張艷敏， 邴婧毓， 周廣騫， 郭文龍

（1內(nèi)蒙古自治區(qū)呼倫貝爾市第二人民醫(yī)院 內(nèi)科，內(nèi)蒙古 呼倫貝爾162650；2佛山市中醫(yī)院，廣東 佛山 528000）

裸鼠鼻咽癌種植瘤微波消融實(shí)驗(yàn)研究

張艷敏1*， 邴婧毓2， 周廣騫1， 郭文龍1

（1內(nèi)蒙古自治區(qū)呼倫貝爾市第二人民醫(yī)院 內(nèi)科，內(nèi)蒙古 呼倫貝爾162650；2佛山市中醫(yī)院，廣東 佛山 528000）

目的 建立裸鼠皮下種植人源鼻咽癌CNE－2模型，模擬姑息性微波消融術(shù)，觀察消融術(shù)后殘瘤組織中反映細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的指標(biāo) （MMP－9）變化狀況。方法 建立裸鼠皮下種植人源鼻咽癌CNE－2動(dòng)物模型，術(shù)后48小時(shí)處死動(dòng)物，解剖腫瘤組織，進(jìn)行HE染色病理檢查以及MMP－9與HSP90免疫組化檢測(cè)，通過(guò)與對(duì)照組比較，觀察消融術(shù)對(duì)鼻咽癌CNE－2腫瘤殘瘤組織MMP－9與HSP90蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果 消融術(shù)后48小時(shí)，與未消融腫瘤組織比較，殘瘤組織MMP－9表達(dá)降低，而HSP90表達(dá)升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P<0.05）。結(jié)論 裸鼠種植瘤消融術(shù)后48小時(shí)的殘癌組織MMP－9表達(dá)降低，提示殘瘤組織侵襲能力可能一過(guò)性減弱；HSP90表達(dá)升高，可能與瘤細(xì)胞受熱刺激應(yīng)激保護(hù)有關(guān)。

