陳世梁，吳文川，盧志承

(海南省人民醫(yī)院病理科，海南 ?？?570311)

·經(jīng)驗交流·

組織切片抗酸染色法的改良和應(yīng)用體會

陳世梁，吳文川，盧志承

(海南省人民醫(yī)院病理科，海南 海口 570311)

目的 探討在組織切片病理診斷中抗酸染色方法的改良和應(yīng)用，提高結(jié)核病的診斷率。方法選取病理診斷為肺結(jié)核的患者60例，每例選出病變蠟塊1塊，每塊蠟塊切片2張，1張用傳統(tǒng)Ziehl-Neelsen抗酸染色法染色，另1張用改良抗酸染色法染色，比較兩種染色方法的陽性率和染色效果。結(jié)果60例患者中，應(yīng)用傳統(tǒng)抗酸染色方法檢出抗酸桿菌28例，陽性率為46.67%，應(yīng)用改良抗酸染色方法檢出抗酸桿菌49例，陽性率為81.67%。兩種方法檢測結(jié)果陽性率比較差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與傳統(tǒng)抗酸染色方法相比，改良抗酸染色方法檢出的結(jié)核桿菌細(xì)菌量多，菌體粗且著色深。結(jié)論改良的抗酸染色法提高了結(jié)核桿菌的檢出率，值得臨床推廣應(yīng)用。

抗酸染色；組織切片；結(jié)核分枝桿菌

近年來，隨著免疫組化檢測技術(shù)和分子病理技術(shù)的廣泛應(yīng)用，很多特殊染色方法逐漸被免疫組化及分子病理學(xué)診斷技術(shù)取代。但是，由于結(jié)核桿菌著色的特異性，利用抗酸染色在病理組織切片檢測出結(jié)核桿菌是診斷結(jié)核病的金指標(biāo)，因此抗酸染色在日常病理工作中仍然發(fā)揮著不可替代的作用。Ziehl-Neelsen抗酸染色法[1]是檢測結(jié)核桿菌的傳統(tǒng)經(jīng)典的方法，但該法存在操作繁瑣費時、陽性率較低等弊端。為此，筆者在實踐工作中加以改良，取得了比較滿意的效果，現(xiàn)介紹如下：

1 材料與方法

1.1 材料 選取海南省人民醫(yī)院病理科2012-2015年經(jīng)病理診斷為肺結(jié)核的患者60例，每例選出病變蠟塊1塊。

1.2 方法 60例蠟塊每例分別切片2張，分成傳統(tǒng)組和改良組，分別進(jìn)行傳統(tǒng)抗酸染色和改良抗酸染色。

1.2.1 傳統(tǒng)Ziehl-Neelsen抗酸染色法[1](1)常規(guī)石蠟切片3～5μm厚；(2)常規(guī)二甲苯脫蠟至水；(3)苯酚堿性品紅液染色1 h；(4)自來水洗1 min；(5)0.5%鹽酸乙醇分化數(shù)秒鐘；(6)水洗1 min；(7)Mayer蘇木素復(fù)染2 min；(8)流水沖洗10 min；(9)常規(guī)無水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。

1.2.2 改良抗酸染色法 (1)石蠟切片厚度5～ 6μm。(2)切片用松節(jié)油和97號汽油按體積比1:1的混合液脫蠟2次，每次約5～10 min；用吸水紙將抹去切片周圍液體至切片稍濕潤；流水漂洗1 min。(3)0.5%的高碘酸溶液氧化5～8 min，流水沖洗2 min，再用蒸餾水浸洗2次，每次30 s。(4)0.2%TritonX-100液處理10 min。(5)苯酚堿性品紅液在室溫下染色20～30 min。 (6)流水洗去多余染液。(7)20%硫酸水溶液分化30 s～ 1 min。(8)流水沖洗5 min。(9)Mayer蘇木素淺染胞核。(10)流水沖洗10 min。(11)置于60℃烘箱內(nèi)烘干，二甲苯透明，中性樹膠封固。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 兩種方法結(jié)果的比較采用SPSS18.0進(jìn)行χ2檢驗，以P<0.01為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩種抗酸染色法的抗酸桿菌檢測結(jié)果比較 60例患者中，應(yīng)用傳統(tǒng)抗酸染色方法檢出抗酸桿菌28例，陽性率為46.67%，應(yīng)用改良抗酸染色方法檢出抗酸桿菌49例，陽性率為81.67%。兩種方法檢測結(jié)果比較，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=15.983，P<0.01)。

2.2 兩種抗酸染色法的染色效果比較 傳統(tǒng)抗酸染色方法中的結(jié)核桿菌呈紅色，菌體呈細(xì)桿狀，背景著色較深(圖1)。改良抗酸染色方法中的陽性結(jié)核桿菌量增多，呈亮紅色，菌體呈桿狀，色澤鮮明，菌體和背景著色適度，對比明顯而清晰(圖2)。

圖1 Ziehl-Neelsen抗酸染色法(×100)

圖2 改良抗酸染色法(×100)

