滕守振汪海梁海生辛紅佳李圣彥郎志宏

（1. 西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，綿陽(yáng) 621010；2. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，北京 100081）

玉米葉片葉綠素含量的全基因組關(guān)聯(lián)性分析

滕守振1，2汪海2梁海生1，2辛紅佳2李圣彥2郎志宏2

（1. 西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，綿陽(yáng) 621010；2. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，北京 100081）

植物葉片的葉綠素含量與葉片的光合作用效率和產(chǎn)量潛力緊密相關(guān)，因此是作物的一個(gè)重要生理指標(biāo)。但是，目前已克隆的控制葉綠素含量的基因大多來(lái)自擬南芥和水稻，尚不清楚玉米自然群體中哪些基因控制葉片葉綠素含量的變異。本研究發(fā)現(xiàn)玉米苗期第一片葉片的葉綠素含量和吐絲期穗位葉的葉綠素含量高度相關(guān)，且與后者相比具有更高的遺傳力。進(jìn)一步分析了287份玉米自交系的第一片葉的葉綠素含量，利用558 269個(gè)單核苷酸多態(tài)性分子標(biāo)記進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)性分析，獲得9個(gè)顯著關(guān)聯(lián)SNP位點(diǎn)和16個(gè)候選基因。通過(guò)候選基因的序列分析和功能預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)可能和葉綠素含量相關(guān)的基因，包括擬南芥Tic22基因的同源基因和水稻衰老相關(guān)基因SAG12的同源基因。

玉米；葉綠素值；GWAS

玉米（Zea mays）是當(dāng)今世界最重要的糧食作物之一，主要應(yīng)用于食品，飼料和工業(yè)生產(chǎn)。玉米的自然群體具有豐富的表型變異和基因型變異，這就為研究玉米基因型與表型的多樣性關(guān)系提供了極大的便利［1］。確定控制重要農(nóng)藝性狀的自然等位變異，不僅有助于解析重要農(nóng)藝性狀的遺傳基礎(chǔ)，而且可以為分子標(biāo)記輔助育種提供有效的基因資源和分子標(biāo)記［2］，因此具有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。近年來(lái)，關(guān)聯(lián)分析成為解析復(fù)雜數(shù)量性狀遺傳基礎(chǔ)的一個(gè)重要手段［3］。關(guān)聯(lián)分析以自然群體為材料，以連鎖不平衡為基礎(chǔ)［4］，將目標(biāo)性狀的遺傳變異與遺傳多態(tài)性相結(jié)合，可直接鑒定出與表型變異相關(guān)的基因［5］。

葉綠素是綠色植物進(jìn)行光合作用的基礎(chǔ)物質(zhì)，是植物葉片的主要光合色素，是研究玉米生長(zhǎng)特性、生理變化的重要指標(biāo)［6，7］。高等植物包含兩種類型的葉綠素，即葉綠素a和葉綠素b。葉綠素a存在于反應(yīng)中心復(fù)合體上，但是葉綠素b僅存在于天線復(fù)合體上，主要起保護(hù)聚光葉綠素結(jié)合蛋白的作用。另外，葉綠素及其派生物對(duì)光極其敏感，在光照下很容易產(chǎn)生氧自由基，所以植物生長(zhǎng)期間需要精確地調(diào)節(jié)葉綠素的代謝［8］。目前已經(jīng)克隆的控制葉綠素含量的基因大部分來(lái)自水稻和擬南芥。已有文獻(xiàn)報(bào)道，與低產(chǎn)水稻相比，高產(chǎn)水稻擁有更高的葉綠素含量和光合作用速率［9］。在水稻（Oryza sativa）中，Gc基因過(guò)量表達(dá)時(shí)，葉綠素b和葉綠素的含量分別上升了100%和25%［10］，其上位基因DE1的突變會(huì)導(dǎo)致該表型更加明顯［11］。過(guò)表達(dá)植物磺肽素基因（OSpsk3）的轉(zhuǎn)基因水稻比野生型的葉綠素含量提高了2.3倍［12］。近期有研究表明，Ghd7基因通過(guò)下調(diào)葉綠素合成基因降低了葉綠素的含量［13］。在擬南芥中，MYC2/3/4和ANAC019/055/072可以通過(guò)直接上調(diào)葉綠素分解代謝基因來(lái)降低葉綠素含量［14］；NAP-AAO3［15］和 ABF1、ABF2、ABF3［16］可以通過(guò)調(diào)節(jié)ABA的方式間接調(diào)節(jié)葉綠素的含量；而STAY-GREEN1基因則通過(guò)與代謝酶結(jié)合的方式緩解葉綠素的降解［17］；vpp1 基因產(chǎn)物則通過(guò)抵制氧自由基的方式，保護(hù)葉綠體膜，從而阻止葉綠素的進(jìn)一步降解［18］。此外，一些基因通過(guò)調(diào)節(jié)衰老間接控制葉綠素的含量。在煙草和番茄中，異戊烯轉(zhuǎn)移酶基因（ipt）的過(guò)量表達(dá)會(huì)提高細(xì)胞分裂素的含量，延緩衰老以及衰老期間葉綠素的降解［19］；小麥（Triticum aestivum）Tackx4基因編碼細(xì)胞分裂素氧化酶，Tackx4基因的過(guò)表達(dá)會(huì)降低細(xì)胞分裂素的含量并加速衰老，從而加劇葉綠素的降解［20］。由此可見(jiàn)，葉綠素含量是大量基因和多種機(jī)制相互作用的共同結(jié)果。

