王金梅，包建強

（上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海 201306）

超聲波輔助魚皮膠原蛋白提取及其性質(zhì)研究

王金梅，包建強

（上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海 201306）

利用超聲波輔助提取草魚皮膠原蛋白，并通過SDS-PAGE、圓二色譜法對超聲作用得到的草魚皮膠原蛋白結(jié)構(gòu)和變性溫度等進行了研究。通過響應(yīng)面試驗得到最優(yōu)工藝條件：超聲功率310 W，超聲時間10 min，酶解時間29 h，提取率達到68.67%。SDS-PAGE和CD顯示：膠原蛋白為典型Ⅰ型，且純度較高，變性溫度為36℃，膠原蛋白的三螺旋結(jié)構(gòu)完整，超聲波對其結(jié)構(gòu)無明顯影響，且具有生物活性。

魚皮；膠原蛋白；提??；超聲波；凝膠電泳；圓二色譜；響應(yīng)面分析

我國淡水產(chǎn)品年產(chǎn)量長期位居世界第一，2014年淡水魚總產(chǎn)量達到2 770萬t，占全國魚類產(chǎn)量的73%［1］。為提高淡水魚的經(jīng)濟效益，對淡水魚進行深加工是目前面臨的重要問題。2012年我國水品加工比例僅占36.15%［2］，淡水產(chǎn)品加工比例更低僅為17%，淡水產(chǎn)品加工利用率低，低附加值的產(chǎn)品多，深加工的產(chǎn)品少的現(xiàn)象普遍存在，例如魚糜加工業(yè)的采肉率僅為25%左右［2］，其余60%—70%的魚體部分成了加工副產(chǎn)品，大量副產(chǎn)品沒有得到綜合利用，還對環(huán)境造成污染。研究表明：魚皮膠原蛋白含量豐富，郭文宇等［3］測得草魚皮膠原蛋白量可達總蛋白含量80%以上，經(jīng)加工處理可得到高品質(zhì)的膠原蛋白。

膠原蛋白的提取方法主要有：水法提取、堿法提取、酸法提取和酶法提取。熱水法提取的膠原蛋白由于超螺旋結(jié)構(gòu)被破壞，因而不具備膠原蛋白的生理功能，這類膠原蛋白被稱為明膠；堿法提取過程中會使膠原部分肽鍵水解，破壞其超螺旋結(jié)構(gòu)，所以得到膠原蛋白分子量較小，且堿法水解過度會產(chǎn)生有毒的D型氨基酸旋光化合物，所以堿法提取膠原蛋白研究較少；酸法提取常與酶法結(jié)合使用，蛋白酶可以切除膠原蛋白末端的非膠原肽，使膠原蛋白溶解于酸或中性鹽溶液中從而被提取出來。張雙靈等［4］研究當(dāng)酶劑量為1.2%、酶解時間80 min、酶解溫度55℃、酶解pH＝9時，虹鱒魚皮膠原蛋白得率為26.1%。

近年來超聲波在成分提取方面應(yīng)用廣泛，楊萌萌等［5］將超聲波應(yīng)用到提取牛蹄筋的酶溶性膠原蛋白中，研究了超聲功率與超聲時間及加酶量三個因素對提取率的影響，得到最優(yōu)條件下提取率提高了1069%。本研究將超聲波應(yīng)用到草魚皮膠原蛋白提取中，并通過響應(yīng)面確定超聲波的最優(yōu)工作參數(shù)。由于水產(chǎn)品膠原蛋白不同于一般動物膠原蛋白，水產(chǎn)品膠原蛋白變性溫度較低，有生物學(xué)功能的三螺旋結(jié)構(gòu)容易在提取過程中被破壞，所以，采用圓二色譜法研究了膠原蛋白的熱穩(wěn)定性以及超聲波對膠原蛋白結(jié)構(gòu)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實驗室－50℃凍藏新鮮草魚魚皮，南潯新雅農(nóng)產(chǎn)品（浙江）開發(fā)有限公司提供。胃蛋白酶酶活3 000 U/g和羥脯氨酸等藥品，購自國藥集團試劑有限公司。

