劉繼紅，馮小麗

（珠海市第二人民醫(yī)院 產(chǎn)科，廣東 珠海 519000）

RNAi技術(shù)干擾TGF-β/Smads表達(dá)對卵巢癌細(xì)胞株的影響作用

劉繼紅，馮小麗

（珠海市第二人民醫(yī)院 產(chǎn)科，廣東 珠海 519000）

目的 研究RNAi技術(shù)干擾TGF－β／Smads表達(dá)對卵巢癌細(xì)胞株的影響作用。方法 將卵巢細(xì)胞SKOV3細(xì)胞體外培養(yǎng)，隨機(jī)分為對照組、空白載體組和siRNA干擾組。采用免疫組化法比較三組的TGFRβⅠ、TGFRβⅡ、Smad2、Smad3、Smad4、Smad7表達(dá)水平以及細(xì)胞生長速度、凋亡率。結(jié)果 siRNA干擾組的TGFRβⅠ、Smad7表達(dá)水平顯著高于對照組和空白載體組 （P＜0.05），而TGFRβⅡ、Smad2、Smad3、Smad4表達(dá)水平低于對照組和空白載體組 （P＜0.05）。siRNA干擾組接種24 h、48 h和72 h時(shí)的吸光度顯著低于對照組和空白載體組 （P＜0.05）。siRNA干擾組的細(xì)胞凋亡率顯著高于對照組和空白載體組（P＜0.05）。結(jié)論 RNAi技術(shù)可干擾TGF－β／Smads表達(dá)，對卵巢癌細(xì)胞株的生長具有抑制作用。

RNAi；卵巢癌；TGF-β；Smads

卵巢惡性腫瘤是女性生殖器常見的三大惡性腫瘤之一，其病死率居?jì)D科腫瘤的首位，嚴(yán)重威脅婦女的生命和健康［1］。由于卵巢位于盆腔深部，早期病變不容易及時(shí)發(fā)現(xiàn)，一旦出現(xiàn)癥狀，大多數(shù)癌癥已到晚期，即使積極采取手術(shù)及術(shù)后輔助化療，其5年生存率仍然只有25%～30%［2］。因此，必須尋求新的基礎(chǔ)臨床研究途徑，卵巢癌的治療才有可能取得新進(jìn)展。有研究［3］表明，由Smads介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF－β）通路是一條與卵巢癌發(fā)生和發(fā)展相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。本研究通過RNA干擾技術(shù)，研究TGF－β信號通路對卵巢癌的影響，有助于從系統(tǒng)水平上進(jìn)一步揭示卵巢癌發(fā)生和發(fā)展的分子機(jī)制，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

人卵巢漿液性囊腺癌細(xì)胞株SKOV3（上海中科院細(xì)胞庫）；胎牛血清 （上海生工生物）；McCoy＇s 5A培養(yǎng)基 （Oxid公司）；siRNA oligo siRNA （上海生工生物）；lipofectamin 2000轉(zhuǎn)染試劑 （上海生工生物）；鼠抗人、兔抗人單抗 （上海生工生物）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

SKOV3細(xì)胞由含10 μg／mL青霉素、10 μg／mL鏈霉素及10%胎牛血清的McCoy＇s 5A培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 siRNA制備

將人TGFRβⅡ基因序列輸入Ambion公司的siRNA軟件設(shè)計(jì)程序， 給出引物由上海生工生物合成。 引物序列如下：Forward：5＇－GCCAGUACCUCAUGGAUUATT－3＇；Reverse：5＇－UAAUCCAUGAGGUACUGGTCT－3＇。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

將siRNA加入McCoy's 5A培養(yǎng)基稀釋為20 nmol／mL后孵育 5 min，加入 pofecamin 2000再孵育 20 min。將五萬個(gè)SKVO3細(xì)胞接種于24孔板，24 h后轉(zhuǎn)染。

