周田田，丁 榕，蔡建超，趙和文，2，3，崔金騰，2，3

（1北京農(nóng)學(xué)院園林學(xué)院，北京 102206；2城鄉(xiāng)生態(tài)環(huán)境北京實驗室，北京 102206；3北京市鄉(xiāng)村景觀規(guī)劃設(shè)計工程技術(shù)研究中心，北京 102206）

杜鵑根際微生物的分離、鑒定及多樣性分析

周田田1，丁 榕1，蔡建超1，趙和文1，2，3，崔金騰1，2，3

（1北京農(nóng)學(xué)院園林學(xué)院，北京 102206；2城鄉(xiāng)生態(tài)環(huán)境北京實驗室，北京 102206；3北京市鄉(xiāng)村景觀規(guī)劃設(shè)計工程技術(shù)研究中心，北京 102206）

迎紅杜鵑和照白杜鵑是北京僅有的兩種野生杜鵑花，為了解海拔和種源對杜鵑根際菌落組成的影響，采樣不同海拔、不同種源的杜鵑根際和非根際土壤，進行菌種純化和分子鑒定，同時提取土壤DNA，進行第二代高通量測序；結(jié)合采樣地自然條件，分析不同因素對根際菌落組成及豐度的影響。結(jié)果表明：分離杜鵑根際土壤得到了來源于5個屬的11種細菌單菌落和來源于7個屬的9種真菌單菌落；低海拔迎紅杜鵑和高海拔迎紅杜鵑的根際土壤中，分別具有5個和3個優(yōu)勢菌屬；低海拔和高海拔的非根際土壤中，分別具有8個和9個優(yōu)勢菌屬；杜鵑根際土壤中的菌種組成較非根際穩(wěn)定，并且根際優(yōu)勢菌有一定的定向性；迎紅杜鵑的根際細菌多樣性大于照白杜鵑，但照白杜鵑根際優(yōu)勢菌屬要多于迎紅杜鵑；低海拔迎紅杜鵑的根際細菌多樣性和優(yōu)勢菌屬都要大于高海拔迎紅杜鵑。結(jié)論是海拔與種源對于杜鵑根際菌落組成與豐度有著顯著的影響，杜鵑根際細菌的多樣性與植物的物候期有關(guān)系，不同種源的杜鵑由于其根系分泌物的不同也導(dǎo)致了根際細菌多樣性的差異。與高通量測序結(jié)果相比，本研究中分離得到的微生物種類明顯較少，與前人的研究結(jié)果相一致。

杜鵑；根際微生物；鑒定；多樣性

根際微生物是指存在于植物根系表面及其附近土壤中的微生物。植物根際具有極高的微生物多樣性，是地球上最復(fù)雜的微生物群落之一。研究表明，植物根際定植的各種微生物細胞密度遠大于植物體內(nèi)細胞密度，同時根際微生物所擁有的基因數(shù)量也遠遠超過植物基因［1］。植物根際微生物與植物為互生關(guān)系，植物為微生物提供營養(yǎng)和能量物質(zhì)，微生物為植物提供有效養(yǎng)分、維生素等，促進植物生長［2］。近年來，利用植物根際微生物來提高植物抗逆性的研究已經(jīng)取得了一定的進展。楊培志研究表明，接種根瘤菌可大幅度提高紫花苜蓿的抗旱、耐鹽、抗高溫及根部機械損傷等非生物脅迫能力，苜蓿植株根瘤菌被激活的抗逆性遠高于不激活的［3］。目前，已經(jīng)有大量的有益菌種被篩選出來用于商業(yè)化生產(chǎn)，在提高作物抗逆性方面起到了重要的作用。