在玉米中已有研究表明葉片的葉綠素含量是決定玉米的光合作用效率以及產(chǎn)量的重要因素［21，22］。本研究測(cè)量了溫室條件下三葉期自交系玉米第一片葉子的葉綠素含量，也測(cè)量了田間生長(zhǎng)的自交系玉米在成熟期穗位葉的葉綠素含量，發(fā)現(xiàn)二者有正相關(guān)的關(guān)系，且前者的遺傳力更高。因此，本研究進(jìn)一步以 287 份玉米自交系為材料，使用SPAD-502 plus來(lái)測(cè)量玉米第一片葉子的葉綠素值，通過(guò)全基因組關(guān)聯(lián)性分析，解析與玉米葉片葉綠素含量顯著相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性分子標(biāo)記位點(diǎn)，并對(duì)候選基因進(jìn)行分析和功能預(yù)測(cè)，旨在為發(fā)掘控制葉綠素含量的自然變異提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

287份玉米自然群體來(lái)自嚴(yán)建兵教授實(shí)驗(yàn)室；SPAD-502 plus購(gòu)自柯尼卡美能達(dá)公司。

1.2 方法

1.2.1 玉米的種植 共使用287份自交系玉米，每個(gè)自交系種植15棵，每5棵玉米種在一個(gè)小盆里。種植深度為3 cm，然后在上面覆上一層與花盆等高的營(yíng)養(yǎng)土，插上標(biāo)簽牌，放入托盤(pán)中，待種植完成后統(tǒng)一澆水。

1.2.2 玉米的培養(yǎng) 玉米的生長(zhǎng)條件為：28℃，16/8 h光照/黑暗，光照強(qiáng)度為100-150 mEm-2S-1，濕度40%-60%。

1.2.3 玉米葉綠素的測(cè)量 對(duì)于生長(zhǎng)至第3片葉與第2片葉等長(zhǎng)的玉米幼苗，取下其第一片葉，使用儀器SPAD-502 plus測(cè)量第一片葉子的中部。對(duì)于田間生長(zhǎng)的玉米自交系，在玉米植株開(kāi)始吐絲當(dāng)天，測(cè)量穗位葉的中部。對(duì)每片葉子測(cè)量5-10個(gè)數(shù)據(jù)，取平均值記為該葉子的葉綠素值。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理 利用R軟件（版本號(hào)3.3.1）計(jì)算出每個(gè)自交系葉綠素的平均值，使用Tassel 5（版本號(hào)5.2.31）的混合線性模型［23］，進(jìn)行葉綠素含量與單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記位點(diǎn)的關(guān)聯(lián)分析。Pearson相關(guān)系數(shù)的計(jì)算和正態(tài)分布檢驗(yàn)分別采用R語(yǔ)言stats軟件包的cor函數(shù)和shapiro.test函數(shù)（https://www. r-project.org/）。

2 結(jié)果

2.1 玉米苗期第一片葉與吐絲期穗位葉葉綠素含量的相關(guān)性分析和遺傳力分析

本研究首先測(cè)量了103份自交系玉米三葉期第一片葉的葉綠素含量，以及相同玉米材料田間種植條件下吐絲期穗位葉的葉綠素含量，并對(duì)兩個(gè)性狀進(jìn)行相關(guān)性分析和遺傳力分析。如圖1所示，第一片葉和穗位葉的葉綠素含量具有明顯的線性關(guān)系，且相關(guān)性較高（Pearson相關(guān)系數(shù)r=0.74）。此外，如表1所示，與穗位葉的葉綠素含量相比，第一片葉的葉綠素含量具有更高的遺傳力。這說(shuō)明在溫室條件下，玉米第一片葉的葉綠素含量比田間條件下穗位葉的葉綠素含量受環(huán)境影響更小。由于全基因組關(guān)聯(lián)分析需要精確測(cè)量高遺傳力的表型，因此本研究進(jìn)一步對(duì)玉米第一片葉的葉綠素含量進(jìn)行分析。

