潘 松，陳綺琴，錢學貞，張 松，周 軍

廣東省深圳市光明新區(qū)人民醫(yī)院(深圳518106)

慢病毒介導的Math1基因感染神經(jīng)干細胞研究*

潘 松，陳綺琴，錢學貞，張 松，周 軍

廣東省深圳市光明新區(qū)人民醫(yī)院(深圳518106)

目的:探討慢病毒攜帶目的基因Math1感染神經(jīng)干細胞的適宜條件及其影響。方法:以不同感染復數(shù)(MOI)的慢病毒分別感染神經(jīng)干細胞，確定最適感染條件。無血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，觀察感染效率有無下降。結果:隨著MOI的增加，慢病毒的效率效率逐漸增加；當MOI為10時，感染效率達(83.83±1.49)%。無血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)30 d后，感染效率達(81.27±1.48)%，與繼續(xù)培養(yǎng)前比較無明顯下降(P>0.05)。結論：攜帶目的基因的重組慢病毒可成功感染神經(jīng)干細胞，被感染的神經(jīng)干細胞的生長無明顯改變。

神經(jīng)干細胞(NSC)是一類有向神經(jīng)系統(tǒng)方向分化潛能的，來源于神經(jīng)系統(tǒng)的細胞；可以通過細胞的有絲分裂不斷產(chǎn)生新的子代細胞[1]。研究[2]表明：移植入正常成年大鼠耳蝸內(nèi)的NSC可以存活，并不影響大鼠的聽力和內(nèi)耳毛細胞的靜纖毛、表皮板的形態(tài)。這為NSC作為載體移植入成年大鼠耳蝸提供了理論基礎。

Math1基因屬于堿性螺旋-環(huán)-螺旋(bHLH)轉錄因子家族的一員，是產(chǎn)生耳蝸毛細胞所必須的[3]。研究[4]表明：體外培養(yǎng)的內(nèi)耳橢圓囊斑中支持細胞等被過量表達Math1后多數(shù)可轉化為毛細胞。這為Math1用于毛細胞再生的研究提供了理論基礎。若是能構建以NSC為載體，表達Math1基因的基因工程修飾的NSC，無疑為毛細胞再生的在體研究提供了新的研究手段。本研究通過已成功構建的含有目的基因Math1和報告基因EGFP的重組慢病毒(LV-EGFP-Math1)，感染體外培養(yǎng)的NSC，初步探討重組慢病毒感染NSC的適宜條件和對其生長的影響。

材料與方法

1 動物與試劑 實驗動物購自廣東省醫(yī)學實驗動物中心，懷孕14～19 d的SD大鼠；實驗儀器采用常規(guī)細胞培養(yǎng)相關儀器和顯微鏡等；實驗試劑參照課題組前期的研究報道[5]；質粒、菌株、細胞器、主要酶和試劑具體參照課題組前期的研究報道[6]。

2 實驗方法

2.1 NSC的分離、培養(yǎng)和鑒定：具體參照課題組前期的研究報道[5]。

2.2 Math1重組慢病毒(LV-EGFP-Math1)的構建和鑒定：具體參照課題組前期的研究報道[6]。

2.3 LV-EGFP-Math1感染NSC：①取第3代NSC球，機械吹打和細胞計數(shù)后，以105個細胞/300微升接種于4孔板。②按MOI分別為0、1、5、10分組，依次加入LV-EGFP-Math1并充分混勻，繼續(xù)培養(yǎng)18h 。MOI為慢病毒的TU數(shù)/NSC的細胞數(shù)。

2.4 顯微鏡下觀察并計算感染率：第5天(感染第3天)，熒光顯微鏡觀察EGFP表達的綠色熒光。隨機取5個視野,計數(shù)綠色熒光細胞總數(shù)，同一視野下計數(shù)NSC總數(shù)，以前者/后者計算感染率。

2.5 NSC-LV-Math1-EGFP的繼續(xù)培養(yǎng)：取感染第3天的NSC-LV-EGFP-Math1，繼續(xù)無血清培養(yǎng)30d，按培養(yǎng)時間不同分組觀察NSC生長情況和計算感染率。

結 果

1 NSC-LV-Math1-EGFP的生長和感染率情況見表1。感染第1～4天，可見綠色熒光的表達逐漸增強。從第4天開始，綠色熒光未見表達明顯增強。為盡量避免由于綠色熒光反復激發(fā)造成的熒光衰減，選定感染第3天來觀察LV-EGFP-Math1感染NSC的效率。

表1 不同MOI組的慢病毒感染NSC的感染效率

注：與第1組比較，△P<0.05；與第1、2組比較，*P<0.05；與第3、2、1組比較，#P<0.05

2 NSC-LV-EGFP-Math1的無血清培養(yǎng)的觀察見表2。感染第3天的MOI為10的NSC-LV-EGFP-Math1，以無血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)30d后，鏡下所見的神經(jīng)球綠色熒光表達無明顯減少，約占細胞總數(shù)的(81.27±1.48)%，與感染第3天的感染效率相比無明顯降低(P<0.05)。