鼻咽癌；微波消融；殘瘤；增殖；侵襲

鼻咽癌 （nasopharyngeal carcinoma，NPC）是中國(guó)南方地區(qū)常見(jiàn)惡性腫瘤之一，約50%以上患者確診時(shí)已發(fā)生遠(yuǎn)處淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，其致瘤性和高度轉(zhuǎn)移性是目前鼻咽癌治療最難攻克的難關(guān)。晚期鼻咽癌患者主要出現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移和骨轉(zhuǎn)移［1］，可采用微波凝固熱消融進(jìn)行治療。微波凝固熱消融是近年發(fā)展起來(lái)的一種治療惡性腫瘤的新技術(shù)，具有凝固范圍可靠、療效確切、無(wú)嚴(yán)重并發(fā)癥等特點(diǎn)，日益應(yīng)用于腫瘤治療，但鼻咽癌肝臟轉(zhuǎn)移瘤消融術(shù)后的殘瘤組織細(xì)胞生長(zhǎng)特性是否發(fā)生變化以及如何變化仍無(wú)統(tǒng)一定論。本研究通過(guò)建立裸鼠皮下種植人源鼻咽癌CNE－2模型，模擬姑息性微波消融術(shù)，對(duì)消融術(shù)后殘瘤組織進(jìn)行免疫組化檢測(cè)，觀察殘瘤組織中反映細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的指標(biāo)的變化狀況，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)備與材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)備 微波消融儀器 （南京慶海微波電子研究所），功率范圍為 0～100 W；恒溫水浴箱 （上海之信儀器有限公司）；細(xì)胞培養(yǎng)箱：美國(guó)Thermo二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱；水平離心機(jī) （湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司）。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)材料 ①雌性BALB／C裸鼠6只，4周齡，體重約15～20 g，購(gòu)自廣東省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心；②細(xì)胞株：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人鼻咽癌細(xì)胞株CNE－2；③主要試劑：抗HSP90小鼠單克隆抗體：Abcam，Inc；抗MMP－9抗體：Santa Cruz Biotechnology，Inc；胎牛血清：杭州四季清生物工程材料有限公司；胰蛋白酶（0.25%Trypsin－EDTA）：Gibco Inc；PBS：美國(guó)Hyclone公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組 將6只接種人鼻咽癌CNE-2細(xì)胞的荷人鼻咽癌裸鼠隨機(jī)分成兩組：對(duì)照組 （3只）、實(shí)驗(yàn)組 （3只）。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)步驟 ①細(xì)胞復(fù)蘇：液氮罐取出細(xì)胞凍存管并置于37℃水浴鍋中，均勻搖動(dòng)，細(xì)胞解凍；離心后棄上清液，并加入培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，將培養(yǎng)瓶置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。②細(xì)胞培養(yǎng)：將鼻咽癌CNE-2細(xì)胞置于RPMI-1640培養(yǎng)液中，并放置在5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中。③荷CNE-2鼻咽癌細(xì)胞裸鼠模型建立：待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，對(duì)裸鼠左側(cè)腹股溝-左側(cè)側(cè)腰部皮膚進(jìn)行消毒，距接種點(diǎn)約1～1.5 cm進(jìn)針，皮下注射0.15 mL細(xì)胞懸液 （細(xì)胞細(xì)胞數(shù)1.0×107／mL）。④微波消融：荷瘤裸鼠生長(zhǎng)約3周后，腫瘤長(zhǎng)徑約0.6～0.8 cm，消融功率選用40 W，時(shí)間20 s；消融術(shù)后，荷瘤裸鼠返回動(dòng)物房飼養(yǎng)。⑤腫瘤標(biāo)本病理檢測(cè)：荷瘤裸鼠消融術(shù)后48小時(shí)，處理動(dòng)物（包括對(duì)照組），外科手術(shù)取出腫瘤，石蠟包埋，切片，HE染色，MMP-9和HSP90免疫組織化學(xué)檢測(cè)。⑥免疫組化結(jié)果判定：設(shè)陽(yáng)性對(duì)照及PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。若細(xì)胞核 （或細(xì)胞漿）出現(xiàn)棕褐色物質(zhì)，則為陽(yáng)性細(xì)胞 （MMP-9蛋白表達(dá)主要位于細(xì)胞核，HSP90蛋白表達(dá)主要位于細(xì)胞質(zhì)中）。每個(gè)腫瘤標(biāo)本選取1張白片進(jìn)行免疫組化檢測(cè)，每張切片在高倍光學(xué)顯微鏡 （200×）下隨機(jī)選擇 5個(gè)視野，進(jìn)行陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)。MMP-9和HSP90陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)：陽(yáng)性染色為在細(xì)胞膜或／和胞漿有棕黃色顆粒沉著。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與細(xì)胞膜 （或細(xì)胞漿）的染色程度所占百分比進(jìn)行評(píng)分：著色深 （2分），著色淡 （1分），基本不著色 （0分）；著色細(xì)胞占所計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)百分比：＞50% （3分），26%～50% （2分），5%～25% （1分），＜5% （0分）。最終分?jǐn)?shù) =每張切片著色程度分值 ×著色細(xì)胞百分比分值。最終分?jǐn)?shù)：4分及以上為強(qiáng)陽(yáng)性 （＋＋），2～3分為陽(yáng)性 （＋），0～1分為陰性 （-）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)資料采用兩獨(dú)立樣本秩和檢驗(yàn)，P＜0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 殘癌組織病理觀察

實(shí)驗(yàn)組荷瘤動(dòng)物在進(jìn)行腫瘤姑息微波消融術(shù)后48小時(shí)處死該裸鼠，取出殘余腫瘤，固定包埋。殘余腫瘤消融區(qū)肉眼呈圓錐形，消融邊界清晰，消融炭化區(qū)呈褐色。

光鏡下 （HE染色）可見(jiàn) （見(jiàn)圖1）：①消融區(qū)中央鼻咽癌細(xì)胞形態(tài)消失，間質(zhì)細(xì)胞胞漿紅染，胞核固縮，呈現(xiàn)完全性凝固性壞死。②殘瘤邊緣區(qū)可見(jiàn)鼻咽癌細(xì)胞形態(tài)正常，無(wú)細(xì)胞核固縮表現(xiàn)。

2.2 鼻咽癌殘瘤與對(duì)照組腫瘤組織免疫組化結(jié)果

與未消融的對(duì)照組腫瘤組織 （見(jiàn)圖2B）比較，消融術(shù)后48小時(shí)殘瘤組織 （見(jiàn)圖2A）MMP-9蛋白表達(dá)降低而HSP90蛋白表達(dá)升高： 陰性 （-）視野數(shù)為 18；強(qiáng)陽(yáng)性 （＋＋）視野數(shù)為26。兩獨(dú)立樣本秩和檢驗(yàn)顯示，鼻咽癌種植瘤消融后MMP-9與HSP90蛋白表達(dá)與對(duì)照組比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表1。