圖1 第一片葉子與穗位葉葉綠素含量的相關(guān)性分析

表1 第一片葉子與穗位葉葉綠素含量的遺傳力分析

2.2 玉米第一片葉的葉綠素含量在自然群體中的多樣性

玉米的葉綠素含量容易受到環(huán)境的影響，所以本次實(shí)驗(yàn)是在可控的溫室中進(jìn)行。本研究共測(cè)量了287份自交系玉米的葉綠素含量，結(jié)果（圖2）表明葉綠素含量值符合正態(tài)分布，適合作全基因組關(guān)聯(lián)分析。在這些自交系中，5個(gè)葉綠素值最低的自交系是BT1、CIMBL37、CML282、CIMBL117和By4944。5個(gè)葉綠素值最高的自交系是RO8、CIMBL137、GEMS64、GEMS52和GEMS44。這些自交系可以用來(lái)進(jìn)一步研究第一片葉葉綠素值的生理效應(yīng)，也可以作為親本構(gòu)建群體，進(jìn)一步開(kāi)發(fā)分子育種所需的標(biāo)記。這287份自交系可以分為T(mén)ST、NSS、SS和混合型群體，分析各個(gè)亞群體的葉綠素值發(fā)現(xiàn)，SS玉米第一片葉子的葉綠素值平均比NSS高，而NSS玉米的葉綠素值平均比TST高。

圖2 不同亞群自然群體的葉綠素值

2.3 玉米第一片葉葉綠素含量的全基因組關(guān)聯(lián)分析

使用混合線性模型進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析。如表2和圖3所示，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著意義的SNP標(biāo)記位點(diǎn)有9個(gè)（P≤9.09×10-8，P＜ 0.05/n，n=使用的標(biāo)記總數(shù)），其中有5個(gè)SNP位點(diǎn)表現(xiàn)為極其顯著（P≤1.82×10-8，P＜ 0.01/n）。這些SNP位點(diǎn)大部分分布在10號(hào)染色體上，在3號(hào)和5號(hào)染色體上也有分布。

以B73基因組序列為參考，在顯著關(guān)聯(lián)位點(diǎn)上下游6E4 bp尋找候選基因，最終得到16個(gè)候選基因。對(duì)這16個(gè)候選基因進(jìn)行同源分析和功能注釋，結(jié)果如表3所示。

表2 和葉綠素含量顯著相關(guān)的SNP位點(diǎn)

圖3 葉綠素含量全基因組關(guān)聯(lián)分析的曼哈頓圖

表3 16個(gè)候選基因的基本信息

在這些候選基因中，GRMZM2G097959編碼Tic22蛋白。在擬南芥中Tic22蛋白具有將葉綠體蛋白從葉綠體間隙輸入到葉綠體基質(zhì)的功能［24］，該蛋白基因的敲除會(huì)導(dǎo)致擬南芥的葉綠體變小，而且突變體葉綠素含量?jī)H為野生型葉綠素含量的一半［25］。GRMZM2G363926編碼一個(gè)半胱氨酸蛋白酶。在水稻中，該基因的同源基因SAG12負(fù)調(diào)控細(xì)胞的程序性死亡，SAG12基因的突變導(dǎo)致水稻受到環(huán)境脅迫時(shí)，細(xì)胞死亡率顯著升高［26］。這兩個(gè)候選基因和顯著關(guān)聯(lián)SNP在基因組上的相對(duì)位置如圖4所示。GRMZM2G097959位于chr3.S_2451902上游1kb處，GRMZM2G363926在chr10.S_100431934、chr10.S_100431952、chr10.S_100431969、chr10.S_100432171下游約50 kb處。

