喬學研 陳重 益磋 高文宏 高順記 劉政

·實驗研究·

診斷超聲聯(lián)合微泡對兔VX2腫瘤的血流增強效應

喬學研 陳重 益磋 高文宏 高順記 劉政

目的探討不同機械指數(shù)（MI）的診斷超聲聯(lián)合微泡對兔VX2腫瘤的血流增強效應。方法選取健康雄性新西蘭白兔40只，采用單側大腿內側瘤組織塊接種法接種VX2腫瘤，造模成功后將其隨機分為實驗1組（MI＝0.3）、實驗2組（MI＝0.7）、實驗3組（MI＝1.4）及對照組，每組各10只。抽取0.2ml“脂氟顯”用5.0ml生理鹽水稀釋后經耳緣靜脈通道勻速推入，同時分別經不同機械指數(shù)輻照腫瘤，對照組予以超聲假照，時間均為5min。儲存治療前后動態(tài)造影圖像，并用造影分析軟件分析，記錄峰值強度（PI）和曲線下面積（AUC）。結果實驗1組、實驗3組治療前后PI比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＝0.028、0.018），實驗2組、對照組治療前后PI比較差異無統(tǒng)計學意義（P＝0.994、0.978）；實驗3組治療前后AUC值比較差異有統(tǒng)計學意義（P＝0.009），實驗1、2組及對照組治療前后AUC值比較差異均無統(tǒng)計學意義（P＝0.099、0.497、0.898）。結論低能量診斷超聲（MI＝0.3）聯(lián)合微泡可豐富兔VX2腫瘤血供，高能量診斷超聲（MI＝1.4）可減少血流灌注。

診斷超聲；微泡；血流增強效應；VX2腫瘤，兔

近年低強度超聲聯(lián)合載藥微泡或普通微泡對腫瘤化療的增強作用已有較多研究［1］，但對超聲激勵微泡產生的腫瘤血管效應變化卻少有研究。腫瘤血流灌注的豐富程度直接影響其化療效果［2－3］，其機制可能是腫瘤內低灌注限制了化療藥物的運輸，使藥物在腫瘤內分布不均勻，不能達到有效的治療水平，并且低灌注直接導致乏氧，糖酵解增加使細胞內環(huán)境偏酸性，對一些化療藥物不敏感并使細胞在基因和蛋白質水平發(fā)生改變，產生耐藥現(xiàn)象［4］。前期研究［5-7］顯示，高聲壓（2.6～4.8MPa）治療超聲激勵微泡空化對動物腫瘤微血管可以產生損毀效應，并阻斷腫瘤循環(huán)，而低聲壓（1.0MPa）超聲卻可能刺激兔VX2腫瘤血流灌注增加［8］。為進一步了解不同聲壓的低強度超聲聯(lián)合微泡對腫瘤可能產生的血管效應（即血流灌注變化效應），本研究采用不同強度機械指數(shù)（mechanical index，MI）的診斷超聲聯(lián)合微泡刺激動物腫瘤，旨在探討超聲強度與腫瘤局部血流灌注變化的關系。

材料與方法

一、實驗動物

健康新西蘭白兔40只，雄性，體質量2.0～2.5 kg；VX2腫瘤荷瘤兔1只，均由第三軍醫(yī)大學新橋醫(yī)院實驗動物中心提供。

二、實驗儀器與試劑

1.儀器：使用飛依諾VINNO 70彩色多普勒超聲診斷儀，L-4高頻線陣探頭，頻率4～12MHz；配備微泡超聲空化調控功能（即Vflash功能），具有可變區(qū)域的弱聚焦式超聲發(fā)射功能。CX31光學顯微鏡（奧林巴斯，日本）。

2.試劑：微泡造影劑為第三軍醫(yī)大學新橋醫(yī)院超聲科研制的“脂氟顯”，核心氣體為全氟丙烷，微泡濃度（4～9）×109/m l，98%粒徑＜8μm，平均粒徑2μm。

三、實驗方法

1.動物模型制備：0.30ml/kg速眠新Ⅱ肌注VX2腫瘤荷瘤兔，耳緣靜脈注射2%戊巴比妥鈉（0.2m l/kg）維持麻醉，取仰臥位腹部備皮，無菌剝除腫瘤，剔除周邊結締組織，去中央壞死區(qū)，將新鮮魚肉樣腫瘤組織浸于無菌生理鹽水，分割為1mm3的小塊，接種于40只健康新西蘭白兔后肢內側肌層內，約25 d待腫瘤長至1.0 cm左右時進行下一步實驗。