圖1 鼻咽癌消融術(shù)后2天殘瘤HE染色 （×200）

圖2 兩種不同處理組織的MMP－9表達(dá) （×400）

表1 鼻咽癌微波消融后殘瘤組織MMP－9與HSP90蛋白表達(dá)與對(duì)照組比較 （n）

3 討論

鼻咽癌為我國(guó)南方地區(qū)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，大多數(shù)患者在就診時(shí)已發(fā)生頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或其它臟器多發(fā)轉(zhuǎn)移，其致瘤性和高度轉(zhuǎn)移性是目前鼻咽癌的治療中最難攻克的難關(guān)。晚期鼻咽癌患者主要出現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移和骨轉(zhuǎn)移，其中肝轉(zhuǎn)移發(fā)生率為10%～36%［2-4］，而發(fā)生肝轉(zhuǎn)移后患者的中位生存期僅3.2個(gè)月，亦有研究［3］表明有一定比例的鼻咽癌患者的死亡原因是肝轉(zhuǎn)移。

微波消融治療的實(shí)質(zhì)為熱療，該療法的原理是通過(guò)提升腫瘤微環(huán)境溫度來(lái)殺傷腫瘤細(xì)胞。熱刺激正常組織細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞時(shí)，會(huì)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生熱休克應(yīng)答，使腫瘤細(xì)胞分泌大量熱休克蛋白。熱休克蛋白對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用主要包括兩個(gè)方面：①腫瘤細(xì)胞發(fā)生初期維持其穩(wěn)定性；②抵抗外界不良刺激。在對(duì)腫瘤組織進(jìn)行微波熱消融治療過(guò)程中，熱休克反應(yīng)有利于保護(hù)腫瘤細(xì)胞，熱休克蛋白幾乎可以從現(xiàn)有的所有治療腫瘤的過(guò)程中發(fā)揮保護(hù)腫瘤細(xì)胞的作用，可以說(shuō)，熱休克蛋白是腫瘤細(xì)胞自身保護(hù)的武器。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，鼻咽癌瘤塊姑息性消融術(shù)后，殘瘤組織的HSP90蛋白表達(dá)增高 （P＜0.05），提示可能與殘余鼻咽癌細(xì)胞受熱刺激后保護(hù)自身、減少外界刺激的傷害有關(guān)。此外，HSP90抑制劑可增強(qiáng)腫瘤對(duì)放射治療的敏感性，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。邵汛帆等［5］的研究對(duì)微波腔內(nèi)熱療聯(lián)合放射治療鼻咽癌原發(fā)灶進(jìn)行觀察，結(jié)果顯示，聯(lián)合治療可提高原發(fā)灶局部控制率。Li等［6］對(duì)18例鼻咽癌肝轉(zhuǎn)移且行微波治療的患者進(jìn)行了回顧性分析，18例患者共24個(gè)肝轉(zhuǎn)移灶，轉(zhuǎn)移瘤大小約1.9～4.2 cm，共給予27次消融術(shù)，治療后22.4個(gè)月的隨訪結(jié)果顯示，4例患者出現(xiàn)新轉(zhuǎn)移灶，其中肝內(nèi)2例，并再次成功行微波治療；3名患者于隨訪期內(nèi)死亡。該研究結(jié)果提示微波消融術(shù)為治療鼻咽癌肝內(nèi)轉(zhuǎn)移瘤的有效方法。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)實(shí)體殘瘤組織進(jìn)行HSP90蛋白免疫組化檢測(cè)，顯示殘瘤組織HSP90蛋白表達(dá)較對(duì)照組顯著增高 （P＜0.05），與細(xì)胞實(shí)驗(yàn)熱浴后48小時(shí)結(jié)果不同，考慮為細(xì)胞實(shí)驗(yàn)處于倍增期，雖然熱刺激后HSP90蛋白表達(dá)很快升高，但經(jīng)過(guò)48小時(shí)后，細(xì)胞已增殖，其基本生物特性已恢復(fù)常態(tài)，故其HSP90蛋白表達(dá)基本恢復(fù)正常。而組織中，細(xì)胞增殖慢，組織受強(qiáng)刺激后，HSP90仍在組織細(xì)胞中，故殘瘤組織HSP90消融后48小時(shí)仍表現(xiàn)為HSP90蛋白高表達(dá)。