近年來，二代高通量測序技術(shù)不僅憑借其通量高，而且還能夠同時分析上百份樣品的優(yōu)勢，克服了傳統(tǒng)變性梯度凝膠電泳（DGGE）、16SrRNA基因的末端限制性片段分析技術(shù)（T-RFLP）等技術(shù)檢測限低、工作量大的缺點，成為解析復(fù)雜環(huán)境中微生物群落物種組成和相對豐度的首選工具［4］。細菌染色體上的16SrDNA是相對應(yīng)的編碼16SrRNA的DNA序列，具有豐富的遺傳信息，其中的保守區(qū)可以反映物種間親緣關(guān)系的遠近，可變區(qū)可用來判定種間變異情況，非常適合用于進行種群分類和系統(tǒng)發(fā)育研究。通過高通量測序技術(shù)測序土壤微生物16SrDNA序列，來研究土壤微生物多樣性，已在玉米、水稻、榨菜、歐美楊I(lǐng)-107等上有過報道［5-8］。Peiffer等［5］通過研究玉米根際微生物表明，利用16SV4區(qū)進行微生物多樣性分析，可獲得較好的微生物群落組成信息，不同種源對其根際微生物群落組成有影響的；根際與非根際微生物群落組成之間也存在較大差異，并且根際微生物的組成不受地理環(huán)境和栽培管理方式的影響。但是Edwards等［6］在水稻的根際微生物研究中發(fā)現(xiàn)，地理環(huán)境和栽培管理方式對水稻根際微生物的組成產(chǎn)生了一定影響。目前，通過二代高通量測序技術(shù)對植物根際微生物多樣性研究已成為研究熱點。

本試驗通過對不同海拔和不同種源杜鵑根際微生物多樣性進行研究，分析海拔和種源對杜鵑根際微生物群落組成的影響，并從杜鵑根際土壤中分離鑒定細菌和真菌，研究海拔、種源和根際微生物多樣性之間的關(guān)系和得到利于杜鵑生長的根際菌種。

1 材料與方法

1.1 試驗樣品的采集

土壤材料取自北京市密云區(qū)西北部燕山山脈的云蒙山，東經(jīng)為116°30′—116°50′，北緯為40°26′—40°38′，系燕山山脈的西南段，主峰海拔1 414 m，土壤為山地棕壤和淋溶褐土，土壤偏酸性［9］。土壤樣品在2015年4月23日采集于云蒙山地區(qū)，在實地調(diào)查的基礎(chǔ)上，選定了一處高海拔杜鵑居群和一處低海拔杜鵑居群，避開人為干擾因素，分別進行了采樣。

在低海拔同一居群中取3株迎紅杜鵑和3株照白杜鵑，在高海拔同一居群中取3株迎紅杜鵑，采樣地分布如表1所示。在每個居群采樣地內(nèi)，挖出杜鵑單株表層（10—20 cm）細根，采集直徑0.2—0.5 cm的杜鵑細根，用抖落法獲取細根上粘附的土壤作為根際土壤。采集對照組樣品時，選擇3處距離杜鵑居群根際較遠的空地進行采樣，采樣深度為10—20 cm。土樣采集完畢后裝入已消毒的密封塑料袋中，并放入冰盒內(nèi)運回實驗室［10］。采集的樣品置于－20℃保存，用于土壤總DNA的提取以及根際微生物的分離與鑒定。

1.2 試驗方法

1.2.1 土壤總DNA的提取

將采集的15份樣品，按類別各取1 g樣品混勻（對應(yīng)編號見表1），再從中取1 g樣品進行土壤總DNA的提取，使用天根生化科技（北京）有限公司生產(chǎn)的土壤基因組DNA提取試劑盒（DP336），按操作說明對土壤總DNA進行提取和純化。

表1 采樣地分布Table 1 Distribution of sam p le points

1.2.2 根際細菌16SrDNA V4區(qū)高通量測序

將提取的土壤總DNA委托北京諾禾致源生物信息科技有限公司進行二代測序。將經(jīng)過PCR擴增檢測合格的土壤樣品的目的DNA利用16SrDNA V4區(qū)擴增，通過建庫及Illumina公司升級后的HiSeq測序平臺的PE250策略進行高通量雙端測序，使用QIIME軟件對測序數(shù)據(jù)拼接、過濾成Tags，根據(jù)Tags回歸樣品進行物種分類、細菌群落結(jié)構(gòu)多樣性分析以及多樣品的比較分析。

1.2.3 杜鵑根際微生物的分離純化

利用土壤稀釋涂板法［11］，將迎紅杜鵑根際土壤稀釋液分別涂布到牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）上，在室溫下培養(yǎng)。待長出菌落后，挑取到新的培養(yǎng)基上，直到形成單一菌落。