表2 培養(yǎng)不同時間的NSC-LV-Math1-EGFP的感染效率

注：兩組感染效率比較，P>0.05

討 論

利用攜帶目的基因的神經(jīng)干細胞移植入體內(nèi)，治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病已日益引起研究者的注意[7]；不僅攜帶的目的基因可以在神經(jīng)干細胞中表達，神經(jīng)干細胞由于其有分化為神經(jīng)元細胞和神經(jīng)膠質細胞的潛能[1]，也可以發(fā)揮其對病變的修復和治療作用。

我們利用慢病毒載體，同時攜帶目的基因Math1基因和報告基因EGFP，由于EGFP和Math1基因整合在同一病毒基因組內(nèi)， EGFP和Math1基因的轉錄和翻譯會同時進行，我們可以通過觀察EGFP的綠色熒光的來確定NSC是否被慢病毒感染，進而評估慢病毒的感染效率和其對宿主細胞的影響。我們發(fā)現(xiàn):隨著MOI值的增加，慢病毒感染效率也逐漸增加，且各組增加比較有顯著性差異；當MOI值為10時，慢病毒感染效率達到80%～90%，已可以滿足后續(xù)細胞移植的實驗要求。對于慢病毒感染效率的評估還可以考慮用流式細胞儀來進行，考慮到流式細胞儀檢測時要求細胞盡量為單個，這對聚集的神經(jīng)球細胞要將之吹打成單細胞來說，操作比較困難，當然我們的后續(xù)研究時要盡量彌補這一部分的數(shù)據(jù)。

為進一步探討感染的目的基因是否能在宿主細胞中長期穩(wěn)定表達，我們繼續(xù)培養(yǎng)NSC-LV-EGFP-Math1一個月后發(fā)現(xiàn):NSC可繼續(xù)很好的生長，其攜帶的綠色熒光蛋白較前無明顯表達減弱，感染效率與一個月前比較無明顯差異，說明慢病毒載體介導的Math1基因對NSC的正常生長無明顯影響并可長期、穩(wěn)定地在NSC中表達。

總之，重組慢病毒LV-EGFP-Math1可以成功感染NSC，適宜MOI值為10，感染后NSC-LV-EGFP-Math1的生長活性無明顯改變，可長期表達Math1基因。

[1] Lee-Kubli CA, Lu P.Induced pluripotent stem cell-derived neural stem cell therapies for spinal cord injury[J].Neural Regen Res, 2015, 10(1):10-16.

[2] Fu Y, Wang S, Liu Y,etal. Study on neural stem cell transplantation into natural rat cochlea via round window[J].Am J Oto，2009, 30(1):8-16.

[3] Yang J, Cong N, Han Z,etal. Ectopic hair cell-like cell induction by Math1 mainly involves direct transdifferentiation in neonatal mammalian cochlea[J]. Neurosci Lett,2013, 549: 7-11.

[4] Shou J,Zheng JL,Gao WQ. Robust generation of new hair cells in the mature mammalian inner ear by adenoviral expression of Hath1[J].Mol Cell Neu，2003,23(2):169-179.

[5] 潘 松，付 勇，劉 強,等.胚胎大鼠海馬源性神經(jīng)干細胞的分離、培養(yǎng)、分化和鑒定[J].陜西醫(yī)學雜志，2011,40(1)：3-6.

[6] 潘 松，付 勇，劉 強，等.Math1基因重組慢病毒的構建及其在293T細胞中的表達[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學雜志，2011,21(4)：412-417.

[7] Zhao Y, Zuo Y, Jiang J,etal. Neural stem cell transplantation combined with erythropoietin for the treatment of spinal cord injury in rats[J]. Exp Ther Med，2016, 12: 2688-2694.

(收稿：2016-06-20)

The study of neural stem cells infected by recombinant lentivirus with Math1

Pan Song, Chen Qiqin, Qian Xuezhen, et al.

Guangming New District People’s Hospital in Shenzhen (Shenzhen 518106)

Objective:To explore suitable condition of NSC infected by lentivirus with Math1, growth of NSC influenced by lentivirus.Methods:To determine suitable infection condition by using lentivirus with different MOI to infect NSC. To explicit whether infected ratio reduced when infected NSC were culture by serum-free medium. Results:With the increase of MOI, infected efficiency gradually increased. Infected efficiency reached(83.83±1.49)% when MOI was 10. After sequentially cultured 30 days, infected efficiency reached(81.27±1.48)% which had no significantly decline compared to 30 days ago.Conclusion:Recombinant lentivirus with target gene could successfully infect neural stem cells, and there has no significant change in the growth of infected NSC.

Stem cells Lentivirus Infection @Lentivirus with Math1

*廣東省深圳市醫(yī)療衛(wèi)生類科技計劃項目(201303252)

干細胞 慢病毒屬 感染 @攜帶目的基因Math1

R392.2

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2017.05.003