UV-18OOPC型紫外可見分光光度計，上海美譜達儀器有限公司；XO-SM100超聲波微波組合反應(yīng)系統(tǒng)，先歐儀器（南京）制造有限公司；圓二色譜儀J-815，JASCO公司。

1.2 草魚皮膠原蛋白提取工藝優(yōu)化

1.2.1 膠原蛋白提取及純化

魚皮室溫流水解凍，刮掉魚皮表面殘留魚肉，剪碎稱重，氫氧化鈉浸泡除去雜蛋白，水洗至中性，正丁醇浸泡除脂，水洗，加乙酸，超聲處理［4］，加酶浸泡，離心取上清液，加Tris調(diào)節(jié)pH，加入氯化鈉進行鹽析，離心取沉淀，加乙酸復(fù)溶，低濃度乙酸中透析，冷凍干燥得膠原蛋白樣品。

1.2.2 羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

膠原蛋白中含有的羥脯氨酸含量相對穩(wěn)定，應(yīng)用紫外分光光度計測定羥脯氨酸含量，乘以轉(zhuǎn)換系數(shù)得到樣品中膠原蛋白含量。通過Woessner比色法可得到有關(guān)羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程，根據(jù)紫外分光光度計測定的吸光度值可計算羥脯氨酸含量［6］，不同于一般動物的膠原羥脯氨酸含量（14.4%），魚類膠原中含量略低，如Ikoma等［7］測得淡水魚鱗膠原中羥脯氨酸的含量約為11%，本次研究取9.09［8］。

酶解液中膠原蛋白得率（W，%）和提取率（Y，%）換算公式如下所示：

式中：ω為酶解液中羥脯氨酸的質(zhì)量。

1.2.3 響應(yīng)面設(shè)計試驗

試驗考察超聲頻率、超聲時間和酶解時間三個因素對膠原蛋白提取率的影響，通過單因素預(yù)試驗，確定響應(yīng)面因素水平，應(yīng)用Box-Behnken模型以A超聲頻率、B超聲時間和C酶解時間為自變量，膠原蛋白得率Y為響應(yīng)值設(shè)計試驗，經(jīng)預(yù)處理后的魚皮提取條件為0.5 mol/L的乙酸以調(diào)節(jié)pH，料液比1∶15，進行超聲波處理后加入胃蛋白酶量為4%。

表1 響應(yīng)面因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface

1.3 膠原蛋白聚丙稀酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分析

SDS-PAGE參照Matmaroh等［9］的方法。膠原蛋白分離采用8%的SDS/聚丙烯酰胺凝膠、Tris-HCl/甘氨酸電泳緩沖系統(tǒng)。膠原蛋白溶于去離子水（1 mg/mL）后，與上樣緩沖液（0.5 mol/L Tris-HCl，4%SDS，20%甘油，含或不含10%DTT，pH 6.8）以1∶1（V/V）混合，沸水浴5 min。樣品冷卻后，加入4%聚丙烯酰胺凝膠（濃縮膠）梳孔，冰浴電泳120 V。電泳結(jié)束后，凝膠用0.05%考馬斯亮藍R-250染色，用含15%甲醇和10%乙酸的脫色液脫去背景色。

1.4 熱穩(wěn)定性的圓二色譜測試

1.4.1 膠原蛋白結(jié)構(gòu)鑒定

將凍干膠原蛋白溶解到0.1 mol/L的乙酸溶液，樣品質(zhì)量濃度為200μg/mL，取200μL注入1 mm比色皿中放入樣品池。設(shè)置溫度10℃，掃描速率10 nm/min，掃描波長范圍190—250 nm，數(shù)據(jù)點間隔0.5 nm，圓二色譜儀記錄橢圓率變化。