2.動物分組：將40只荷瘤兔隨機分為4組，即實驗1組（MI=0.3）、實驗2組（MI=0.7）、實驗3組（MI=1.4）及對照組（予以超聲假照），每組各10只。

3.低強度超聲治療：治療前行常規(guī)超聲檢查，測量腫瘤大小，觀察血流情況；然后行超聲造影檢查：團注脂氟顯0.1m l，尾隨1.5m l生理鹽水沖管，數(shù)字化儲存超聲造影圖像。抽取“脂氟顯”0.2m l用5.0ml生理鹽水稀釋，5min內經耳緣靜脈通道勻速推入；同時應用L-4探頭的Vflash模式進行超聲治療，輻照時超聲探頭置于腫瘤體表處，將弱聚焦區(qū)聚焦于腫瘤區(qū)域，注意避免探頭對腫瘤產生壓迫。各組超聲頻率均為4M Hz，脈沖重復頻率20Hz，脈沖寬度18個周期，脈沖時間1.2 s，間歇時間5.0 s，總治療時間5min。對照組予以超聲假照，僅以探頭置于腫瘤表面，時間為5min。超聲治療結束后即刻行超聲造影檢查，“脂氟顯”劑量及注射方法同前。

4.病理學檢查：造影結束后30min取腫瘤邊緣魚肉樣組織，常規(guī)HE染色，光鏡下觀察腫瘤組織結構。

5.超聲造影影像數(shù)據(jù)分析：使用超聲儀器自帶的造影分析功能進行圖像分析，得到治療前后兩次造影的時間-強度曲線，記錄峰值強度（PI）和曲線下面積（AUC）。

四、統(tǒng)計學處理

結果

一、造模結果

本實驗共納入40只荷瘤兔，實驗1、2、3組及對照組移植瘤平均最大徑分別為（1.194±0.231）cm、（1.189±0.172）cm、（1.187±0.288）cm及（1.190±0.231）cm，各組間比較差異均無統(tǒng)計學意義。

二、超聲造影治療情況

超聲治療動物共40只，無死亡及腫瘤破裂等情況出現(xiàn)。

治療前各組移植瘤的血流灌注情況均為動脈相高灌注，部分腫瘤中心可見小部分區(qū)域的充盈缺損，所有腫瘤邊緣區(qū)域均血供豐富。視覺評價前后兩次造影情況：實驗1組中，7只兔治療后腫瘤血供較治療前明顯增加，1只腫瘤血供較治療前減少，其余2只未見明顯變化；實驗2組中，5只兔治療后腫瘤血供較治療前減少，3只腫瘤血供較治療前增加，其余2只未見明顯變化；實驗3組中，7只兔治療后腫瘤血供較治療前減少，1只腫瘤血供較治療前增加，2只無明顯變化；對照組治療前后造影情況無明顯差異。見圖1。

各組治療前后超聲造影參數(shù)PI及AUC比較見表1。各組治療前腫瘤PI比較差異無統(tǒng)計學意義。實驗1組、實驗3組治療前后PI比較差異均有統(tǒng)計學意義（P=0.028、0.018），實驗2組、對照組治療前后PI比較差異無統(tǒng)計學意義（P=0.994、0.978）；實驗3組治療前后AUC值比較差異有統(tǒng)計學意義（P=0.009），實驗1、2組及對照組治療前后AUC比較差異均無統(tǒng)計學意義（P=0.099、0.497、0.898）。各組治療前后PI差值及AUC差值的比較見圖2，3。

圖1 各組治療前后常規(guī)超聲及超聲造影圖

表1 各組治療前后超聲造影參數(shù)PI及AUC比較（±s）

表1 各組治療前后超聲造影參數(shù)PI及AUC比較（±s）

PI：峰值強度；AUC：曲線下面積。

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圖2 各組治療前后PI差值比較

三、病理結果

光鏡下可見各組腫瘤組織中心無壞死或不同程度壞死，有活性的腫瘤組織排列成條索狀，細胞核大深染，表現(xiàn)出明顯的異形性。各組腫瘤病理表現(xiàn)相似，實驗1～3組均未見組織水腫、微小血栓形成及新鮮出血。見圖4。