1.2.4 杜鵑根際微生物的分子鑒定

提取各菌株基因組DNA，細菌采用引物515F/806R（515F：5’-CAGCMGCCGCGGTAA-3’；806R：5’-GACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）擴增16SrRNA基因［5］，真菌采用引物ITS4/ITS5（ITS4：5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’；ITS5：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）擴增ITS序列。PCR反應(yīng)程序如下：94℃5 min；94℃40 s，54℃30 s，72℃40 s，37個循環(huán)；72℃10 min，4℃保存。擴增產(chǎn)物送至華大基因公司測序。

1.3 數(shù)據(jù)分析

二代測序結(jié)果使用QIIME軟件對測序數(shù)據(jù)進行過濾，通過flash軟件將reads進行拼接和過濾，得到高質(zhì)量的Tags數(shù)據(jù)（Clean Tags），再去除其中的嵌合體序列，得到最終的有效數(shù)據(jù)（Effective Tags）。利用Uparse軟件對所有樣品的全部Effective Tags進行聚類，將一致性（Identity）大于97%的序列聚為一個單位的OTU（Operational Taxonomic Unit）。用RDPClassifier方法與GreenGene數(shù)據(jù)庫對OTUs序列進行物種注釋分析，用R軟件繪制土壤中菌群稀釋曲線，并分別在各個分類水平統(tǒng)計各樣本的群落組成。以樣品中數(shù)據(jù)量最少的為標準，對各樣品的數(shù)據(jù)進行均一化處理后用Qiime軟件進行Alpha多樣性分析，來評估各樣品中微生物群落的物種豐富度和多樣性。鑒定單菌落菌種時，將16SV4區(qū)序列在Green genes數(shù)據(jù)庫進行比對，將ITS序列在Unit數(shù)據(jù)庫進行比對。

圖1 土壤樣品總DNA的電泳結(jié)果Fig.1 Electrophoretic analysis of DNAs of soil sam p les

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤樣品總DNA的提取結(jié)果

利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性，結(jié)果如圖1。

從圖1中可以看出，5種土壤樣品中提取的總DNA條帶清晰，說明提取到片段較完整，可以用于微生物多樣性的后續(xù)分析。

2.2 杜鵑根際細菌群落結(jié)構(gòu)多樣性分析

2.2.1 測序質(zhì)量

經(jīng)過過濾后5個樣品得到總拼接序列數(shù)（Raw tags）為209 040條，用于構(gòu)建OTUs有效Tags數(shù)目（Effective Tags）為200 851條，達到96.08%。總檢測到OTUs數(shù)為3 768個。由圖2可知，各樣品的稀釋曲線均已趨于平坦，說明測序深度基本可以反映樣品中絕大多數(shù)的微生物信息。相同杜鵑種間，低海拔迎紅杜鵑的OTU數(shù)量高于高海拔迎紅杜鵑。

2.2.2 根際與非根際土壤中細菌多樣性比較

利用Uparse軟件對5個樣品的全部Effective Tags進行聚類，得到OTUs（Operational Taxonomic Units）。如圖3所示，5個樣品所共有的OTUs有1 121個，低海拔迎紅杜鵑根際土壤特有140個OTUs，照白杜鵑根際土壤特有91個OTUs，高海拔迎紅杜鵑根際土壤特有72個OTUs，低海拔非根際土壤特有229個OTUs，高海拔非根際土壤特有162個OUTs。低海拔和高海拔迎紅杜鵑相比較時，其根際土壤的共有OTUs有1 629個，低海拔迎紅杜鵑特有OTUs有999個，高海拔迎紅杜鵑特有OTUs有390個。低海拔迎紅杜鵑和照白杜鵑相比較時，其根際土壤的共有OTUs有 1 898個，迎紅杜鵑特有OTUs有730個，照白杜鵑特有OTUs有429個。由此可見，低海拔迎紅杜鵑根際土壤OTUs無論與同海拔的照白杜鵑相比，還是與高海拔迎紅杜鵑相比，都有數(shù)量較高的OTUs。

圖2 根際與非根際土壤中菌群稀釋曲線Fig.2 Dilution curves of floras in rhizospheric and non-rhizospheric soils

圖3 根際與非根際土壤微生物OTUs韋恩圖Fig.3 Venn diagram of OTUs in rhizospheric and non-rhizospheric m icroorganism