圖4 候選基因GRMZM2G097959和GRMZM2G363926與顯著關(guān)聯(lián)SNP在基因組上的相對(duì)位置

3 討論

已有研究表明，玉米葉片的葉綠素含量是葉片光合作用速率的一個(gè)重要決定因素。在本研究中，利用287份玉米自交系分析了玉米自然群體中葉綠素含量，發(fā)現(xiàn)葉綠素含量在玉米自然群體中具有高度的多態(tài)性。本研究獲得了9個(gè)和葉綠素含量顯著關(guān)聯(lián)的SNP位點(diǎn)，以及16個(gè)候選基因，但是這些基因的功能目前尚不清楚。功能注釋表明這些候選基因中至少有兩個(gè)基因可能控制著葉綠素含量。

一個(gè)候選基因是GRMZM2G097959。GRMZM2-G097959在擬南芥中的同源基因編碼Tic22蛋白，該蛋白位于葉綠體內(nèi)膜上［24］，主要在早期生長(zhǎng)階段表達(dá)，具有將葉綠體蛋白從葉綠體間隙輸入到葉綠體基質(zhì)的功能。該基因的敲除導(dǎo)致擬南芥在早期生長(zhǎng)階段葉片的變化非常明顯，主要表現(xiàn)為葉綠體變小，而且葉綠素含量?jī)H為野生型葉綠素含量的50%。但是隨著生長(zhǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，突變體與野生型的葉綠素含量趨于一致［25］。我們推測(cè)玉米的GRMZM2G097959基因可能在玉米中也具有相同或相似的生化和生理功能。另一個(gè)候選基因是GRMZM2G363926。該基因在擬南芥中的同源基因是衰老相關(guān)基因12（SAG12），編碼木瓜蛋白酶型的半胱氨酸蛋白酶，該基因只在衰老過(guò)程中誘導(dǎo)表達(dá)，但是它的突變并沒(méi)有影響到擬南芥的表型［27］。但是在水稻中的研究發(fā)現(xiàn)，水稻SAG12基因的突變并不會(huì)影響正常條件下生長(zhǎng)的水稻，當(dāng)水稻受到環(huán)境脅迫時(shí)，該基因突變會(huì)導(dǎo)致水稻細(xì)胞死亡率顯著升高。因此，水稻SAG12基因在脅迫條件下負(fù)調(diào)控細(xì)胞程序性死亡［26］。在下一步研究中，可以利用具有不同單倍型候選基因的玉米品種構(gòu)建雙親群體，通過(guò)連鎖分析驗(yàn)證關(guān)聯(lián)分析的結(jié)果，并利用基因敲除等技術(shù)手段驗(yàn)證候選基因的功能。

4 結(jié)論

本研究通過(guò)全基因組關(guān)聯(lián)分析，解析了玉米第一片葉葉綠素含量的遺傳結(jié)構(gòu)。獲得9個(gè)與葉綠素含量顯著關(guān)聯(lián)的SNP位點(diǎn)以及16個(gè)候選基因。對(duì)候選基因的序列分析和功能預(yù)測(cè)表明其中至少有兩個(gè)基因可能控制著玉米自然群體葉綠素含量的變異。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Genome-wide Association Study of Chlorophyll Content in Maize Leaves

TENG Shou-zhen1，2WANG Hai2LIANG Hai-sheng1，2XIN Hong-jia2LI Sheng-yan2LANG Zhi-hong2
（1. School of Life Science and Engineering，Southwest Science and Technology University，Mianyang 621010；2. Biotechnology Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081）

The chlorophyll content of plant leaves is closely related to photosynthetic efficiency and yield potential，thus it is an important physiological indicator of all crop species. However，currently most cloned genes controlling chlorophyll content are from Arabidopsis and rice，and the genetic basis of natural variation in chlorophyll content in maize is still unclear. In this research it was discovered that the chlorophyll content of the first leaves at the seedling stage was highly correlated with that of ear leaves at silking stage，and the former had a higher heritability than the latter. This study further analyzed the chlorophyll contents of first leaves from 287 maize inbred lines. Genome-wide association study using 558 269 SNP markers revealed 9 SNPs significantly associated with the measured trait，leading to the discovery of 16 candidate genes. Two genes potentially controlling chlorophyll content in maize were identified by sequence analysis and functional annotation of these candidate genes：a homolog of the Arabidopsis Tic22 and a homolog of rice SAG12 relating to aging.

maize；chlorophyll content；GWAS

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.04.013

2016-12-07

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31501325），國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2016YFD0100405）

滕守振，男，碩士，研究方向：生物化學(xué)與分子生物學(xué)；E-mail：tengshouzhen_91@sina.cn

郎志宏，女，研究員，研究方向：玉米功能基因組學(xué)；E-mail：langzhihong@caas.cn