圖3 各組治療前后AUC差值比較

討論

圖4 各組超聲治療后病理圖（HE染色，圖A1、B1、C1、D1為放大200倍，圖A2、B2、C2、D2為放大400倍）

低強度超聲聯(lián)合微泡治療產生的腫瘤整體血流灌注變化（即血管效應）存在一定的規(guī)律性，但以往研究較少。而臨床上針對不同的腫瘤治療目的需要不同的血流灌注，如射頻消融肝癌需減少產生的熱沉效應，因此需減少肝腫瘤的血流［7］；而多數(shù)以化療作為主要治療方法的腫瘤，則需豐富腫瘤血供，從而增強化療效果［9］。故探索不同超聲強度腫瘤整體血流灌注的變化顯得十分必要。本實驗發(fā)現(xiàn)，實驗1組雖然治療前后AUC比較差異無統(tǒng)計學意義，但治療后AUC明顯增高，分析原因可能是由于樣本量偏少所致，結合治療后的PI及AUC與治療前的PI及AUC差值均數(shù)為正值，可知實驗1組治療后腫瘤血流豐富；實驗3組中，治療前后PI及AUC比較差異均有統(tǒng)計學意義，結合治療前后其差值均數(shù)為負值，可知實驗3組治療后腫瘤血流減少；而實驗2組治療后腫瘤血流表現(xiàn)為豐富、減少、無明顯變化三種狀態(tài)，介于實驗1組和實驗3組之間，表現(xiàn)為治療前后PI與AUC的差值均數(shù)接近于0，而標準差偏大，體現(xiàn)了PI與AUC的變化多樣；對照組治療前后則無明顯變化，差值的均數(shù)與標準差均接近于0，這說明了血管效應的變化具有一定的趨勢，即低MI可刺激腫瘤血供豐富，而高MI則可阻斷腫瘤血供，中等能量的MI產生的血流變化介于兩者之間，這與微泡的使用及超聲發(fā)射能量的變化及其方式的相關參數(shù)有關，且由于個體差異的存在，實驗得到的結果具有一定的隨機性。

此外，本實驗病理結果顯示，與對照組比較，各實驗組超聲治療后均未對腫瘤局部及其周邊組織產生明顯的病理變化，說明本實驗使用的診斷超聲能量水平在治療時間內未產生組織結構改變，是安全的。但本研究僅進行了HE病理染色觀察，未進行電鏡觀察和免疫組化等監(jiān)測，對血管內皮的亞微結構變化仍需進一步觀察。推測分析超聲產生不同血流灌注變化的機制，低MI的診斷超聲聯(lián)合微泡產生的聲孔效應可能刺激腫瘤微血管內皮產生輕度損傷及無菌性炎癥反應，進而快速出現(xiàn)血管擴張充血，增強血流灌注；而高MI診斷超聲則使血管通透性明顯增高，血管內皮或腫瘤組織產生暫時性水腫，壓迫血管腔變窄，產生血流灌注減少，此現(xiàn)象在本課題組前期血管毀損術實驗［7］中已得到證實，但因本實驗采用的診斷超聲與前期實驗使用的治療超聲相比，其聲壓及占空比均較低，因此未能產生前期實驗中明顯的組織變化。此外本實驗采用的腫瘤模型為兔VX2皮下移植瘤模型，血供豐富，成瘤率高［10］，但其生物學行為仍與自發(fā)腫瘤有一定的區(qū)別，因此本實驗中觀察到的血流灌注變化情況及其相應參數(shù)仍需在自發(fā)腫瘤模型上進一步驗證。

綜上所述，本實驗初步證明，低MI診斷超聲聯(lián)合微泡可以增強兔VX2的血流灌注，而高MI的診斷超聲聯(lián)合微泡可以減少兔VX2的血流灌注，但均不會對組織產生明顯的結構性變化。此規(guī)律可為臨床工作中多種腫瘤的治療提供可靠依據(jù)。

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Vascular effectof rabbit VX2tumor induced by diagnostic ultrasound w ithm icrobubbles

QIAOXueyan，CHEN Zhong，YICuo，GaoWenhong，Gao Shunji，LIU Zheng
Departmentof Ultraso und，Xinqiao Hospital，Third MilitaryMedical University，Chongqing 400037，China

ObjectiveTo investigate the different vasculareffectof rabbit VX2tumor induced by differentmechanical index（MI）of diagnosticultrasound combinedwithmicrobubbles.MethodsForty rabbit s with VX2tumorwere treated bydiagnostic ultrasound with differentMI（0.3，0.7，1.4）with microbubbles asexperimentgroup（experimentgroup 1，2，3）and negative control withoutany treatment（controlgroup），each group included 10 rabbits.0.2mlmicrobubbles in 5.0mlnormalsalinewasused asa therapeutic dose，the treatment timewas 5min.The tumor blood perfusion was imaged with contrast－enhanced u ltrasound before and after treatmentwhich were analyzed by the contrast analysis software，the peak intensity（PI）and the area under curve（AUC）were obtained.ResultsThere were significant differences of PI before and after the treatment in experiment group 1 and experimentgroup 3（P＝0.028，0.018），and PIwere not statistically significant between experimentgroup 2 and control group before and after the treatment（P＝0.994，0.978）.The AUC w as significantly different before and after the treatment in the experimentgroup 3（P＝0.009），while there were no statistical significance of AUC before and after the treatment in experiment group 1，2 and control group（P＝0.099，0.497，0.898）.C onclusion Low－intensity diagnostic ultrasound（MI＝0.3）combined with microbubbles can enrich the blood perfusion of VX2tumor in rabbits，and high－intensity diagnostic ultrasound（MI＝1.4）can decrease the blood perfusion.

Diagnostic u ltrasound；Microbubble；Vasculareffect；VX2tumor，rabbit

R735.7；R445.1

A

2016-09-23）

國家自然科學基金科學儀器專項項目（81227004）

400037重慶市，第三軍醫(yī)大學新橋醫(yī)院超聲科

劉政，Email：liuzhengs＠hotmail.com