楊清山，張燕，連運(yùn)河，高偉，周麗

（1.天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津300457；2.晨光生物科技集團(tuán)股份有限公司，河北邯鄲057250）

葡萄籽、松樹皮和花生衣提取物中原花青素成分研究

楊清山1，2，張燕1，連運(yùn)河2，高偉2，周麗2

（1.天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津300457；2.晨光生物科技集團(tuán)股份有限公司，河北邯鄲057250）

建立葡萄籽提取物中7種原花青素成分的高效液相色譜測定方法。以該方法對不同品種的葡萄籽、松樹皮和花生衣提取物進(jìn)行測定分析。結(jié)果表明：葡萄籽、松樹皮和花生衣提取物中的原花青素成分種類和含量水平差異較大。不同品種的葡萄籽提取物中原花青素成分種類水平一致，不同品種的花生衣提取物中原花青素成分種類水平也一致，而不同品種的松樹皮提取物中原花青素成分種類差距較大。該方法可以用于簡單快速地區(qū)分葡萄籽提取物、松樹皮提取物和花生衣提取物。

葡萄籽；松樹皮；花生衣；原花青素

原花色素是一大類多酚化合物的總稱，其主要有黃烷醇單體及其聚合體組成，該化合物的共同點均是能夠在酸性條件下加熱分解產(chǎn)生花青素（cyanidins），故將這類多酚化合物命名為原花青素（Proanthocyanidins，簡稱PC）[1]。原花青素在葡萄籽和皮、松樹皮、花生衣、山楂果、刺葵、銀杏葉、荔枝和草莓中廣泛存在[2-7]，但目前研究最多的來源是葡萄籽和葡萄皮中的原花青素[8]。原花青素是由兒茶素或表兒茶素單體按照不同的方式和數(shù)量縮合而成，最簡單的原花青素二聚體是由兒茶素或表兒茶素自身縮合，或者由進(jìn)行縮合，此外單體間還可以再形成三聚體、四聚體、五聚體等直至更多聚體[9]。原花青素具有較高的生理和藥理活性，包括抗氧化、保護(hù)心血管和調(diào)節(jié)免疫活性等，此外還有具有抑制酶活性、抗病毒、抗真菌活性、抗?jié)?、促進(jìn)毛發(fā)生長、保護(hù)皮膚、保護(hù)肝臟、抗腹瀉活性、抗致突變作用和抗抑郁等功效[10]。

松樹皮和花生衣作為原花青素的重要來源，其提取物具有相似的結(jié)構(gòu)，同樣也具備一定的生理和藥理活性，但其功效遠(yuǎn)不及葡萄籽提取物[11-12]。由于松樹皮和花生衣提取物的生產(chǎn)成本較低，近些年來一些不法商販在葡萄籽提取物中以摻入或者以直接代替的方式，以次充好來獲取利益，嚴(yán)重擾亂了葡萄籽提取物的市場。本文建立了一種能夠同時測定葡萄籽提取物中7種原花青素的高效液相色譜方法，并對不同品種的葡萄籽、松樹皮和花生衣提取物進(jìn)行檢測分析。通過對比不同來源提取物中原花青素各個組分及含量情況，可以簡單快速的區(qū)分這3類提取物。該方法為規(guī)范葡萄籽提取物市場及真?zhèn)舞b別提供了技術(shù)手段。

1 材料和方法

1.1 儀器和試劑

Agilent 1260液相色譜儀，配四元泵和紫外檢測器：美國安捷倫科技有限公司；JJ300電子天平：常熟市雙杰測試儀器廠；AUW220D電子天平：河北匯博云?？萍及l(fā)展有限公司；DK-S24電子恒溫水浴鍋：上海森信實驗儀器有限公司；R213B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海申生科技有限公司；FW100高速萬能粉碎機(jī)：天津市泰斯特儀器有限公司；101-0N電熱鼓風(fēng)干燥箱：天津華北試驗儀器有限公司；TG16-WS臺式高速離心機(jī)：湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；TH-300BQ數(shù)控超聲清洗器：濟(jì)寧天華超聲電子儀器有限公司。

沒食子酸（純度89.9%）：購自中國食品藥品檢定研究院；原花青素B1（純度95%）、原花青素B2（純度98%）、EGCG（表沒食子兒茶素沒食子酸酯）（純度98%）、ECG（表兒茶素沒食子酸酯）（純度99%）：購自天津一方科技有限公司；兒茶素（純度98%）：購自上海源葉生物科技有限公司；表兒茶素（純度98%）：購自中國藥品生物制品鑒定所。

乙腈、甲醇（色譜純）：購自安徽時聯(lián)特種溶劑股份有限公司；乙醇、磷酸（分析純）：購自天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司。