1.4.2 膠原蛋白熱穩(wěn)定性和不可逆性

設(shè)置波長220 nm，樣品池溫度從10℃升高到45℃，升溫速度1℃/min，圓二色譜儀記錄升溫過程中數(shù)據(jù)變化。將膠原蛋白45℃處理后，降溫到10℃保溫20 min，10℃環(huán)境中記錄190—250 nm波長范圍的橢圓率變化。

1.4.3 溫度對膠原蛋白結(jié)構(gòu)影響

測試樣品配制方法同1.4.1，試驗設(shè)置5個不同的溫度點，20℃、30℃、35℃、60℃、80℃，掃描波長范圍190—250 nm，每個溫度點掃描，記錄數(shù)據(jù)，保溫10 min后，再次掃描記錄數(shù)據(jù)，掃描速率設(shè)置為100 nm/min。

1.4.4 超聲波對膠原蛋白結(jié)構(gòu)的影響

將配置好的膠原蛋白溶液放到超聲清洗器處理，功率300W，分別超聲處理5 min、10 min、15 min，記錄橢圓率變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 草魚皮膠原蛋白提取的工藝優(yōu)化

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以膠原蛋白提取率為響應(yīng)值，利用Design Expert8.0.6設(shè)計試驗，試驗設(shè)計和結(jié)果如表2所示，表3為方差分析數(shù)據(jù)。其中回歸模型系數(shù)的顯著性P＜0.01，回歸模型顯著，失擬項P＝0.2745＞0.05不顯著，表明方程模擬比較好，可以進行數(shù)據(jù)分析。根據(jù)響應(yīng)面回歸模型：Y＝66.87＋1.13A＋2.42B＋4.31C＋0.34AB－0.86AC－2.51BC－2.42A2－3.36B2－2.46C2，可知各因素對草魚皮中膠原蛋白提取率影響的主次順序為：C＞B＞A，即酶解時間＞超聲時間＞超聲功率，酶解時間對膠原蛋白提取率的影響最大，其次是超聲時間。

表2 試驗方案的設(shè)計及結(jié)果Table 2 Experim ental design and results

表3 回歸模型的方差分析及其系數(shù)的顯著性檢驗Table 3 Variance analysis of regression m odel and significance test ofm odel coefficients

根據(jù)方差分析數(shù)據(jù)顯示，酶解時間對提取率的影響極顯著，超聲功率和超聲時間對提取率的影響顯著；三因素兩兩交互作用分析，超聲時間與酶解時間之間的交互作用對提取率的影響顯著，超聲功率和超聲時間、酶解時間和超聲功率響之間的交互作用影響不顯著。

通過響應(yīng)面法優(yōu)化，酶法提取得到草皮膠原蛋白最優(yōu)可操作的工藝條件為：超聲功率312.97 W，超聲時間10.29 min，酶解時間29.12 h，此時膠原蛋白提取率理論值為68.80%。考慮到實際生產(chǎn)中的需要，上述工藝條件進行略微調(diào)整，最終確定實際最優(yōu)的提取工藝為：超聲功率310W，超聲時間10min，酶解時間29 h，并在此最優(yōu)條件下對其進行3次驗證試驗，以考察模型的可靠性。結(jié)果表明：在實際的最優(yōu)工藝條件下，超聲波輔助提取下的膠原蛋白提取率達到68.67%，實際操作中的數(shù)值與試驗設(shè)計中的理論數(shù)值（68.80%）相對誤差僅為0.19%。