3 討論

在病理診斷工作中進(jìn)行抗酸染色的目的是在組織切片中檢出抗酸桿菌進(jìn)而確診結(jié)核病?？顾釛U菌屬分枝桿菌，其菌體細(xì)胞壁上含有不等量的脂質(zhì)，主要是磷脂、脂肪酸和蠟質(zhì)三種成分[2]。其中，最主要的成分是蠟質(zhì)，它分布在細(xì)胞壁最外層形成完整的蠟樣外殼，因此一般染液難以滲透而染色不佳，但實踐證明苯酚堿性品紅可通過延長時間或加熱與結(jié)核桿菌細(xì)胞壁相結(jié)合成復(fù)合物而著色，這種物質(zhì)可抵抗酸性物質(zhì)的脫色[3]，因此在病理組織切片中經(jīng)酸脫色后仍呈紅色的桿菌為結(jié)核桿菌，這就是結(jié)核桿菌著色的特異性。

傳統(tǒng)Ziehl-Neelsen抗酸染色法不但陽性率低而且存在以下缺點：①需苯酚堿性品紅液常溫復(fù)染1 h，不但費時而且操作時間太長苯酚堿性品紅液出現(xiàn)干涸影響制片質(zhì)量；②苯酚堿性品紅液復(fù)染時對組織切片加熱可縮短染色時間，但在工作中我們發(fā)現(xiàn)加熱的時間和溫度往往不易控制，而且加熱時染液蒸發(fā)快也容易出現(xiàn)組織切片干涸現(xiàn)象。

為了提高抗酸染色的陽性率，我們根據(jù)抗酸桿菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)特點和著色特異性，從以下幾點對Ziehl-Neelsen抗酸染色法進(jìn)行改良：①適當(dāng)增加切片的厚度，5～6μm最為適宜，此厚度即能增加切片中菌體的含量而易于找到細(xì)菌，又能清晰地觀察細(xì)菌的形態(tài)。②傳統(tǒng)染色法用二甲苯脫蠟，由于二甲苯對于結(jié)核桿菌的脂質(zhì)細(xì)胞壁有一定的破壞，致其與苯酚堿性品紅相結(jié)合力減弱或消失，不易染色。改良染色法用汽油和松節(jié)油(體積比1：1)混合液替代二甲苯進(jìn)行脫蠟，可使菌體細(xì)胞壁脂質(zhì)不受破壞，保存菌體壁的完整性。與傳統(tǒng)抗酸染色方法相比，改良抗酸染色方法檢出的結(jié)核桿菌細(xì)菌量多，菌體粗且著色深。③按染色特性，結(jié)核桿菌分為抗酸性和嫌色性，后者完全喪失與苯酚堿性品紅相結(jié)合力。濫用抗生素、治療不當(dāng)?shù)刃袨榭墒箺U菌從抗酸性部分或全部轉(zhuǎn)為嫌色性，因此傳統(tǒng)染色方法檢測這類結(jié)核桿菌的陽性率往往比較低。嫌色性結(jié)核桿菌胞壁含有糖脂結(jié)構(gòu)，高碘酸可使糖脂結(jié)構(gòu)上兩個帶有羥基的相鄰的碳鍵氧化成醛基，而堿性品紅能與醛基發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生抗酸性的紫紅色基團。因此，改良抗酸染色法中切片在苯酚堿性品紅液染色前經(jīng)過0.5%高碘酸處理，可使嫌色性結(jié)核菌獲得抗酸染色的特性，從而使苯酚堿性品紅與抗酸桿菌結(jié)合更加牢固，增強抗酸桿菌染色效果[4]。④針對結(jié)核桿菌菌體胞壁上含有不等量的脂質(zhì)，一般染液難以滲透而不易著色的熱點，改良抗酸染色法中切片在苯酚堿性品紅液染色前先用TritonX-100處理。TritonX-100是非離子型表面活性劑，具有與極性分子和非極性分子相結(jié)合的親水基團和親油基團，能降低物質(zhì)界面的張力和溶解脂質(zhì)，因此能使菌體胞壁中的脂類在短時間內(nèi)脫去，增加細(xì)胞膜的通透性，提高染液的滲透力，使苯酚堿性品紅能順利地滲入菌體壁，使染色效果得到明顯改善[5]，對提高抗酸桿菌檢出率有一定的作用。⑤乙醇可脫去結(jié)核桿菌體表面的蠟質(zhì)，破壞菌體細(xì)胞壁完整性而容易造成染色結(jié)果假陰性，因此改良抗酸染色法整個操作過程都不經(jīng)乙醇浸洗。⑥20%硫酸水溶液褪色較弱，時間稍長影響不大，因此改良抗酸染色法用20%硫酸進(jìn)行分化，操作過程更容易操控。

[1]王伯沄,李玉松,黃高昇,等.病理學(xué)技術(shù)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2000:160.

[2]梁英杰,凌啟波,張威.臨床病理學(xué)技術(shù)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2011:116.

[3]徐開軍,孫濤.抗酸染色中堿性品紅用量分析[J].臨床與實驗病理學(xué)雜志,2014,30(11):1315.

[4]胥維勇.氧化劑和表面活性劑在抗酸染色中的應(yīng)用[J].臨床與實驗病理學(xué)雜志,2013,29(1):103-104.

[5]王德田,董建強.實用現(xiàn)代病理學(xué)技術(shù)[M].北京:中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)出版社,2012:133-134.

R446.8

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1003—6350(2017）09—1523—02

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.09.053

2016-11-16)

陳世梁。E-mail：chenshiliang168@163.com