根據(jù)物種注釋結(jié)果，選取每個樣品在門（Phylum）分類水平上最大豐度排名前10的菌門，生成菌種相對豐度圖，如圖4所示。5個樣品在門分類水平上最大豐度排名前10的物種有變形菌門Proteobacteria（32.29%）、放線菌門Actinobacteria（17.19%）、酸桿菌門Acidoba cteria（16.45%）、疣微菌門Verrucomicrobia（696%）、WPS-2（5.63%）、芽單胞菌門Gemmatimonadetes（531%）、擬桿菌門Bacteroidetes（3.46%）、浮霉菌門Planctomycetes（3.45%）、綠彎菌門Chloroflexi（3.14%）和AD3（2.03%）。相對豐度大于10%的菌門為優(yōu)勢菌門，低海拔迎紅杜鵑、照白杜鵑和高海拔迎紅杜鵑根際土壤中共有的優(yōu)勢菌門有變形菌門Proteobacteria、酸桿菌門Acidobacteria和放線菌門Actinobacteria，其中高海拔迎紅杜鵑根際土壤中WPS-2（12.40%）也為優(yōu)勢菌門。有研究結(jié)果表明變形菌門Proteobacteria、放線菌門Actinobacteria和酸桿菌門Acidobacteria在馬鈴薯等根際土壤中也為優(yōu)勢菌門［12］。

圖4 5個樣品在門分類水平上的相對豐度Fig.4 Relative abundances of phyla in 5 samp les

2.2.3 屬水平的物種豐度熱圖分析

根據(jù)所有樣品在屬水平的物種注釋及豐度信息，選取豐度排名前35的屬，將每個屬相對豐度經(jīng)過標準化處理后得到Z值，據(jù)此繪制得到屬水平的物種豐度熱圖，圖中越偏向紅色表示豐度越高，越偏向藍色表示豐度越低，如圖5所示。5份樣品有相對較高的豐度差異。低海拔迎紅杜鵑中Candi-datus-Solibacter等5個屬、照白杜鵑中Granulicella等12個屬、高海拔迎紅杜鵑中Granulicella等3個屬、低海拔對照中DA101等8個屬、高海拔對照中Phaeobacter等9個屬分別高于它們各自在5個樣品中的平均含量。而且每個樣品中豐度較高的菌屬分別屬于2—4個菌門，這表明每個樣品的微生物多樣性較高。

2.2.4 根際和非根際土壤細菌α多樣性指數(shù)

利用Qiime軟件對細菌OTUs進行分析得到5個樣品細菌多樣性指數(shù)（表2）。5個樣品觀測到的物種數(shù)在2 019—2 628種，低海拔迎紅杜鵑觀測物種數(shù)最大，高海拔迎紅杜鵑觀測物種數(shù)最小，兩者相差609種。同樣，5個樣品Chao1豐度估值在2 247.821—2 887.327，低海拔迎紅杜鵑Chao1豐度估值最大，高海拔迎紅杜鵑Chao1豐度估值最小。觀測物種和Chao1豐度估值兩個參數(shù)的變化表明海拔對迎紅杜鵑的根際微生物種類和豐度具有顯著影響。5個樣品香濃多樣性指數(shù)均在8.8—9.8，表明所有樣品的微生物多樣性和豐度都較高，其中低海拔迎紅杜鵑的指數(shù)最大，說明低海拔迎紅杜鵑群落的多樣性較高，物種分布最均勻。5個樣品辛普森指數(shù)均在0993—0.997，都極其接近于1，這表明所有樣品的微生物多樣性和豐度都較好。

圖5 屬水平的物種豐度熱圖Fig.5 Species richness thermalm ap at genus level

表2 杜鵑根際和非根際土壤中細菌多樣性指數(shù)Table 2 Bacterial diversity indexes in rhizospheric and non-rhizospheric soils

2.3 根際土壤微生物的分離與鑒定

2.3.1 根際細菌的分離與鑒定

使用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，涂布土壤菌液，不斷地挑單菌培養(yǎng)，得到以下的細菌單培養(yǎng)菌株（圖6）。