1.2.4 免疫組化

用SP試劑盒進(jìn)行免疫組化，當(dāng)細(xì)胞漿／核中出現(xiàn)棕黃色顆粒則判定為陽性，染色強(qiáng)度分為三級：1級：1分，淡黃色；2級：2分，黃色；3級：3分， 棕黃色。0為陰性， 賦值0分。取5個(gè)視野的平均值為最終得分。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RNAi技術(shù)干擾對卵巢癌細(xì)胞株TGF－β／Smads表達(dá)水平的影響

siRNA干擾組TGFRβⅠ和Smad7表達(dá)水平均顯著高于對照組和空白載體組，TGFRβⅡ、Smad2、Smad3、Smad4表達(dá)水平均低于對照組和空白載體組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05）。見表1。

表1 RNAi技術(shù)干擾對卵巢癌細(xì)胞株TGF－β／Smads表達(dá)水平的影響（±s）

表1 RNAi技術(shù)干擾對卵巢癌細(xì)胞株TGF－β／Smads表達(dá)水平的影響（±s）

組別 siRNA干擾組 空白載體組 對照組Smad2 1.01±0.02 2.54±0.07 1.52±0.05 Smad3 1.18±0.03 3.04±0.06 2.01±0.07 Smad4 1.70±0.05 4.03±0.09 2.01±0.06 Smad7 2.78±0.03 3.00±0.07 2.83±0.02 TGFRβⅠ 3.59±0.04 2.25±0.01 2.51±0.04 TGFRβⅡ 2.45±0.08 3.85±0.02 3.94±0.03

2.2 RNAi技術(shù)干擾對卵巢癌細(xì)胞株生長速度的影響

siRNA干擾組接種24 h、48 h和72 h時(shí)吸光度均顯著低于對照組和空白載體組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05）。見表2。

表2 RNAi技術(shù)干擾對卵巢癌細(xì)胞株生長速度影響 （±s）

表2 RNAi技術(shù)干擾對卵巢癌細(xì)胞株生長速度影響 （±s）

時(shí)間 （h） siRNA干擾組 空白載體組 對照組24 0.204±0.012 0.378±0.021 0.356±0.021 48 0.323±0.021 0.495±0.023 0.511±0.039 72 0.356±0.022 0.814±0.022 0.832±0.035

2.3 RNAi技術(shù)干擾對卵巢癌細(xì)胞株凋亡水平的影響

流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，siRNA干擾組的細(xì)胞凋亡率為（77.5±3.1）%，顯著高于對照組的 （26.3±1.9）%和空白載體組的（27.3±2.0）%， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （t=17.11、16.42，P＜0.05）。

3 討論

卵巢癌的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡述清晰，但毋庸置疑的是，基因表達(dá)的失調(diào)是導(dǎo)致卵巢癌發(fā)生和發(fā)展的重要原因之一。TGF-β／Smads信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑能夠誘導(dǎo)生長抑制和凋亡反應(yīng)。在腫瘤發(fā)生早期，TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對腫瘤生長具有抑制作用；但對進(jìn)展型和晚期腫瘤具有促進(jìn)作用，并能增強(qiáng)其侵襲力和惡性程度［4-5］。TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的配體、受體、細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子Smad蛋白等組成一個(gè)腫瘤抑制通路，通路中任一環(huán)節(jié)異常都可引起信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路紊亂而使細(xì)胞逃避TGF-β介導(dǎo)的生長抑制效應(yīng)［5］，導(dǎo)致多種腫瘤發(fā)生。

張?jiān)破G等［3］的研究證實(shí)，在卵巢癌組織中TGFβR／Smads的表達(dá)存在紊亂，提示TGFβR／Smads在卵巢癌的發(fā)生中可能具有特定作用。因此，通過RNA干擾技術(shù)，研究TGF-β信號通路對卵巢癌發(fā)生、發(fā)展的影響，有助于從系統(tǒng)水平上進(jìn)一步揭示卵巢癌發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制。