葡萄籽（7種）：法國、新疆、河北昌黎、山東、甘肅莫高、新疆白葡萄和西部牧業(yè)，均從市場購買；松樹皮（7種）：樟子松、落葉松、馬尾松、紅松、外國松、沐陽樣品和杭州樣品，均從市場購買；花生（9種）：黑花生8#、魯花11#、豫花C-3000、花育22、四粒紅、小白沙、豐花1#、山東樣品和亳州樣品，均從市場購買。

樹脂：大孔吸附樹脂（型號LXA-8），由西安藍(lán)曉科技有限公司提供。

1.2 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18柱（4.6×150 mm，5 μm）；波長：278 nm；色譜柱溫度：40℃；進(jìn)樣量：5 μL；運(yùn)行時間：29 min；流速：1.2 mL/min。

流動相：乙腈（A）-0.3%磷酸水（B）。梯度條件：0 min：10%A；15 min：18%A；23 min：60%A；24 min：10%A；29 min：10%A。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)儲備液

分別準(zhǔn)確稱取沒食子酸、原花青素B1、兒茶素、原花青素B2、表兒茶素、EGCG（表沒食子兒茶素沒食子酸酯）和ECG（表兒茶素沒食子酸酯）對照品10 mg左右，置于同一個25 mL棕色容量瓶中，用色譜級甲醇定容，超聲溶解，搖勻，轉(zhuǎn)移至專用標(biāo)準(zhǔn)液瓶中，作為儲備液，濃度為0.4 mg/mL。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)工作液

將儲備液做2倍梯度稀釋，得到5個濃度水平的工作液，分別為0.2、0.1、0.05、0.025 mg/mL，做標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定線性范圍。移取5 mL儲備溶液至于25 mL棕色容量瓶中，用色譜級甲醇定容，搖勻，轉(zhuǎn)移至專用標(biāo)準(zhǔn)液瓶中，作為工作液，濃度為0.08 mg/mL。

1.4 樣品溶液的制備

1.4.1 樣品預(yù)處理

1）葡萄籽：用萬能粉碎機(jī)將樣品粉碎，粉碎細(xì)度為20目通過率80%以上。最后將葡萄籽粉混合均勻，備用。

2）松樹皮：將樣品用剪刀剪成1 cm左右小塊，置于40℃干燥箱中進(jìn)行干燥處理。最終烘至水分在15%以下，然后用萬能粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，粉碎細(xì)度為20目通過率80%以上。最后將松樹皮粉混合均勻，備用。

3）花生：先將花生進(jìn)行去殼處理，再將花生果實置于40℃干燥箱中進(jìn)行干燥處理。烘至可以脫皮為止。用手進(jìn)行揉搓脫皮處理，將脫下的皮（花生衣）用萬能粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，粉碎細(xì)度為20目通過率80%以上。最后將花生衣粉混合均勻，備用。

1.4.2 提取物制備

1）萃取：取1.4.1制備好的各個樣品150 g，用紗布包好后置于1 000 mL燒杯中，用含有0.5 g/100 mL磷酸的50%乙醇（體積分?jǐn)?shù)）溶液進(jìn)行萃取。萃取溫度65℃，萃取3遍，萃取溶劑料液比分別為1∶5、1∶3和1∶2（g/mL），時間分別為3、2、1 h，合并萃取液。

2）純化：將萃取液濃縮至干，加入2.5 L純凈水溶解，冷卻至室溫，離心（4 000 r/min，10 min），取離心上清液上大孔吸附樹脂柱（LXA-8）進(jìn)行吸附，流速1 BV/h。使用0.5 L純凈水清洗，流速1.5 BV/h～2 BV/h。最后用0.5 L70%乙醇（體積分?jǐn)?shù)）溶劑進(jìn)行解吸，流速1 BV/h。

3）干燥：將收集的解吸液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至水分5%以下，得到提取物粗品，再將粗品研磨成粉末，細(xì)度為60目通過率90%以上，得到各個樣品的提取物成品，待分析測試用。

1.4.3 供試樣品液制備

稱取0.100 0 g左右樣品，用50%乙醇稀釋定容至10 mL容量瓶中，超聲溶解，搖勻，恢復(fù)至室溫，過0.45 μm濾膜，待測。

2 結(jié)果與分析

2.1 液相色譜條件優(yōu)化

2.1.1 色譜柱選擇

根據(jù)原花青素成分的特點，結(jié)合文獻(xiàn)方法信息，保存能力較強(qiáng)的反相色譜柱（C18）能夠滿足使用要求。不同品牌、型號、粒徑和長度的色譜柱，對原花青素的保留能力和分離能力也不同。通過對實驗室現(xiàn)有的色譜柱資源進(jìn)行篩選和試驗分離，最終確定色譜柱的規(guī)格型號為：Agilent ZORBAX SB-C18柱（4.6× 150 mm，5 μm）。