2.2 凝膠電泳

超聲波輔助提?。║PSC）與未經(jīng)超聲波波處理所得的膠原蛋白（PSC）的電泳圖譜如圖1所示，所得膠原蛋白與標(biāo)準(zhǔn)Ⅰ型膠原蛋白條帶基本一致，均存在兩條不同的α鏈，是由α1和α2組成，其中從光密度來看α1和α2的比率為2∶1，因此膠原蛋白的組成應(yīng)該為（α1）2α2這種結(jié)構(gòu)符合真骨魚膠原含有兩條［10-11］或者三條［12］不同的鏈，根據(jù)與Maker對比，可以確定為Ⅰ型膠原蛋白，圖1是另一條帶為β，是兩條肽鏈的二聚體，符合魚皮Ⅰ型膠原結(jié)構(gòu)，且圖1中電泳條帶清晰無雜帶出現(xiàn)，說明超聲波輔助酶法提取膠原蛋白純度較高。圖1中2和4對比，4和5對比發(fā)現(xiàn)，相同濃度的UPSC和PSC條帶位置和條帶密度均大致相同，表明超聲波輔助提取沒有破壞膠原蛋白的結(jié)構(gòu)。

2.3 熱穩(wěn)定性的圓二色譜測試

2.3.1 膠原蛋白結(jié)構(gòu)的圓二色譜測試

圖2為圓二色譜儀掃描得到的膠原蛋白CD譜圖。圖2中10℃測定的CD譜圖曲線，可以看到膠原蛋白在190—250 nm有正負(fù)兩個吸收峰，最大負(fù)吸收峰在198 nm左右，最大正吸收峰在220 nm左右，并由正負(fù)峰強度比值可以表征膠原三螺旋結(jié)構(gòu)完整程度［13］，完全符合膠原蛋白三螺旋結(jié)構(gòu)的吸收特征峰，說明提取得到膠原蛋白三股螺旋結(jié)構(gòu)完整。圖2中膠原蛋白溶液加溫到45℃后降溫到10℃并保溫一段時間，圓二色譜儀記錄190—250 nm波長范圍的色譜圖，圖中沒有明顯的正負(fù)吸收峰，表明膠原蛋白在超過一定溫度后已經(jīng)變性解螺旋，降低溫度后，三螺旋結(jié)構(gòu)不能恢復(fù)，二級結(jié)構(gòu)已被破壞。

圖1 膠原蛋白SDS-PAGE圖Fig.1 SDS-PAGE of grass carp skin’s collagen

圖2 草魚皮膠原蛋白圓二色譜掃描Fig.2 Circular dichroism spectra of grass carp skin’s collagen

2.3.2 膠原蛋白熱穩(wěn)定性和結(jié)構(gòu)不可逆性測試

CD譜圖上波長220 nm處的摩爾橢圓率表示膠原蛋白三螺旋結(jié)構(gòu)的特征吸收光值譜，此波長處的CD值隨溫度的變化則可表征膠原蛋白三螺旋構(gòu)象的變化過程［14］。對膠原蛋白溶液從10℃升高到45℃，記錄橢圓率變化如圖3（a），圖3（a）中顯示10—31℃，膠原蛋白CD值幾乎沒有變化，在31—34℃范圍內(nèi)CD值有略微減小，而在大于34℃到39℃范圍內(nèi)，CD值迅速減小。表示三股螺旋結(jié)構(gòu)在34℃以前一直完整存在，之后三螺旋的α單鏈開始解旋，在溫度大于39℃時，CD又變得穩(wěn)定，表示三螺旋結(jié)構(gòu)徹底破壞。對數(shù)據(jù)進行微積分處理得到圖3（b），可以得到在36℃時，膠原蛋白的解螺旋速率最大［15］，所以草魚皮膠原蛋白的變性溫度為36℃。

圖3 草魚皮膠原蛋白解螺旋過程Fig.3 Uncoiling of grass carp skin’s collagen

2.3.3 溫度對膠原蛋白結(jié)構(gòu)影響測試

圖4是保溫前后不同溫度下膠原蛋白的CD曲線，設(shè)置五個溫度點，對每個溫度點的樣品進行兩次掃描，分別保溫10 min。圖4中（a）和（b）在接近變性溫度的30℃，保溫前后圖譜并沒有明顯變化，說明在變性溫度之前膠原蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定；溫度點位35℃，正負(fù)峰比值RPN有略微變化，保溫10 min后，其正負(fù)峰強度變化很大，RPN減小明顯。溫度點60℃時，保溫10 min正峰強度幾乎為零，負(fù)峰發(fā)生紅移。由此得出結(jié)論，膠原蛋白在變性溫度前，結(jié)構(gòu)保持穩(wěn)定，并且膠原蛋白解螺旋改變結(jié)構(gòu)需要一段時間過程。