圖6 細菌菌落Fig.6 Bacterial colonies

共分離得到11種細菌單菌落（表3），其中鞘氨醇單胞菌屬、甲基桿菌屬、類芽孢桿菌屬各1種，鏈霉菌屬、芽孢桿菌屬各4種。所有的這些細菌菌屬在高通量測序的結(jié)果中均被發(fā)現(xiàn)，鞘氨醇單胞菌屬的相對豐度為0.33%，鏈霉菌屬的相對豐度為0.24%，類芽孢桿菌屬的相對豐度為0.05%，甲基桿菌屬的相對豐度為0.05%，芽孢桿菌屬的相對豐度為0.01%。其中一些細菌在其他植物根際土壤中也有發(fā)現(xiàn)，如在灰棗、水稻和草莓等根際土壤中均分離出芽孢桿菌屬的細菌［11，13-14］。

表3 杜鵑根際微生物細菌測序結(jié)果Table 3 Sequencing results of bacteria in rhododendron rhizospheres

2.3.2 根際真菌的分離與鑒定

使用PDA培養(yǎng)基，涂布土壤菌液，不斷地挑單菌培養(yǎng)，得到以下的真菌單培養(yǎng)菌株（圖7）。

共分離得到9種真菌單菌落（表4），其中球腔菌屬、格孢腔菌屬、擬層孔菌屬、被孢霉屬、Ceratobasidium、毛霉屬各1種，青霉屬3種。其中有一些真菌在其他植物根際土壤中也有發(fā)現(xiàn)，如張海龍等［15］在銀杏根際分離到毛霉屬真菌，顏艷偉等［16］在花生的根際分離到青霉屬真菌等。

圖7 真菌菌落Fig.7 Fungal colonies

表4 杜鵑根際微生物真菌測序結(jié)果Table 4 Sequencing results of fungi in rhododendron rhizospheres

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

云蒙山位于燕山山脈的西南段，主峰海拔1 414 m，土壤為山地棕壤和淋溶褐土，土壤偏酸性。該山的植物種類十分豐富，林木以原始次生林為主，有著91%以上的森林覆蓋率。

根際細菌群落的構(gòu)建尤其依賴于根系-微生物互作體系中信號分子的產(chǎn)生［17］。寄居在根際的細菌多數(shù)對植物是有益的，它們能夠供給植物無機營養(yǎng)，增強植物對氮素的攝入，同時也能保護植物免受病原菌的侵襲［18-20］。因此，根系與微生物的互作效應(yīng)使根際和非根際土壤細菌在組成和結(jié)構(gòu)上產(chǎn)生了顯著差異。本研究表明，杜鵑的根際與非根際土壤中優(yōu)勢菌的種類和數(shù)量均具有一定差異。低海拔迎紅杜鵑和高海拔迎紅杜鵑的根際土壤中，分別具有5個和3個優(yōu)勢菌屬；低海拔迎紅杜鵑和高海拔迎紅杜鵑的非根際土壤中，分別具有8個和9個優(yōu)勢菌屬。說明根際土壤中的菌種組成較非根際穩(wěn)定，這也與其根際的特殊功能相適應(yīng)，而非根際由于其不擔負某一特殊功能，容易受到其他微生物或外來侵入體的干擾，其較高的異質(zhì)性導(dǎo)致其優(yōu)勢菌的組成具有多樣性。低海拔迎紅杜鵑和高海拔迎紅杜鵑的根際土壤中，優(yōu)勢菌屬均來自于變形菌門Proteobacteria和酸桿菌門Acidobacteria，而其對照中還有若干優(yōu)勢菌屬來自于其他菌門，這說明杜鵑根際的特殊環(huán)境決定了其優(yōu)勢菌的定向性。變形菌門類包括很多可以進行固氮的細菌，酸桿菌門有許多對植物殘體降解起到重要作用的菌種，還參與土壤中的鐵循環(huán)，這些特性都與根際微生物幫助寄主同化養(yǎng)分、增強抗逆性相一致［21-22］。