2.1.2 進(jìn)樣量優(yōu)化

進(jìn)樣量太大會在色譜柱中產(chǎn)生溶劑效應(yīng)，造成色譜峰分離效果和峰形變差；進(jìn)樣量太小會造成儀器檢測的穩(wěn)定性變差，且靈敏度也會變低。通過調(diào)整不同的進(jìn)樣量進(jìn)行試驗驗證，最終確定進(jìn)樣量參數(shù)為：5 μL。

2.1.3 其他條件優(yōu)化

參考的葡萄籽提取物中兒茶素和表兒茶素檢測方法運(yùn)行時間達(dá)到90 min，不能夠滿足大量樣品的快速檢測。通過對流速、柱溫、流動相成分及梯度條件進(jìn)行調(diào)整，最終確定各項參數(shù)條件為：流速1.2 mL/min；柱溫40℃；流動相乙腈（A）-0.3%磷酸水（B）；梯度條件0 min（10%A），15 min（18%A），23 min（60%A），24 min（10%A），29 min（10%A）。該條件能夠?qū)崿F(xiàn)葡萄籽中各種原花青素在30 min內(nèi)實現(xiàn)分離。

2.2 色譜圖及保留時間

按照優(yōu)化后液相條件，分別檢測標(biāo)準(zhǔn)工作液和葡萄籽提取物樣品，得到色譜圖和保留時間見圖1和表1。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

按照試驗方案操作方式，將標(biāo)樣依次做梯度稀釋配制成標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液，按照確定的色譜條件進(jìn)樣檢測。采用外標(biāo)法，以峰面積為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，得到7種原花青素成分的回歸方程和相關(guān)系數(shù)。按照S/N=3確定各種成分的檢出限。試驗結(jié)論如下：

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品HPLC色譜圖Fig.1 The HPLC chromotogram of standards

表1 標(biāo)準(zhǔn)品保留時間Table 1 The retention time of standards

標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍：沒食子酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y= 13 558x-7.338，R2=1.000 0，在0.011 mg/mL～0.183 mg/mL范圍內(nèi)，對照品質(zhì)量濃度與峰面積呈良好線性關(guān)系；原花青素B1的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=3 142.4x-0.588，R2= 1.000 0，在0.003 mg/mL～0.051 mg/mL范圍內(nèi)，對照品質(zhì)量濃度與峰面積呈良好線性關(guān)系；兒茶素的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=3 250.7x-1.071，R2=1.000 0，在0.008 mg/mL～0.125 mg/mL范圍內(nèi)，對照品質(zhì)量濃度與峰面積呈良好線性關(guān)系；原花青素B2的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=3 097.0x-0.738，R2=1.000 0，在0.004 mg/mL～0.061 mg/mL范圍內(nèi)，對照品質(zhì)量濃度與峰面積呈良好線性關(guān)系；表兒茶素的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=3 219.0x-2.371，R2=1.000 0，在0.017 mg/mL～0.278 mg/mL范圍內(nèi)，對照品質(zhì)量濃度與峰面積呈良好線性關(guān)系；表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=5 987.2x-5.454，R2=1.000 0，在0.012 mg/mL～0.186 mg/mL范圍內(nèi)，對照品質(zhì)量濃度與峰面積呈良好線性關(guān)系；表兒茶素沒食子酸酯（ECG）的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=8 257.6x-8.463，R2=1.000 0，在0.020 mg/mL～0.317 mg/mL范圍內(nèi)，對照品質(zhì)量濃度與峰面積呈良好線性關(guān)系。

檢出限：沒食子酸0.04mg/L；原花青素B10.28mg/L；兒茶素0.28 mg/L；原花青素B2 0.28 mg/L；表兒茶素0.36 mg/L；表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）0.33 mg/L；表兒茶素沒食子酸酯（ECG）0.17 mg/L。

2.4 精密度驗證

將同一瓶標(biāo)準(zhǔn)工作液重復(fù)進(jìn)樣檢測6次，計算其峰面積的RSD，驗證檢測的精密度情況。試驗結(jié)果表明標(biāo)樣檢測精密度良好，RSD均在1%以內(nèi)，試驗數(shù)據(jù)見表2。

表2 標(biāo)樣檢測精密度試驗Table 2 The precision test of standards

2.5 回收率驗證

選擇已知濃度的樣品液，分別添加3個不同濃度水平的標(biāo)準(zhǔn)混合工作液，做加標(biāo)回收率驗證試驗，驗證檢測的準(zhǔn)確性?；厥章?%=測得值/（原有值+加標(biāo)值）×100試驗表明，加標(biāo)回收率均在在85%～110%之間，平均回收率為99.02%，檢測準(zhǔn)確性良好。試驗數(shù)據(jù)見表3。