MMP-9是基質(zhì)金屬蛋白酶家族成員之一，可降解細(xì)胞外基質(zhì)多種成分，如基底膜主要成分Ⅳ型膠原［7-8］。腫瘤細(xì)胞表達(dá)MMP-9與侵襲轉(zhuǎn)移能力有關(guān)。一項(xiàng)關(guān)于乳腺癌的研究［9］顯示，乳腺癌組織中MMP-9的表達(dá)量與乳腺癌分級(jí)呈密切的正相關(guān)關(guān)系。MMP與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移關(guān)系密切，腫瘤在侵襲過(guò)程中，原發(fā)惡性腫瘤細(xì)胞進(jìn)入與突破血管均需MMP降解血管基底膜，MMP為腫瘤細(xì)胞發(fā)生血源性遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因素。此外，MMP-9在腫瘤組織周?chē)芤喔弑磉_(dá)，提示血管生成的關(guān)鍵步驟與腫瘤侵襲的過(guò)程類(lèi)似。相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究［10-12］顯示，MMP不單單對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)與蛋白進(jìn)行降解，同時(shí)參與細(xì)胞增殖、凋亡、分化及血管生成。MMP通過(guò)降解ECM刺激機(jī)體釋放bFGF，從而刺激血管生成。

本研究中，消融術(shù)后48小時(shí)殘瘤組織與對(duì)照組比較，免疫組織化學(xué)顯示消融后48小時(shí)殘瘤MMP-9表達(dá)降低 （P＜ 0.05），而HSP90表達(dá)升高 （P＜0.05）。因此認(rèn)為殘瘤組織侵襲能力一過(guò)性降低，但是否存在1周或2周后殘瘤組織侵襲能力增強(qiáng)，還有待于進(jìn)一步研究。本研究存在一定的局限性：細(xì)胞蛋白質(zhì)表達(dá)檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)可再增加，有利于動(dòng)態(tài)觀察鼻咽癌CNE-2微波消融術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)殘癌組織中MMP-9與HSP90蛋白表達(dá)情況，有助于更深入觀察殘瘤的生物學(xué)特性。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，消融術(shù)后48小時(shí)殘癌組織MMP-9表達(dá)降低，提示殘瘤組織侵襲能力一過(guò)性減弱的可能；HSP90表達(dá)升高，可能與瘤細(xì)胞受熱刺激應(yīng)激保護(hù)有關(guān)。

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（責(zé)任編輯：常海慶）

Experimental Study on Microwave Ablation of Transplanted Tumor of Nasopharyngeal Carcinoma in Nude Mice

ZHANG Yanmin1*,BING Jingyu2,ZHOU Guangqian1,GUO Wenlong1
(1Department of Internal Medicine,Hulun Buir Second People's Hospital of Inner Mongolia Autonomous Region,Hulun Buir 162650, China;2Foshan Hospital of TCM,Foshan 528000,China;*

ZHANG Yanmin,E-mail:zhym93@163.com)

Objective To establish animal model of CNE-2 in nude mice,to simulate palliative microwave ablation and to observe the changes of invasion marker(MMP-9)in residual tumor after microwave ablation.Methods Animal model of CNE-2 in nude mice was established.The nude mice were sacrificed at 48 hours after microwave ablation for tumor tissue anatomy,HE staining pathological examination,MMP-9 and HSP90 immunohisto-chemistry detection.The effects of ablation on MMP-9 and HSP90 protein expressions in residual tumor of CNE-2 were observed and compared with those of control group.Results Compared with control group,the expression of MMP-9 in residual tumor at 48 hours after ablation decreased,but the expression of HSP90 in residual tumor increased,with statistical differences(P＜0.05).Conclusions 48 hours after ablation,MMP-9 protein expression in residual tumor decreases,which suggests that the invasive ability of remnant tumor decrease transiently;HSP90 protein expression in residual tumor increases,which may be related to tumor cells'stress protection induced by heat stimulation.

Nasopharyngeal carcinoma;Microwave ablation;Residual tumor;Proliferation;Invasion

R739.63

：A

10.3969/j.issn.1674-4659.2017.03.0332

2016－11－21

：2017-01-23

張艷敏 （1962－），女，山東龍口人，本科學(xué)歷，主治醫(yī)師，研究方向：腫瘤內(nèi)科治療。

*通訊作者：張艷敏，E-mail：zhym93@163.com。