杜鵑根際土壤中的優(yōu)勢菌屬中，已知其功能的有紅游動菌屬Rhodoplanes、諾卡氏菌屬Nocardioides、分枝桿菌屬Mycobacterium、伯克霍爾德氏菌Burkholderia、鏈霉菌屬Streptomyces、鞘氨醇單胞菌屬Sphingomonas和假單胞菌屬Pseudomonas，它們主要屬于變形菌門Proteobacteria、放線菌門Actinobacteria和酸桿菌門Acidobacteria。紅游動菌Rhodoplanes是兼性厭氧光養(yǎng)菌，光照厭氧和黑暗好氧條件下均能很好生長，紅游動菌的存在說明高海拔迎紅杜鵑的根際土壤含氧量適中，通氣性良好，適宜好氧菌的生長。諾卡氏菌Nocardioides主要以好氣性腐生菌為主，少數(shù)為厭氣性寄生菌，能夠分解各種碳水化合物，有的能利用碳氫化合物、纖維素等，根際土壤中的諾卡氏菌同化土壤中的腐殖質(zhì)，為杜鵑生長提供營養(yǎng)物質(zhì)。分枝桿菌屬Mycobacterium又稱抗酸性桿菌屬，這與杜鵑的根際酸性土壤環(huán)境是相一致的。鏈霉菌屬Streptomyces、假單胞菌屬Pseudomonas和鞘氨醇單胞菌屬Sphingomonas有較強分解有機物的能力，可以將多種有機物作為能量來源，樣地中的杜鵑根際土壤腐殖質(zhì)較多，這為杜鵑根際有機物的分解與吸收提供了保證。同時，通過對迎紅杜鵑根際土壤微生物的分離純化及鑒定，得到了11個屬的微生物，真菌7個屬，細菌4個屬，細菌的菌屬數(shù)量遠遠少于通過高通量測序得到的菌屬數(shù)量，原因是自然環(huán)境中99%以上的微生物不可用實驗室純培養(yǎng)的方法獲得［23］，其中芽孢桿菌屬菌株，憑借其較強保濕性、較強的抑菌能力、較強有機質(zhì)分解力產(chǎn)生豐富的代謝生成物等特點，已被廣泛地用于菌劑的生產(chǎn)。試驗中分離鑒定出的真菌大部分為腐生具有分解動植物體殘軀形成有機酸的能力，如青霉屬、擬層孔菌屬、毛霉屬，這有利于根際吸收營養(yǎng)物質(zhì)，促進杜鵑生長。杜鵑非根際土壤中的優(yōu)勢菌屬中，已知其功能的有乳桿菌屬Lactobacillus、弧菌屬Vibrio和脫硫疊球菌屬Desulfosarcina。乳桿菌屬Lactobacillus的分解產(chǎn)物是乳酸，弧菌Vibrio也能分解有機物產(chǎn)酸，它們的這一特性與云蒙山的土質(zhì)偏酸性相一致。脫硫疊球菌屬Desulfosarcina是一種厭氧的微生物，采樣時觀察到非根際土壤的疏松性較差，含氧量較少，它的存在也驗證了這一點。

本研究中相同較低海拔高度的迎紅杜鵑和照白杜鵑根際土壤的細菌多樣性存在一定差異，由香濃多樣性指數(shù)和Chao1豐度估計指數(shù)可知，迎紅杜鵑的根際細菌多樣性大于照白杜鵑，但照白杜鵑根際優(yōu)勢菌屬要多于迎紅杜鵑。在不同的植物根際土壤中，也有過類似的報導(dǎo)，陳林等研究發(fā)現(xiàn)，不同玉米品種根際微生物的活性和群落結(jié)構(gòu)不同［24］；Peiffer等［5］的研究發(fā)現(xiàn)玉米種源對于根際土壤細菌的α多樣性有著重大影響。Bulgarelli等［25］提出的關(guān)于植物根系微生物區(qū)系形成的機理表明，宿主植物種源會主動調(diào)整根面和內(nèi)生菌的生長過程，形成該植物所特有的根系核心微生物區(qū)系。這可能是由于杜鵑不同的種源決定了其根際根系分泌物的不同，而根系分泌物是介導(dǎo)根系-微生物互作關(guān)系的重要媒介，根系分泌物的不同決定了其根際細菌多樣性的差異。本研究中迎紅杜鵑根際土壤取自兩個不同的海拔，通過由香濃多樣性指數(shù)和Chao1豐度估計指數(shù)可知，低海拔迎紅杜鵑的根際細菌多樣性要大于高海拔迎紅杜鵑，且低海拔迎紅杜鵑根際優(yōu)勢菌屬要多于高海拔迎紅杜鵑。它們之間細菌多樣性差異的產(chǎn)生可能主要是由于海拔的不同引起的，說明杜鵑根際細菌的多樣性與植物的物候期有關(guān)系，采樣時正值低海拔迎紅杜鵑的花期，新陳代謝旺盛；高于高海拔迎紅杜鵑還未萌發(fā)新芽，新陳代謝緩慢，這些直接影響到根系對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收。同樣，也有研究表明土壤類型是根際微生物群落結(jié)構(gòu)的決定性因素，而生長階段和種源對根際有一定的調(diào)節(jié)作用［25-26］。

