑中染色1 h后用脫色液過夜脫色，均用Image Lab 4.1進(jìn)行分析。

1.2.5 qPCR驗證ip-RNA的富集 SF2-ip-RNA、Ig-G-ip-RNA等比例加入外源釀酒酵母RNA。采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄cDNA，操作步驟依據(jù)說明書進(jìn)行。以Srsf1和PABP做陽性參照，PQLC1作為陰性參照；qPCR采用SuperReal PreMix SYBR Green試劑盒，ABI 7900 real-time PCR system和7900 System Software-SDS 2.2（Applied Biosystems）分析SF2-ip-RNA和IgG-ip-RNA樣本，反應(yīng)體系和反應(yīng)條件依據(jù)說明書進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 外源釀酒酵母RNA中目標(biāo)RNA表達(dá)量的檢測

無水乙醇、沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品、福林酚試劑、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品、DPPH、脫氧核糖、三氯乙酸、PBS、抗壞血酸、TPTZ均為分析純。

qPCR結(jié)果（圖1）顯示，HeLa細(xì)胞中的目標(biāo) RNA Srsf1、β-actin（Hela-actin）、PABP、PQLC1在HeLa細(xì)胞input樣本中高表達(dá)，在釀酒酵母中表達(dá)量和陰性結(jié)果保持一致；而外源酵母RNA中的β-actin（Teast-actin）在釀酒酵母RNA中高表達(dá)，在HeLa細(xì)胞中不表達(dá)。上述結(jié)果表明外源酵母RNA不干擾目的RNA的檢測。

圖1 HeLa內(nèi)源RNA表達(dá)水平

2.2 SF2蛋白富集效率的檢測

Western blot檢測結(jié)果（圖2-A）顯示，ip-beads（ip蛋白和beads偶聯(lián)復(fù)合物）最亮，unbounding-pr樣品中沒有檢測到SF2蛋白；考馬斯染色檢測結(jié)果（圖2-B）顯示，SF2-ip-pr只檢測到一條蛋白，在inputpr總蛋白對應(yīng)有相同條帶，unbounding-pr未檢測到該蛋白，成功捕獲單一目的蛋白。

圖2 Western印記檢測SF2蛋白（A）和考馬斯檢測總蛋白（B）

2.3 陽性基因富集效率的檢測

qPCR的檢測結(jié)果如表1，圖3所示，檢測得到陽性基因Srsf1和PABP在SF2陽性抗體和IgG陰性抗體產(chǎn)物中相差6個Ct值以上，濃度差異可達(dá)60倍以上；而陰性基因PQLC1只相差1.7個Ct值；且檢測基因的溶解曲線如圖3-B所示，檢測基因均為單一產(chǎn)物。

表1 富集RNA表達(dá)量

3 討論

目前研究蛋白-RNA相互作用的常用實驗方法是蛋白交聯(lián)免疫共沉淀結(jié)合高通量二代測序技術(shù)［19，20］。獲得低背景，高特異性，高富集效率的RNA樣本，可提高文庫構(gòu)建的質(zhì)量，降低實驗的風(fēng)險性，顯著降低測序成本，極大地提高生物和技術(shù)的可重復(fù)性，并且可以使低豐度RNA結(jié)合蛋白（RNA-binding proteins，RBPs）和很少靶標(biāo)RNA的RBPs的RBP位點更容易識別，精準(zhǔn)的獲得與目標(biāo)蛋白相互作用的RNA信息［21，22］。qPCR能夠高效靈敏檢測目的RNA的富集，而目的RNA是利用不同抗體（SF2特異性抗體和IgG陰性抗體）捕獲而得，無法篩選出像GAPDH等能夠穩(wěn)定存在于捕獲產(chǎn)物中的基因作為內(nèi)參，則不能利用qPCR進(jìn)行相對定量檢測。因此引入外源RNA作為參考進(jìn)行相對定量，可精準(zhǔn)檢測捕獲的目的RNA的富集。

圖3 富集效率的檢測

本研究結(jié)果顯示，外源釀酒酵母RNA中未檢測出目標(biāo)RNA，說明引入種屬差異大的外源RNA對于目的RNA的檢測沒有影響。同時對陽性基因富集效率的檢測，得到陽性基因Srsf1、PABP［17，18］在SF2陽性抗體和IgG陰性抗體產(chǎn)物中相對濃度差異可達(dá)60倍以上，而陰性基因PQLC1［17］只相差1.7個Ct值，相對濃度差異遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于60倍，表明陽性參照Srsf1、PABP高效富集，說明基于0.1%甲醛交聯(lián)免疫共沉淀成功捕獲與SF2特異性相互作用的低背景RNA。因此，本研究方案引入外源RNA結(jié)合qPCR技術(shù)定量評估RIP富集RNA的質(zhì)量，得到低背景，高特異性，高富集效率的RNA樣本，克服了半定量PCR結(jié)合瓊脂糖電泳技術(shù)無法精確定量檢測RNA富集效率及非特異性RNA富集情況的問題。

4 結(jié)論

本研究利用qPCR技術(shù)，以外源釀酒酵母（BY4741）RNA作為內(nèi)參，能快速、準(zhǔn)確定量檢測RIP-RNA的富集效率。對于改善提升RIP技術(shù)的應(yīng)用具有明顯的價值。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

Accurate Detection Efficiency of SF2 Protein RIP Enriching RNA Using Exogenous RNA as Reference Gene with qPCR

LI Yu ZHAO Lei CHEN Li ZHOU Yu-xun LI Kai XIAO Jun-hua
（Institute of Chemical and Biological Engineering，Donghua University，Shanghai 201620）

Using real-time quantitative polymerase chain reaction（qPCR）to detect the efficiency of SF2 enriching RNA based on 0.1% formaldehyde cross-linking RNA immunoprecipitation（RIP），we aim to provide an accurate detection method for studying the enriching efficiency of flexible splicing factor SF2 interacting with RNA. The RNA interacting with SF2 in HeLa cells was acquired with RIP，then RNA of exogenous yeast（BY474）in the same ratio was added，and the efficiency of RIP enriching RNA interacting with SF2 was measured via qPCR while using β-actin as reference gene. Results showed the RNA-SF2 protein complex was successfully obtained based on 0.1% formaldehyde cross-linking immunoprecipitation. The differences of RNA by positive genes（PABP，Srsf1）achieved 60 folds in SF2 and IgG samples via qPCR. Conclusively，qPCR combined with exogenous yeast（BY474）as reference gene may expeditiously and accurately quantify the RNA-enriched efficiency for SF2.

formaldehyde cross-linking immunoprecipitation；reference genes；RNA enriching；quantitative real-time reverse transcription PCR

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.05.011

2016-10-10

國家自然科學(xué)基金面上項目（31371257），上海市科委關(guān)鍵項目（12140900404，13140900300，15140900500）

李雨，女，碩士研究生，研究方向：生物化學(xué)與分子生物學(xué)；E-mail：dhu.yuli@gmail.com

肖君華，男，教授，研究方向：醫(yī)學(xué)分子遺傳學(xué)；E-mail：xiaojunhua@dhu.edu.cn