本研究結(jié)果顯示，siRNA干擾組TGFRβⅠ、Smad7表達(dá)水平均顯著高于對照組和空白載體組 （P＜0.05），TGFRβⅡ、Smad2、Smad3、Smad4表達(dá)水平均低于對照組和空白載體組（P＜0.05）。王福玲等［6］在對子宮內(nèi)膜樣腺癌組織中 TGFβR／Smads通路各蛋白表達(dá)水平差異的研究中發(fā)現(xiàn)，與正常組織比較，腫瘤組織中的TGFRβⅡ、Smad2、Smad3、Smad4存在過表達(dá)，而 TGFRβⅠ和 Smad7表達(dá)水平降低。在本研究中，RNAi干擾有效地降低了TGFRβⅡ表達(dá)水平，從而影響了整個(gè)通路的蛋白表達(dá)。進(jìn)一步比較三組的細(xì)胞生長速率可知，siRNA干擾組接種24 h、48 h和72 h時(shí)吸光度均顯著低于對照組和空白載體組 （P＜0.05），提示通過降低TGFRβⅡ、Smad2、Smad3、Smad4表達(dá)水平，提高TGFRβⅠ、Smad7表達(dá)水平，可以有效地降低卵巢癌細(xì)胞的生長速率。比較三組的細(xì)胞凋亡率可知，siRNA干擾組的細(xì)胞凋亡率顯著高于對照組和空白載體組 （P＜0.05），進(jìn)一步證實(shí)RNA干擾技術(shù)能夠有效地降低腫瘤的生存能力。

綜上所述，RNAi技術(shù)可干擾TGF-β／Smads表達(dá)，對卵巢癌細(xì)胞株的生長具有抑制作用。

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[6]王福玲,韓雪川,趙興波,等.子宮內(nèi)膜樣腺癌間質(zhì)細(xì)胞和癌細(xì)胞TGFβR/Smads的表達(dá) [J].山東大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版,2008,46(10): 959-962.

（責(zé)任編輯：常海慶）

Effect of RNAi Technique on Ovarian Cancer Cell Lines by Interfering with the Expression of Smads/TGF-β

LIU Jihong,FENG Xiaoli
(Department of Obstetrics,Zhuhai Second People's Hospital,Zhuhai 519000,China)

ObjectiveTo study the effect of RNAi technique on ovarian cancer cell lines by interfering with the expression of TGF-β/Smads.Methods Ovarian SKOV3 cells were cultured in vitro and randomly divided into control group,empty vector group and siRNA interference group.The expression levels of TGFRβⅠ,TGFRβⅡ,Smad2,Smad3,Smad4 and Smad7,and cell growth rate and apoptosis rate were compared among three groups by immunohistochemistry.Results The expression levels of TGFRβⅠ and Smad7 of siRNA interference group were significantly higher than those of control group and empty vector group(P＜0.05),but the expression levels of TGFRβⅡ,Smad2,Smad3 and Smad4 were lower than those of control group and empty vector group(P＜0.05).The absorbance at 24 h, 48 h and 72 h in siRNA interference group were significantly lower than those in control group and empty vector group(P＜0.05).The apoptosis rate of siRNA interference group was significantly higher than those of control group and empty vector group(P＜0.05). Conclusions RNAi technique can interfere with the expression of TGF-β/Smads,so as to inhibit the growth of ovarian cancer cell lines.

RNAi;Ovarian cancer;TGF-β;Smads

R737.31

：A

10.3969/j.issn.1674-4659.2017.03.0330

2016－11－06

珠海市醫(yī)療衛(wèi)生科技計(jì)劃項(xiàng)目 （編號：20161027E030061）

劉繼紅 （1973－），女，河南籍，碩士學(xué)位，主治醫(yī)師，研究方向：圍產(chǎn)醫(yī)學(xué)。