3.2 結(jié)論

北京云蒙山杜鵑根際土壤細菌以變形菌門Proteobacteria、放線菌門Actinobacteria和酸桿菌門Acidobacteria為主；迎紅杜鵑根際與非根際的優(yōu)勢菌屬不完全來自于相同的菌門；照白杜鵑的根際優(yōu)勢菌屬多于迎紅杜鵑，但迎紅杜鵑根際細菌多樣性大于照白杜鵑；低海拔迎紅杜鵑根際細菌多樣性和優(yōu)勢菌屬都大于高海拔迎紅杜鵑。本研究表明，杜鵑的根際與非根際的空間差異、種源差異、生長地的海拔差異都會影響土壤微生物多樣性及其群落結(jié)構(gòu)組成。

總之，杜鵑的根際與非根際的空間差異、種源差異、生長地的海拔差異都會影響土壤微生物多樣性的組成，森林生態(tài)系統(tǒng)極其復(fù)雜，杜鵑根際土壤菌群分布受地形、植被、土壤營養(yǎng)與健康、人類干擾等多種因素影響，以及環(huán)境因素之間的相互影響作用，還有待于進一步的研究。

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（責(zé)任編輯：程智強）

Isolation，identification and diversity analysis of rhododendron rhizospheric m icroorganism

ZHOU Tian-tian1，DING Rong1，CAI Jian-chao1，ZHAO He-wen1，2，3，CUI Jin-teng1，2，3
（1Faculty of Landscaping，Beijing Agricultural College，Beijing 102206，China；2Beijing Laboratory of Urban and Rural Ecological Environment，Beijing 102206，China；
3Beijing Engineering Research Center of Rural Landscape Planning and Design，Beijing 102206，China）

In order to find out the effects of altitude and provenance on rhododendron rhizospheric colony composition，both rhizospheric and non-rhizospheric soils of the only two species ofwild rhododendron in Beijing（Rhododendron mucronulatum and R.micranthum）were sampled at different altitudes，the bacterial and fungal purification and theirmolecular identification weremade，and the soil DNAswere extracted and sequenced by a second-generation high-throughput sequencing.Also the impacts of different factors on the colony composition and abundance were analyzed according to the sampling sites’natural conditions.The results showed that isolating the rhizospheric soils obtained 11 species of bacteria under 5 genera and 9 species of fungi under 7 genera；The R.mucronulatum rhizospheric soils at low and high altitudes had 5 and 3 dominantgenera respectively；The non-rhizospheric soils at low and high altitudes had 8 and 9 dominant genera respectively；The bacterial composition of rhododendron rhizospheric soilswasmore stable than thatof non-rhizospheric soils and the dominantgenera of rhizosphere had a certain directive property；The bacterial diversity of R.mucronulatum rhizosphere was greater than thatof R.micranthum rhizosphere，but the dominant genera of R.mucronulatum rhizosphere were less than those of R.micranthum rhizosphere；Both bacterial diversity and dominantgenera of R.mucronulatum rhizosphere at low altitude were greater than those at high altitude.It was concluded that both altitude and provenancesignificantly influenced the colony composition and abundance of rhododendron rhizosphere，and the bacterial diversity of rhododendron rhizosphere had a relationship with plantphenological phases and was differentbetween different-provenance rhododendrons due to their different root exudates.Compared with the high-throughput sequencing result，the microbial species obtained by isolation was obviously less，which was identical with previous studies.

Rhododendron；Rhizospheric microorganism；Identification；Diversity

S154.3；S685.21

：A

1000-3924（2017）02-063-08

10.15955j.issn1000-3924.2017.02.12

2016-08-08

北京市科技提升計劃（TJSHG201310020020）；北京市屬高等學(xué)校創(chuàng)新團隊建設(shè)項目（IDHT20150503）

周田田（1991—），女，在讀碩士，森林培育專業(yè)。Tel：18811311366，E-mail：1058363745＠qq.com

趙和文Tel：010-80799122，E-mail：zhaohewen6＠sina.com；崔金騰Tel：010-80797210，E-mail：cuijinteng＠163.com