表3 樣品加標(biāo)回收率試驗數(shù)據(jù)Table 3 The recovery test of samples

2.6 精密度驗證

按照確定的樣品處理方法，選擇4份葡萄籽提取物樣品，分別做日間檢測重復(fù)性試驗，驗證檢測結(jié)果的精密度。驗證結(jié)果為：葡萄籽提取物中各個原花青素檢測的RSD均在5%以內(nèi)，符合分析方法要求。試驗數(shù)據(jù)見表4。

表4 樣品檢測精密度試驗Table 4 The precision test of samples

2.7 葡萄籽、松樹皮和花生衣提取物樣品檢測結(jié)果

將1.4.2制備的各個提取物樣品按照1.4.3制備出供試樣品液，按照1.2儀器條件進(jìn)行檢測，得到各個提取物中的7種有效成分檢測結(jié)果見表5、表6和表7。

表5 葡萄籽提取物中7種成分檢測結(jié)果Table 5 The test of seven components in grape extract

表6 松樹皮提取物中7種成分檢測結(jié)果Table 6 The test of seven components in pine bark extract

表7 花生衣提取物中7種成分檢測結(jié)果Table 7 The test of seven components in peanut coat extract

結(jié)果分析：不同品種葡萄籽提取物中的原花青素種類較一致，但含量水平有所差異，其中原花青素B1、兒茶素、原花青素B2和表兒茶素的含量相比較高，平均超出1%含量水平；不同品種松樹皮提取物中的原花青素種類和含量水平均差異較大，其中原花青素B1、兒茶素和表兒茶素沒食子酸酯（ECG）的含量相比較高，個別品種的特定成分含量超出了1%水平；不同品種花生衣提取物中的原花青素種類較一致，但含量水平也有所差異，其中兒茶素、原花青素B2和表兒茶素的含量相比較高，除黑花生8#和魯花11#外均超出了1%含量水平。

從整體來看，不同類型提取物中的各個成分含量存在明顯差異，同一類型不同品種的葡萄籽、花生衣、松樹皮提取物中各成分含量也存在部分差異?；ㄉ潞退蓸淦ぬ崛∥镏袔缀鯖]有沒食子酸成分，且原花青素B1、兒茶素和原花青素B2含量明顯低于葡萄籽提取物，松樹皮提取物中表兒茶素沒食子酸酯（ECG）含量高于葡萄籽和花生衣提取物。

3 結(jié)論

本試驗確定了一種簡單、快速并能準(zhǔn)確測定葡萄籽提取物中7種原花青素的高效液相色譜方法，能夠為葡萄籽提取物的質(zhì)量評價方式提供技術(shù)支持。一方面可以通過總含量的高低，判斷產(chǎn)品質(zhì)量的高低；另一方面可以從各個分成分含量水平的高低，評價差異化的產(chǎn)品特性。以此方法分別對不同品種的葡萄籽、松樹皮和花生衣提取物中的原花青素進(jìn)行檢測，通過對比原花青素的種類和含量高低，可以區(qū)分這3類原花青素，以此可以鑒別這3類原花青素。該方法只能從已知的7種原花青素的定性和定量結(jié)果進(jìn)行鑒別分析，對于如何從松樹皮提取物或花生衣提取物中找到其特有的成分進(jìn)行分析，以實現(xiàn)更簡單和更準(zhǔn)確的鑒別，需要其他學(xué)者做進(jìn)一步研究。

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Research of Procyanidins in Grape Seed，Pine Bark and Peanut Coat Extract

YANG Qing-shan1，2，ZHANG Yan1，LIAN Yun-he2，GAO Wei2，ZHOU Li2
（1.College of Food Engineering and Biotechnology，Tianjin University of Science&Technology，Tianjin 300457，China；2.Chenguang Biotech Group Co.，Ltd.，Handan 057250，Hebei，China）

A high performance liquid chromatographic method was established for determining 7 kinds of procyanidins component in grape seed extract.Based on this method，different varieties of grape seed extract，pine bark and peanuts coat extract were analyzed.The results showed that：there was great difference in procyanidins omponent types and levels among grape seed extract，pine bark and peanuts coat extract.Different varieties of grape seed extract had similar procyanidins component types，and different varieties of peanuts coat extract had similar procyanidins component types too.But different varieties of pine bark extract had different procyanidins component types.Due to this method，it can be distinguished grape seed extract，pine bark and peanuts coat extract easily and quickly.

grape seed；pine bark；peanut coat；procyanidins

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.10.037

2016-08-16

楊清山（1985—），男（漢），工程師，學(xué)士，研究方向：食品分析和檢測。