圖4 不同溫度點膠原蛋白圓二色譜Fig.4 Circular dichroism spectra of collagen at different temperatures

2.3.4 超聲波對膠原蛋白圓二色性的影響

對膠原蛋白溶液進行一定時間的超聲波處理后測得圓二色譜如圖5，在功率300 W，作用不同超聲時間的圖譜與沒有進行超聲處理的膠原蛋白對比沒有明顯區(qū)別，說明超聲波對膠原蛋白的三螺旋結(jié)構(gòu)不會造成影響；并且CD圖譜顯示在220 nm和198 nm左右有兩個吸收峰說明超聲處理過的膠原蛋白仍具有生理活性。

圖5 不同超聲時間的膠原蛋白圓二色譜Fig.5 Circular dichroism spectra of collagen at different ultrasonication times

3 結(jié)論

本研究將超聲波作用到魚皮膠原蛋白提取中，并通過響應(yīng)面設(shè)計試驗法獲得最佳工藝參數(shù)：超聲波功率310 W，超聲波時間10 min，酶解時間29 h，此條件下膠原蛋白提取率為68.67%。超聲波輔助法比未經(jīng)超聲處理的提取法得到膠原蛋白得率提高了13.38%。

SDS-PAGE顯示膠原蛋白純度較高，且結(jié)構(gòu)符合標(biāo)準(zhǔn)Ⅰ型膠原蛋白；圓二色譜法測定膠原蛋白結(jié)構(gòu)，判定其具有完整的三螺旋結(jié)構(gòu)；測得魚皮膠原蛋白變性溫度為36℃，且其結(jié)構(gòu)改變需要一定時間；對比溫度對膠原三螺旋結(jié)構(gòu)的影響，結(jié)論是超聲波對膠原蛋白的結(jié)構(gòu)影響不大，超聲波輔助提取過程不足以對膠原蛋白的三螺旋結(jié)構(gòu)造成影響，超聲輔助提取得到的草魚皮膠原蛋白仍然具有生物活性。

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（責(zé)任編輯：程智強）

The ultrasonic-assisted solvent extraction and characterization of fishskin collagen

WANG Jin-mei，BAO Jian-qiang
（College of Food Science and Technology，Shanghai Ocean University，Shanghai201306，China）

The ultrasonic-assisted solventextraction of grass carp skin’s collagen was carried out，and the gained collagen’s structure and denaturing temperature were studied by SDS-PAGE and circular dichroism spectrocopy.The experiments by response surface methodology showed that the optimal processing conditions were 310-W ultrasonic power，10-min ultrasonication and 29-h enzymolysis，in which the extraction rate reached 68.67%.The research by SDS-PAGE and circular dichroism spectrocopy indicated that the collagen was of TypeⅠand had a comparatively high purity，its denaturing temperature was 36℃，and its triple-helix structure was intact and not influenced by ultrasonic wave，and also had a biological activity.

Fishskin；Collagen；Extraction；Ultrasonic wave；Gel electrophoresis；Circular dichroism spectrum；Response surface analysis

TS254

：A

1000-3924（2017）02-114-06

10.15955j.issn1000-3924.2017.02.21

2016-04-06

水產(chǎn)動物遺傳育種中心上海市協(xié)同創(chuàng)新中心（ZF1206）；上海市科委工程中心建設(shè)（11DZ2280300）

王金梅（1990—），女，碩士，研究方向：食品科學(xué)。Tel：15216835916，E-mail：wjmytu＠163.com

，E-mail：baojq＠shou.edu.cn